CN1237172C - 亚非马蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种亚非马蜂蜂毒镇静肽前体(Preprosecapin)基因序列及其编码的多肽和该基因经过翻译后加工产物镇静肽(Secapin)的制备方法。该cDNA序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的一个同系物，它与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列编码-具有SEQ ID No.6所示序列的多肽。此外，还提出了含亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的载体、宿主细胞，与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因相关的抗体，具有蛋白活性亚非马蜂蜂毒Secapin的多肽、相关抗体的制备方法。本发明为进一步研究Secapin相关的多肽活性分子机理，开发与Secapin相关的生物医药、诊断试剂及生物试剂打下了基础。

Description

亚非马蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法

                         技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的蜂毒基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及亚非马蜂蜂毒镇静肽前体(Preprosecapin)基因的cDNA序列，该cDNA序列编码的多肽是意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽经过翻译后加工所得到的多肽(成熟肽)是意大利蜜蜂镇静肽(Secapin)的同系物。本发明还涉及有该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。

                         背景技术

意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒镇静肽(Bee venomous Secapin)是意大利蜜蜂蜂毒的四个多肽之一，约占蜂毒干重的1％，由25个氨基酸组成( Eur. J.Biochem.1978，83：405-410； Abstr.15 Eur.Pepetide.Symp.1978，p84)。按来源和生化性质，它属碱性多肽，Secapin其生物活性与溶血肽相似，具有消炎、抗菌、降压、镇静等作用( Eur.J.Biochem.1978，83：405-410)。

1984，Vlask和Kreil将意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位点，用³²P标记的cDNA探针筛选出阳性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亚隆到PUC8，得到了蜂毒Preprosecapin基因，对该基因的测序结果进行氨基酸序列推导，获77个氨基酸残基，其中最后25个氨基酸残基与已知Secapin氨基酸序列一致，前32个氨基酸残基为信号肽，中间20个氨基酸为极性肽前体，Preprosecapin基因经过翻译后加工，即在蜜蜂的毒囊中经过蜜蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin( Eur.J.Biochem.1984，145：279～242.)。Secapin与其他几种蜂毒多肽在医学与生物物理学上有重要的应用价值。

                         发明内容

本发明目的之一是提供一种亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的一个同系物，该前体蛋白经加工后得到的活性多肽为意大利蜜蜂Secapin多肽的一个同系物。

本发明目的之二是提供一种新的意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽为亚非马蜂Preprosecapin蛋白。

本发明目的还提供了这种制备亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸探针、含亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。

在本发明，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列。

在本发明还提供了一种分离的亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白活性多肽，它包括：具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。

本发明还提供了一种制备具有亚非马蜂蜂毒Secapin活性多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成亚非马蜂蜂毒Preprosecapin表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达亚非马蜂蜂毒Preproecapin蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白活性的多肽。

本发明发现了一种编码亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白基因，该基因所编码的Preprosecapin多肽(亚非马蜂蜂毒镇静肽前体)经过胡蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin，此活性多肽是一种生物活性物质，可应用于医学上的关节炎、神经性疾病、吸毒等的辅助治疗，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂的制备，可作为生物学研究的工具酶。亚非马蜂Preprosecapin基因可为研究亚非马蜂蜂毒免疫的分子机理，为开发利用亚非马蜂蜂毒资源提供新的依据。

                       具体实施方式

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为234个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.5，开放读框位于1～234位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.5中1～234位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.5序列的编码框1～234位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin相同功能的蛋白的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白多肽”指具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白活性的SEQ ID No.6序列53-77的多肽。该术语还包括具有与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白相同功能的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽的可溶性片段。

发明还提供亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽编码序列的8～100个，较佳地1～50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸分子。

本发明还包括检测亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于亚非马蜂蜂毒Preprosecapin多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对亚非马蜂蜂毒Preprosecapin或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或片段。较佳地，指那些能与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的分子，也包括那些并不影响亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自亚非马蜂的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达亚非马蜂蜂毒Preprosecapin或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol，6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol，6：292，1976；Hammerling等人，I n Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断亚非马蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗体以及不影响亚非马蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

在本发明的一个实施例中，亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以亚非马蜂毒腺和毒囊总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物-A：5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’为正向向引物，寡核苷酸B：5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.5的全长cDNA序列。

亚非马蜂蜂毒Preprosecapin为亚非马蜂毒腺表达的蛋白，本发明的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin为研究亚非马蜂蜂毒相关的分子机理提供了基础。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1，亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA的克隆和测定

1.引物扩增

以亚非马蜂毒腺、毒囊总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物-A：5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ IDNo.1)为正向引物，寡核苷酸B：5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为94℃1分钟，随之以94℃40秒钟，54℃40秒钟和72℃60秒钟进行35个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测得到约250bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将上述PCR扩增产物A/B与pGEM^-T Easy载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM109，用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0。测序试剂盒(Epicentre Teclnologies)对抽提的质粒进行测序，获得cDNA序列，全长共234bp，详细序列见SEQ ID No.5，其中开放读框位于1～234位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的氨基酸序列，共77个氨基酸残基(包括25个氨基酸的成熟肽、32个氨基酸的信号肽和20个氨基酸的前体肽)，其氨基酸序列详见SEQ ID No.6。

实施例2，同源比较

用本发明的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin有显著的同源性。用Blast软件分析可以看出，它们蛋白的同源性为93％(见附表1)。因此，可以推测本发明的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白为意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的同系物，并具有类似的功能。

1984，Vlask和Kreil将意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位点，用³²P标记的cDNA探针筛选出阳性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亚隆到PUC8，对测序结果进行氨基酸序列推导，获得了编码意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的新基因。该cDNA所编码的Preprosecapin成熟肽Secapin、信号肽和前原肽为77个氨基酸残基。Secapin和另外的几种蜂毒肽混合物，目前在医学上应用于心血管、支气管、肿瘤等辅助治疗的生物活性物质，也是一类抗菌抗辐射生物活性物质。另外Secapin和另外的几种蜂毒肽还是一类提高人免疫功能的生物活性物质。本发明人的亚非马蜂Preprosecapin基因为研究亚非马蜂蜂毒过敏、免疫的分子机理，为开发利用亚非马蜂蜂毒资源提供了新的依据。

实施例3，亚非马蜂蜂毒Preprosecapin成熟肽Secapin在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹野蛾细胞株)中的表达

在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ ID No.1)，该引物含有Xhol I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是起始密码子开始的亚非马蜂蜂毒Preprosecapin编码序列的24个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)，该引物含有Hind III限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的部分编码序列。

引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastHTb上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Gm^r)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用Xhol I和Hind III消化pBacFastHTa载体及插入片段，随后用连结混合物转化E.coli TG I菌株，在含有Amp^r和Gm^r的LB培养皿上筛选转化子，补加Amp^r和Gm^r的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化E.coli DH10Bac菌株，在含有Amp^r、Gm^r、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp^r、Gm^r、四环素的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose 2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。

质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液为平衡液及洗脱液，蛋白液用经预平衡的Ni²⁺ Sepharose 6B柱过柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去杂蛋白，专一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.SmM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液进行洗脱.然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为2.8KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。

实施例4，亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的成熟肽Secapin在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以SEQ ID No.5中的核苷酸1～234位的核苷酸杂交

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-GGATCCTTACATTATTGATGTTCCT-3’(SEQ ID No.5)，该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，亚非马蜂蜂毒Preprosecapin编码的成熟肽序列的18个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-CGGGAATTAAGGCACTATGACTCT-3’(SEQ ID No.6)该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和亚非马蜂蜂毒Preprosecapin的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-3上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/O)，一个凝血酶识别位点，一个谷光甘肽S转移酶(GST)融和蛋白标记物以及限制性内切酶克隆位点。

用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pGEX-4T-3载体并保持开放读框在凝血酶识别位点起始。随后用连接混合物转化商品名为JM105的E.coli菌株，JM105含有多拷贝的重组质粒，其表达lacI^q阻遏物并携带抗性(Amp^r)，在含有Amp^r的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证亚非马蜂蜂毒Secapin的cDNA片段，该序列为SEQ ID No.5序列的160～234，与已正确插入了载体。

在补加Amp^r(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶10的稀释率稀释，然后接种到大体积LB液体培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.6-1.0时，加IPTG(“异丙基硫代-β-D半乳糖苷”)至终浓度为1.0mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-5小时，离心收集细胞沉淀，重悬于1/20体积比的PBS中，通过超声波裂解细胞，加入TritonX-100到终浓度1％30min溶解蛋白。低温离心粗提物(10000g)5min，上清物用谷光甘肽S转移酶(GST)纯化单元从溶液中纯化溶解的谷光甘肽-亚非马蜂蜂毒Secapin融合蛋白，并将亚非马蜂蜂毒Secapin从融和蛋白上切割下来。亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白用15％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达该蛋白的分子量大小为约2.8KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。

实施例5，制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用亲和层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下.并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用200-300μg/头乳化过的蛋白，对12周龄的家兔皮下注射。21天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，以100-200μg/头的剂量进行皮下多点及腿部肌肉注射以加强免疫。21天后再进行一次臀部肌肉注射加强免疫。抗血清的特异反应活性用它在体内沉淀亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因翻译经加工后产物的能力来评估。

SEQ ID No.1∽6的说明，

SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征

(A)长度：31碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑；线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1

GCTCGAGATGAAGAPHTATTCAAAAAATGCA

SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征

(A)长度：31碱基

(B)类型：核酸、(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(xi)序列描述；SEQ ID NO.2

GAAGCTTTTAAGGCPHTATGPHTCTPHTPHA

SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征

CA)长度：31碱基

CB)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑；线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.3

 5’-GGATCCTTPHATTATTGATGTTCCT-3’

SEQ ID NO.4的信息

(i)序列特征

CA)长度：31碱基

CB)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑；线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.4

5’-CGGGAATTAAGGCPHTATGPHTCT-3’

SEQ ID NO.5的信息：

(i)序列特征

(A)长度：234bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑；线性

(ii)分子型：cDNA

(xii)(xi)序列描述：SEQ ID NO.5

1   ATGAAGAACT ATTCAAAAAA TGCAACACAC TTAATTACTG TTCTTCTATT CAGCTTTGTT

61  GTTATACTTT TAATTATTCC ATCAAAATGT GAAGCCGTTA GCAATAATAT GCAACCATTG

121 GAAGCACGAT CTGCTGATTT AGTCCAGGAA CCAAGATACA TTATTAATGT TCCTCCTAGA

181 TGTCCTCCAG GTTCTAAATT CATTAAGAAC AGATGTAGAG TCATAGTGCC TTAA

SEQ ID NO.6的信息：

(i)序列特征

(A)长度：77个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构；线性

(ii)分子型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO.6

1    Met Lys Asn Tyr Ser Lys Asn Ala Thr His Leu Ile Thr Val Leu Leu Phe Ser Phe Val

21   Val Ile Leu Leu Ile Ile Pro Ser Iys Cys Glu Ala Val Ser Asn Asn Met Gln Pro Leu

41   Glu Ala Arg Ser Ala Asp Leu Val Gln Gln Pro Arg Tyr Ile Ile Asn Val Pro Pro Arg

61   Cys Pro Pro Gly Ser Lys Phe Ile Lys Asn Arg Cys Arg Val Ile Val Pro

表I  亚非马蜂蜂毒Preproecapin与意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的比较

进行同源比较的两个序列是：

Preproecapin

残基总数：77

Preprosecapin残基总数：77

表示一致残基的符号为“*”

意大利蜜蜂  1：MKNYSKNATHLITVLLFSFVVILLIIPSKCEAVSNDRQSLEARSADLVPEPRYIIDVPPR 60

亚非马蜂    1：MKNYSKNATHLITVLLFSFVVILLIIPSKCEAVSNNMQPLEARSADLVQEPRYIINVPPR 60

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意大利蜜蜂  61：CPPGSKFIKNRCRVIVP                                           77

亚非马蜂    61：CPPGSKFIKNRCRVIVP                                           77

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同源性：93％

Claims (5)

1.一种分离出的亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白编码序列，其特征在于，其序列如SEQ ID No.5核苷酸序列所示。

2.一种分离的亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白，其特征在于，它具有SEQ IDNo.6氨基酸序列。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它是用权利要求3所述载体转化的宿主细胞。

5.一种如权利要求2所述分离的亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将权利要求1的编码序列可操作地连于表达调控序列，形成亚非一马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的表达载体；

(b)将步骤(a)中表达的载体转入宿主细胞，形成亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白。