CN1844390A

CN1844390A - 鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

Info

Publication number: CN1844390A
Application number: CN 200610039666
Authority: CN
Inventors: 张双全; 管政兵
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2006-04-19
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2026-04-19
Also published as: CN100404680C

Abstract

鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。鸭B淋巴细胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下：根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物；从鸭脾脏提取总RNA；通过RT－PCR方法，扩增出一段cDNA，命名为P1，克隆入pMD18－T载体，测序；应用cDNA末端快速扩增方法，根据P1的序列设计正义引物及反义引物分别用以扩增出上述cDNA 3’－及5’－全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，分别克隆入pMD18－T载体，并测序；将P1、P2、P3拼接出cDNA全长序列，并设计首尾引物一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18－T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述鸭B淋巴细胞刺激因子的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组duck BAFF，作为鸭类免疫增强剂。

Description

鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、表达技术。

背景技术

人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。BAFF具有很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞,BAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表达，延长休眠B细胞的寿命。体内它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。BAFF-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失。BAFF刺激B细胞增殖、分化并分泌抗体，成熟的B细胞及其产生的抗体构成了机体抵御感染和抑制肿瘤滋生的关键组分。由于BAFF的免疫增强特异活性，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国FDA已正式批准重组人BAFF进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症(CVID)患者。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前只有人、鼠、鸡的BAFF cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别是AF116456、AF119383及AF506010。鸭B淋巴细胞刺激因子(duBAFF)cDNA还未被克隆出来，关于鸭BAFF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。鸭是十分重要的禽类，由于B淋巴细胞刺激因子(BAFF)具有较强的免疫增强能力，基因工程鸭BAFF蛋白有可能开发成一种能增强鸭类免疫能力的生物制剂，用于体质弱、免疫功能低下的病鸭，增加鸭类抗病毒能力，尤其是在禽流感对人类已构成威胁的今天。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的禽类细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗禽类疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组duck BAFF蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。同时，B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是新发现的免疫系统重要调控因子，对鸭BAFF的研究有助于探索鸭类的免疫调控机制，推动其免疫系统研究的发展。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从鸭提取的B淋巴细胞刺激因子cDNA，并提供B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组技术。

本发明从鸭中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

鸭B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

(1)根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物：

正义寡核苷酸兼并引物du1：5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C)

反义寡核苷酸兼并引物du2：5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C)

(2)从鸭脾脏提取总RNA，

(3)通过RT-PCR方法，以上述引物du1及du2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定，

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP2(5’-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3’)及反义引物GSP1(5’-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3’)分别用以扩增出上述cDNA3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定；

(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL1(5’-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3’)及FL2(5’-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3’)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。

上述鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下：

(1)根据B淋巴细胞刺激因子全长cDNA两段高保守区域设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物du1(5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C))与反义寡核苷酸兼并引物du2(5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C))，

(2)应用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手册，提取出鸭脾脏细胞的总RNA，

(3)应用RT-PCR方法，以上述du1及du2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全长为408bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-CR的反应条件为：以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO₄2μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：48℃逆转录45min，94℃变性2min，再进行40个PCR循环(94℃变性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最后于68℃延伸7min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约408bp的DNA条带，置4℃保存。

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit(Clontech公司)根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP2(5’-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3’)及反义引物GSP1(5’-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3’)分别用以扩增出上述cDNA3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(642bp)及P3(697bp)，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。

(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出全长序列，并设计首尾引物FL1(5’-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3’)及FL2(5’-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3’)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定。

将所得序列与GenBank数据库序列进行相似性搜索，发现与已知的鸡、人、鼠BAFF序列相似率最高，分别是91％、53％、50％，可以确定该序列是鸭B淋巴细胞刺激因子(duBAFF)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO.1所示。

对该基因的进一步研究表明：该基因主要表达在鸭类免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾脏及胸腺。其中法氏腔上囊表达水平最高，脾脏次之，胸腺最低；该基因的重组融合蛋白具有dsBAFF的高活性功能；该基因编码的蛋白对鸭B淋巴细胞具有明显的促存活/增殖效应；对人及鼠的B淋巴细胞都具有促存活/增殖的生物学功能；充分表明本发明克隆得到的基因就是鸭B淋巴细胞刺激因子(duBAFF)的cDNA。

上述鸭B淋巴细胞刺激因子(duBAFF)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法，生产重组duck BAFF，作为鸭类免疫增强剂。

所说的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入鸭体内，增加其免疫力，在饲养中应用。

附图说明

图1是duck BAFF全长cDNA的克隆过程示意图；其中P1代表同源克隆片段；P2代表3’-RACE产物；P3代表5’-RACE产物；箭头代表引物位置；全长cDNA共1311bp。

图2是duck BAFF全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。AATAAA代表多聚腺苷酸加尾信号；ATTTA代表转录不稳定序列。

图3是duck BAFF与鸡、人、鼠BAFF全长氨基酸序列同源性比较图。其中阴影代表保守的氨基酸；箭头所指代表弗林蛋白酶识别位点，切割后的C端为BAFF的胞外可溶功能区。

图4是duck BAFF mRNA在各组织中的表达水平分析图。β-actin作为内参。

图5是融合蛋白NusA-His-dsBAFF在BL21(DE3)中的诱导表达，Ni⁺柱纯化的SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，A图中条带1是未经IPTG诱导的全菌蛋白，2是经IPTG诱导5小时后的全菌蛋白，3是经Ni+柱纯化后目的蛋白；B图是鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，在目的蛋白位置出现了特异性条带。

图6是本发明克隆的基因对鸭B淋巴细胞的促存活作用结果示意图。图A是说明不同浓度的NusA-His-dsBAFF相对于对照NusA-His、His-TRAIL及PBS在作用鸭B淋巴细胞48小时后，对鸭B淋巴细胞可见显著的促存活作用，且呈剂量依赖效应；图B是说明固定浓度的NusA-His-dsBAFF相对于对照NusA-His及PBS分别在作用鸭B淋巴细胞24/48/72小时后的鸭B淋巴细胞存活数量比较情况。

图7是duck BAFF具有对人及鼠B淋巴细胞的促增殖生物学功能。图A是说明不同浓度的NusA-His-dsBAFF对人B淋巴细胞的共刺激增殖作用；图B是说明不同浓度的NusA-His-dsBAFF对鼠B淋巴细胞的共刺激增殖作用；anti-IgM是共刺激因子。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

鸭(Anas Platyrhynchos)，人工饲养。

(1)引物设计：应用ClustalX软件对已克隆出的人、鼠、鸡B淋巴细胞刺激因子全长cDNA序列进行同源性比对分析，精心选取出两段高保守区域用来设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物du1(5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C))与反义寡核苷酸兼并引物du2(5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C))，

(2)提取总RNA：应用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)按照其操作手册提取出约0.5克鸭脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。

(3)应用RT-PCR方法，以上述du1及du2为特异性引物，扩增出duck BAFF cDNA的一段序列，全长为408bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为：以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO₄2μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：48℃逆转录45min，94℃变性2min，再进行40个PCR循环(94℃变性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最后于68℃延伸7min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约408bp的DNA条带，置4℃保存。

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit(Clontech公司)根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP2及反义引物GSP1分别用以扩增出duck BAFFcDNA3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(642bp)及P3(697bp)，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。操作按照试剂盒操作手册要求进行。

(5)如图1所示，根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出duck BAFF cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL1及FL2一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，得到如图2所示的duck BAFF全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。

(6)同源检索：将所得序列向 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析，如图3所示，发现与已知的鸡(GenBank登录号AF506010)、人(GenBank登录号AF116456)、鼠(GenBank登录号AF119383)BAFF氨基酸序列相似性最高(不包括其他种属BAFF的预测氨基酸序列)，分别是91％、53％、50％，可以确定该序列是鸭B淋巴细胞刺激因子(duBAFF)的全长cDNA。并且其开放阅读框具有SEQ ID NO.1序列，碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

duck BAFF基因在各组织的表达水平分析

采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了鸭肝(liver)、肾(kidney)、胸腺(thymus)、腔上囊(bursa)、脾(spleen)、心(heat)及脑(brain)的总RNA，运用半定量RT-PCR法对duck BAFF基因在各组织的表达水平进行了研究，结果如图4所示，duckBAFF基因主要表达在鸭类免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾脏及胸腺；其中法氏腔上囊表达水平最高，脾脏次之，胸腺最低。试验中鸭β-actin作为内参，采用的引物为chβ1(5’-ATGGCTCCGGTATGTGCAAGG-3’)和chβ2(5’-AGCTTCTCCTTGATGTCACGC-3’)。RT-PCR体系如实施例1。

可溶性duck RAFF重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

以实施例1得到的duck BAFF全长cDNA为模板，设计引物sdu1(5’-TCAGGACCGCGGGTTCTGCCGTCCACACAGAAG-3’(SacII))及sdu2(5’-ACTGAGCCCGGGTCAGAAGAGTCTGACGGCACCA-3’(SmaI))扩增出duck BAFFcDNA胞外可溶区段(dsBAFF)，引物分别引入酶切位点SacII及SmaI，亚克隆入pET43.1a载体，构建成重组载体pET43.1a-dsBAFF。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，胞浆内可高可溶性表达出目的蛋白NusA-His-dsBAFF，此融合蛋白经促存活与增殖试验(图7)，活性检测证实具有dsBAFF的高活性功能，NusA-His标签不影响目的蛋白活性。

重组目的蛋白的的Ni+亲和纯化

IPTG诱导含有重组载体pET43.1a-dsBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)5小时后，4℃收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，4℃，13,000×g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni⁺-NTA柱。简要过程是：3体积BindingBuffer平衡Ni⁺-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6体积Wash Buffer(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗去未结合上Ni⁺-NTA柱的杂蛋白，最后6体积Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱目的蛋白，PBS透析除盐，以SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并以紫外分光光度计检测蛋白浓度，如图5(A，条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达95％的活性目的蛋白。

western 印迹分析

Western-blot中所用一抗为羊抗His₆，二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。其简要步骤是：将诱导的产物先行SDS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与抗His₆单抗孵育1h，与HRP标记的鼠抗羊IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图5(B)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。

duck BAFF对鸭法氏腔上囊B淋巴细胞促存活作用实验

采用淋巴细胞分离液常规无菌分离鸭法氏腔上囊淋巴细胞(约98％为B淋巴细胞)，用RPMI1640调节细胞密度至5×10⁷个/mL.将B细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl。向每孔内加入不同浓度的NusA-His-dsBAFF/NusA-His6/His-TRAIL，37℃，5％CO₂培养72h后每孔加入10μl 5mg/mLMTT，37℃，5％CO₂继续培养5h，加入100μl SDS-HCl溶解沉淀物，37℃过夜，测定各孔OD₅₇₀值.实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。在体外通过MTT细胞毒试验检测duck BAFF对鸭B淋巴细胞的促存活作用，如图6所示，结果表明本发明克隆得到的duck BAFF对鸭B淋巴细胞具有明显的促存活效应，与鸡、人、鼠BAFF的生物学功能相同，且呈现剂量依赖效应，即当NusA-His-dsBAFF为8μg/ml时duck BAFF的促增殖作用最强。同时，固定浓度的NusA-His-dsBAFF相对于对照NusA-His及PBS分别在作用鸭B淋巴细胞24/48/72小时后，可观察到72小时时对鸭B淋巴细胞的促存活效应最明显。

duck BAFF和anti-IgM共刺激人鼠B淋巴细胞增殖

采用抗体磁珠无菌分离健康人外周血B淋巴细胞及BALB/c小鼠脾脏B淋巴细胞，在体外通过MTT细胞毒试验检测duck BAFF对人外周血B淋巴细胞(抗人IgM预刺激后)的促增殖作用及对小鼠脾脏B淋巴细胞(抗鼠IgM预刺激后)的促增殖作用，方法同上，结果如图7所示，表明本发明克隆得到的duck BAFF对人及鼠的B淋巴细胞都具有促增殖的生物学功能，且呈现剂量依赖效应，饱和浓度分别为12μg/ml和14μg/ml，进一步证实了BAFF在生物体内生物学功能的保守性。

实施例3：

将实施例1获得的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，生产重组duckBAFF，作为鸭类免疫增强剂。

实施例4：

将实施例1获得的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入鸭体内，增加其免疫力，在饲养中应用。

按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰鸭B淋巴细胞刺激因子基因并用于所述研究和生产。

SEQUENCE LISTING

<110>南京师范大学

<120>鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

<160>2

<210>1

<211>867

<212>cDNA

<213>鸭(Anas Platyrhynchos)

<400>1

atgaaatccg tggactgtgt gcacgtcatc caacagaagg ataccgcctc ctctccctct 60

gccccccctg gtgctgcttc aggcaccacg ggactttttc ctgtcacatt cctgtggctt 120

gcaatgctcc tgtcctcttg tcttgcagca gtgtctcttt accatgttct caccctgaaa 180

acagagctag aagctctgcg ccacgagctg atctacaggg tccaggcaag gtctccacta 240

gagcggcgag ccgtctcccc tgatgacgag aaagcaggtg cccctgtttc ttccttcctg 300

caagcctctg cagctggtgc caggcaggag aacgagcttc ctggccctag cccagctgaa 360

agtttccaaa aggaaatctc gaacgggagc agaaacaggg ggagaaggtc tgccgtccac 420

acagaagaaa cagtgctaca ggcctgcttg caactcatcg ctgacagcaa aagtgatatc 480

caacagaaag atgattcaag cattgtccct tggcttctga gctttaaacg tggaacagct 540

ctggaagaac atggaaataa aatagtgatc aaagaaacag gatatttttt catatatggc 600

caggttttat atacagatac aacatttgct atgggacatc taatacagag gaagaaggcc 660

cacgtgtttg gtgatgatct gagcttggtg acattatttc gctgcatcca aaatatgcca 720

cagtcttatc cgaataattc ttgctatacc gctggcattg caaaattaga agaaggggac 780

gaacttcaac ttacaatacc acgaagacga gccaaaatat ccttggatgg cgatggtact 840

ttttttggtg ccgtcagact cttctga 867

<210>2

<211>288

<212>PRT

<213>鸭(Anas Platyrhynchos)

<400>2

Met Lys Ser Val Asp Cys Val His Val Ile Gln Gln Lys Asp Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ser Pro Ser Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Gly Thr Thr

20 25 30

Gly Leu Phe Pro Val Thr Phe Leu Trp Leu Ala Met Leu Leu Ser

35 40 45

Ser Cys Leu Ala Ala Val Ser Leu Tyr His Val Leu Thr Leu Lys

50 55 60

Thr Glu Leu Glu Ala Leu Arg His Glu Leu Ile Tyr Arg Val Gln

65 70 75

Ala Arg Ser Pro Leu Glu Arg Arg Ala Val Ser Pro Asp Asp Gln

80 85 90

Lys Ala Gly Ala Pro Val Ser Ser Phe Leu Gln Ala Ser Ala Ala

95 100 105

Gly Ala Arg Gln Glu Asn Glu Leu Pro Gly Pro Ser Pro Ala Glu

110 115 120

Ser Phe Gln Lys Glu Ile Ser Asn Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg

125 130 135

Arg Ser Ala Val His Thr Glu Glu Thr Val Leu Gln Ala Cys Leu

140 145 150

Gln Leu Ile Ala Asp Ser Lys Ser Asp Ile Gln Gln Lys Asp Asp

155 160 165

Ser Ser Ile Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Thr Ala

170 175 180

Leu Glu Glu His Gly Asn Lys Ile Val Ile Lys Glu Thr Gly Tyr

185 190 195

Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala

200 205 210

Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Ala His Val Phe Gly Asp

215 220 225

Asp Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro

230 235 240

Gln Ser Tyr Pro Asn Asn Ser Cys Thr Thr Ala Gly Ile Ala Lys

245 250 255

Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Thr Ile Pro Arg Arg Arg

260 265 270

Ala Lys Ile Ser Leu Asp Gly Asp Gly Thr Phe Phe Gly Ala Val

275 280 285

Arg Leu Phe

288

Claims

1、鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2、一种权利要求1所述的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

(1)根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物：

正义寡核苷酸兼并引物du1：5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’，反义寡核苷酸兼并引物du2：5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’，其中N为A、T、G或C；

(2)从鸭脾脏提取总RNA，

(4)应用cDNA末端快速扩增方法，根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP25’-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3’及反义引物GSP 15’-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3’分别用以扩增出上述cDNA 3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定；

(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL15’-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3’及FL25’-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3’一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。

3、一种权利要求1所述的鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基因工程方法，生产重组鸭B淋巴细胞刺激因子，作为鸭类免疫增强剂。

4、鸭B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的序列。