CN1379092A - 一种人类亲环蛋白编码序列、其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种人类亲环蛋白(简称“hCL3B”)。本发明提供了该新的人hCL3B的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的人hCL3B蛋白的方法。本发明还提供了这种人hCL3B基因及其蛋白的应用。

Description

一种人类亲环蛋白编码序列、其制法和用途

技术领域

本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。更具体地说，本发明涉及一种人亲环蛋白，该蛋白是亲环蛋白家族的一个新成员。

背景技术

1984年，人们利用亲环蛋白(Cyclophilins)A与环胞霉素A的高亲合度首次从牛脾脏中纯化得到这种蛋白(Handschumacher RE，Harding MW，Rice J，Drugge RJ，Speicher DW.Science 1984；226(4674)：544-7)。研究发现，亲环蛋白在各物种细胞中广泛存在。大肠杆菌表达至少两种亲环蛋白：一个是在周质中，由190个氨基酸残基组成的；另一个在细胞膜中，由164个氨基酸组成。在酵母中则发现了三种：人亲环蛋白A的同源物；线粒体亲环蛋白D；内质网介导的亲环蛋白B，该蛋白具有肽酰脯氨酰异构酶(PPIase)活性并通常被过度抑制。除此以外，亲环蛋白还在各种植物中被发现。

在人类中，上个世纪九十年代人们已发现了四个亲环蛋白类似物：可溶性的亲环蛋白A同源物，具有内质网信号肽的亲环蛋白B，另一个具有内质网信号肽的亲环蛋白C和具有线粒体信号序列的亲环蛋白D。亲环蛋白家族高度保守的功能域由109个氨基酸构成。该蛋白所属家族还包括亲环蛋白B、亲环蛋白C和细胞中亲环蛋白相关蛋白的天然消除物等。亲环蛋白家族成员绝大多数具有PPIase的活性，即可以通过催化寡肽中脯氨酸肽键的顺反异构来加速蛋白折叠。脊椎动物中的亲环蛋白与环胞霉素A有高亲合度，环胞霉素A可能通过对PPIase的抑制作用介导某些反应，如免疫抑制等(Biochemistry 1990 Mar 6；29(9)：2205-12Fischer G，Schmid FX.)。

亲环蛋白是在进化中非常保守的蛋白，在各种现存的物种中都存在，这说明他们在生物体的活动中起着基础性的作用，因此，对亲环蛋白及与其相关的研究日渐广泛深入起来。

亲环蛋白家族成员绝大多数都具有PPIase的活性，即可以通过催化寡肽中脯氨酸肽键的顺反异构来加速蛋白折叠(Biochemistry 1990 Mar 6；29(9)：2205-12 Fischer G，Schmid FX.)。1993年，Galat A.等人对PPIase进行了研究，发现PPIase可加速体外蛋白折叠并把细胞结合，某些PPIase是热休克蛋白、糖皮质激素受体和离子通道等分子复合的联合调节亚单位。分泌形式的PPIase是单核细胞嗜伊红粒细胞和嗜碱细胞的炎症和趋化性介导者(Galat A.Eur JBiochem 1993；216(3)：689-707)。1996年，Ozaki K等人分离到了一个cDNA克隆，它编码166个氨基酸的亲环蛋白人类同源物。杂交结果显示，该克隆在人类各组织中广泛表达，在心脏中表达量最高。荧光原位杂交显示上述克隆定位于人分裂中期的染色体。该cDNA预测得到的氨基酸与小牛和另一个人的亲环蛋白分别有40.4％和41.6％的同源度(Cytogenet Cell Genet1996；72(2-3)：242-5，Ozaki K，Fujiwara T，Kawai A，etal)。而在受压应答中，某些特定的亲环蛋白的表达量都会上调。亲环蛋白在各种胞内信号通路中的功能研究还显示，亲环蛋白D在线粒体通透性中起重要作用，这与凋亡和细胞的坏死性死亡密切相关。它暗示亲环蛋白可能在生物的抗压过程中起重要作用。国内，南京李芳球教授等用基因工程方法已成功克隆并获得了体外高效表达的亲环蛋白。研究表明，胞内及体液中亲环蛋白会直接影响环胞霉素A药物的治疗效应。体内对亲环蛋白的抗体与系统性红斑狼疮等疾病密切相关，HIV-1的活性复制也需要亲环蛋白的介入。

然而迄今为止，尚没有人公开过本申请中涉及的hCL3B序列。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码亲环蛋白家族的一个新成员，本发明人亲环蛋白家族成员被命名为人亲环蛋白3B，简称“hCL3B”。

本发明的另一个目的是提供一种新的人亲环蛋白家族成员，本发明的蛋白被命名为hCL3B蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的人亲环蛋白家族成员的方法。

本发明还涉及这种人hCL3B基因序列及其编码的多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人hCL3B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ IDNO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列。

在本发明的另一方而，提供了一种分离的人hCL3B蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人hCL3B蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有人hCL3B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hCL3B蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hCL3B蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人hCL3B蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人hCL3B蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1101个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于272-517位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人hCL3B蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hCL3B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中272-517位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框272-517位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中272-517位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地，在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人hCL3B相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“人hCL3B蛋白多肽”指具有人hCL3B蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人hCL3B相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hCL3B蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人hCL3B DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hCL3B多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hCL3B多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了人hCL3B多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hCL3B多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人hCL3B蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hCL3B多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人hCL3B保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                                   表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

本发明还包括人hCL3B多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人hCL3B的表达。

本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有人hCL3B核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人hCL3B的核酸分子。

本发明还包括检测人hCL3B核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人hCL3B多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。较佳地，该引物或探针序列对应于人hCL3B核酸序列中不同于小鼠hCL3B核酸序列的部分。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人hCL3B DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人hCL3B基因产物或片段。较佳地，指那些能与人hCL3B基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人hCL3B蛋白的分子，也包括那些并不影响人hCL3B蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人hCL3B基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人hCL3B基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人hCL3B或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人hCL3B功能的抗体以及不影响人hCL3B功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人hCL3B基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人hCL3B基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人hCL3B核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的SEQ ID NO.3序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为1101个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于272-517位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A1：5′-TCTGAGAGGAACCCTTCTCTGAG-3′和反向引物B1：5′-ATTAGAGCACCTACCTACCCAGC-3′进行PCR，获得1101bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.1的全长cDNA序列。

根据同源比较的结果，本发明的蛋白序列与亲环蛋白家族成员具有较高的同源性，尤其是与亲环蛋白CL3(NP 115861.1，GI：14277126)的同一性达到了39.5％，并且在氨基端有26个氨基酸残基的序列完全相同(图1)。因此认为本发明蛋白属于人的亲环蛋白家族，并且具有与该家组成员相同或相近的的功能。

由此，本发明的人hCL3B可能在人类蛋白折叠中起重要作用，并通过与环胞霉素结合参与免疫抑制过程。将本发明的hCL3B编码序列或其编码的蛋白制成药物或试剂盒，可对由该基因引起的疾病起到预防、诊断和治疗的作用。

本发明的人hCL3B除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hCL3B还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。

针对本发明人hCL3B的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，如小鼠的hCL3B)。

此外，本发明的hCL3B核酸反义序列可以被引入细胞，以抑制人hCL3B的过度表达。本发明的人hCL3B蛋白活性多肽片段或其抗体可以施用于病人，以治疗或减轻因人hCL3B表达异常而导致的有关病症。

附表为本发明的hCL3B与亲环蛋白CL3的氨基酸序列同源比较表。其中，CL3的Genbank序列号为NP 115861.1(GI：14277126)，相同的氨基酸残基用“|”标出。结果显示，两者的同一性为39.5％，尤其在氨基端，两者有26个氨基酸残基的序列高度相同。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

实施例1

人hCL3B的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-TGAGATA GGAAGATGAG GGGA-3′为正向引物，寡核苷酸B1：5′-TAACACTTCCAGGATAC GGAC-3′为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段约一千个碱基对的目的片段。

2.PCR产物的测序

将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1101bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于272-517位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出人hCL3B的氨基酸序列，共81个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

同源比较

用本发明的人hCL3B的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与亲环蛋白家族成员都有一定的同源性，尤其是与CL3(NP 115861.1，GI：14277126)的同一性为39.5％，并且在氨基端有26个氨基酸残基的序列高度相同(图1)。因此，本发明蛋白应该属于人的亲环蛋白家族，并且具有与该家组成员相同或相近的的功能。

亲环蛋白是在进化中非常保守的蛋白，在各种现存的物种中都存在，这说明他们在生物体的生理活动中具有基础性的作用。亲环蛋白家族成员绝大多数都具有PPIase的活性，即可以通过催化寡肽中脯氨酸肽键的顺反异构来加速蛋白折叠。某些PPIase是热休克蛋白、糖皮质激素受体和离子通道等分子复合的联合调节亚单位。分泌形式的PPIase还是单核细胞嗜伊红粒细胞和嗜碱细胞的炎症和趋化性介导者。另外，亲环蛋白与环胞霉素A有高亲合度，环胞霉素A可能通过对PPIase的抑制作用介导某些反应，如免疫抑制等。在受压应答中，某些特定的亲环蛋白的表达量都会上调。亲环蛋白在各种胞内信号通路中的功能研究还显示，亲环蛋白D在线粒体通透性中起重要作用，这与凋亡和细胞的坏死性死亡密切相关。它暗示亲环蛋白可能在生物的抗压过程中起重要作用。此外，有研究表明体内对亲环蛋白的抗体与系统性红斑狼疮等疾病密切相关，HIV-1的活性复制也需要亲环蛋白的介入。

因此，本发明的人hCL3B可能在人类蛋白折叠中起重要作用，并通过与环胞霉素结合参与免疫抑制过程。将本发明的hCL3B编码序列或其编码的蛋白制成药物或试剂盒，可对由该基因引起的疾病起到预防、诊断和治疗的作用。

本发明的人hCL3B除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hCL3B还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。

针对本发明人hCL3B的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，如小鼠的hCL3B)。

此外，本发明的hCL3B核酸反义序列可以被引入细胞，以抑制人hCL3B的过度表达。本发明的人hCL3B蛋白活性多肽片段或其抗体可以施用于病人，以治疗或减轻因hCL3B表达异常而导致的有关病症。

实施例3

人hCL3B在大肠杆菌中的表达

编码人hCL3B的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例1中的扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。

5′寡核苷酸引物序列为

5′-AAGAGGATCCATGTCTGTG ACACTGCATA-3‘

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的hCL3B编码序列的部分核苷酸序列；

3’寡核苷酸引物序列为

5’-GTGT AAGCTTTGTC CAAATGTGGC TGTTT-3‘

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和hCL3B的部分编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人hCL3B的cDNA插入片段已正确装入载体。

过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人hCL3B。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人hCL3B。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。

实施例4

人hCL3B在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码人hCL3B的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例中的扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-AAGAAAGCTTATGTCTGTG ACACTGCATA-3′

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人hCL3B编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-GTGT GGATCCTGTC CAAATGTGGC TGTTT-3’

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人hCL3B的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人hCL3B的cDNA插入片段已正确装入载体。

质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。

实施例5

制备抗体

将如上获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人hCL3B基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

hCL3B    - MSVTLHTDVGDIKIEVFCERTPKTCE------------------------  -26

       ||||||||||||||||||||||||||CL3      - MSVTLHTDVGDIKIEVFCERTPKTCEMESRCVPQAGVQWRDLGSLQPPPP  -50hCL3B    - -----------------------ELEEEATVFGARSLR---------MNT  -44

                                | |         |          ||CL3      - GFKQVFCLSLPRTGRGGNSIWGKKFEDEYSEYLKHNVRGVVSMANNGPNT  -100hCL3B    - --------------------------------------------------  -44CL3      - NGSQFFITYGKQPHLDMKYTVFGKVIDGLETLDELEKLPVNEKTYRPLND  -150hCL3B    - -----VNILSTMLEVLYLWLIMARTPMDLSSSSPMANSHIWT          -81

              |CL3      - VHIKDITIHANPFA-----------------------------------Q  -165注：1.两者的同一性为39.5％2.相同的氨基酸残基用“|”标出3.hCL3B即为本发明的亲环蛋白，CL3的Genbank序列号为NP 115861.1(GI：14277126)

                             序列表<210>1<211>1101<212>脱氧核糖核酸<213>人类<220><221>编码序列<222>(272)..(517)<223><400>1tgtcgttttg gtttgagata ggaagatgag gggaggaagg aggtgaggcg gtaaggggcg     60ttctctctct tgggtcccgc gcccaacttc cgctggccca aagaaactat aattttgaac    120caacagacct ctgctggcat ctgcgattgc atttttcctg ttttaacaac ggctgtgcta    180gacgaagtgg ttgaagccca aagacttatt tttgagctcg ctgtaagact gagaaatcac    240gtagtccttc ctgaaaccac taagaggaaa a atg tct gtg aca ctg cat aca       292

                               Met Ser Val Thr Leu His Thr

                               1               5gat gta ggt gat att aaa att gaa gtc ttc tgt gag agg aca ccc aaa      340Asp Val Gly Asp Ilc Lys Ile Glu Val Phe Cys Glu Arg Thr Pro Lys

    10                  15                  20aca tgt gag gaa ctg gaa gag gag gca aca gta ttt ggg gca aga agt      388Thr Cys Glu Glu Leu Glu Glu Glu Ala Thr Val Phe Gly Ala Arg Ser

25                  30                  35ttg agg atg aat aca gtg aat atc tta agc aca atg tta gag gtg ttg      436Leu Arg Met Asn Thr Val Asn Ile Leu Ser Thr Met Leu Glu Val Leu40                  45                  50                  55tat cta tgg cta ata atg gcc cga aca cca atg gat ctc agt tct tca      484Tyr Leu Trp Leu Ile Met Ala Arg Thr Pro Met Asp Leu Ser Ser Ser

            60                  65                  70tca cct atg gca aac agc cac att tgg aca tga aatacaccgt atttggaaag    537Ser Pro Met Ala Asn Ser His Ile Trp Thr

        75                  80gtaatagatg gtctggaaac tctagatgag ttggagaagt tgccagtaaa tgagaagaca    597taccgacctc ttaatgatgt acacattaag gacataacta ttcatgccaa cccatttgct    657cagtagctat gatagacctg gacaaataac ttgacaaatt gctggaacac acttattgtg    717gtttacccgg ttttaattat gtcagagatt gcatcatcct tctgcttgtt tacaactatg    777atcttctatg aaatggtggt accaaggggc gcccaacagc ttttatcccc attcttagag    837catattcttt attataatga ttatccaaca tatttcttta attttaatac aaaaaataca    897tcatttaatt tttgttacat atgaacattc atttttaaat gctcagcctc aagtgcaggc    957atttttgagt ggcctgatta catattcctc ccacagcaag tccgtatcct ggaagtgtta   1017ttttataata aaatttaaaa agttttaaag aattaaatcg taggacaaat taattaaaat   1077attgtgtaaa attaaaaaaa aaaa                                          1101<210>2<211>81<212>蛋白<213>人类<400>2Met Ser Val Thr Leu His Thr Asp Val Gly Asp Ile Lys Ile Glu Val1               5                   10                  15Phe Cys Glu Arg Thr Pro Lys Thr Cys Glu Glu Leu Glu Glu Glu Ala

        20                  25                  30Thr Val Phe Gly Ala Arg Ser Leu Arg Met Asn Thr Val Asn Ile Leu

    35                  40                  45Ser Thr Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Trp Leu Ile Met Ala Arg Thr

50                  55                  60Pro Met Asp Leu Ser Ser Ser Ser Pro Met Ala Asn Ser His Ile Trp65                  70                  75                  80Thr

Claims (12)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人hCL3B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者

所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQID NO.2所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列。

4.一种分离的人hCL3B蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.一种产生具有人hCL3B蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有人hCL3B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hCL3B蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hCL3B蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人hCL3B蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人hCL3B蛋白活性的多肽。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸272-517位。

10.一种能与权利要求4所述的人hCL3B蛋白多肽特异性结合的抗体。

11.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

12.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。