CN101870975A - 鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用 - Google Patents

Abstract

鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(psBAFF)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。鹧鸪B淋巴细胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下：根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物；从鹧鸪脾脏提取总RNA；通过RT-PCR方法，一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMDPmd18-T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述鹧鸪B淋巴细胞刺激因子的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组psBAFF，作为鹧鸪类免疫增强剂。

Description

鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、表达技术。

背景技术

人B淋巴细胞激活因子(hBAFF)，也称为BLyS、THANK、TALL-1和TNFSF13B等，1999年在人单核细胞中首次发现，是肿瘤坏死因子家族的重要成员，与人体免疫调控密切相关。它主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓等组织中表达。hBAFF具有很强的B细胞趋化性，在体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白，对于休眠B细胞，hBAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表达，延长休眠B细胞的寿命。hBAFF在体内可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞过渡，并促进成熟B细胞的发育。hBAFF的正常表达是脾脏生发中心形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必要条件。另外，hBAFF可以协同刺激T细胞增值，诱导免疫球蛋白的类别转换重组。hBAFF也具有TNF抑杀肿瘤细胞的特性，能与B系肿瘤细胞膜上受体结合，引起B系肿瘤细胞(如Raji细胞)凋亡。由于hBAFF是一个新的治疗自身免疫性疾病及B细胞淋巴瘤的分子靶点，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景，在短短的几年时间里，美国HGSI公司经FDA批准先后有3项与BAFF有关的产品针对四类疾病进入临床试验研究：(1)2002年2月HGSI公司的rhBAFF获得了美国FDA第一个“Orphan drug”的销售许可，有效期为7年。主要针对人体CVID疾病，近期该项目已进入Ⅲ三期临床研究。(2)2001年11月开发BAFF单克隆抗体(LymphoStat-BTM)，主要针对红斑狼疮(SLE)和其它自身免疫性疾病，近期该项目已完成Ⅲ期临床试验。(3)2002年1月I131标记的重组hsBAFF(LymphoRad131)主要针对B系淋巴细胞肿瘤(如多发性骨髓细胞瘤等)。

检索GenBank、EMBL和DDBJ等国际三大核酸序列数据库可知，家禽的鸡、鸭和鹅的BAFF cDNA全长序列已被克隆，序列号分别是AF506010、DQ445092和DQ874394。鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)cDNA还未被克隆出来，关于鹧鸪BAFF基因甚至其TNF家族的细胞因子研究在国内外均属空白。鹧鸪是具有十分重要经济价值的养殖禽类，而其B淋巴细胞作为靶细胞常受到马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮增生症病毒(REV)和传染性法氏囊病(IBD)等等的威胁，引起机体免疫抑制，发生原发感染甚至死亡，甚至遭受其它病原侵袭而导致继发感染，对养禽业造成更大的损失，对人类的健康可能造成潜在的危害。由于B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)具有较强的免疫增强能力，基因工程鹧鸪BAFF蛋白有可能开发成一种能增强鹧鸪免疫能力的生物制剂，用于体质弱、免疫功能低下的病鹧鸪，增加鹧鸪抗病毒能力，尤其是在禽流感对人类已构成威胁的今天。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的禽类细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗禽类疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组鹧鸪BAFF蛋白具有潜在的巨大市场应用前景。同时，B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是新发现的免疫系统重要调控因子，对鹧鸪BAFF的研究有助于探索鹧鸪类的免疫调控机制，推动其免疫系统研究的发展。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从鹧鸪提取的B淋巴细胞刺激因子cDNA，并提供鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组技术。

本发明从鹧鸪中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

鹧鸪B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

(1)根据已知B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物：

正义寡核苷酸兼并引物pBAFF1：5’-CTGYY TGCARCTGATTGCWGACAG-3’(Y＝T/C，R＝G/A，W＝A/T)

反义寡核苷酸兼并引物pBAFF2：5’-GCACCAAARAANGTRYCRTCK C-3’(N＝A/T/G/C，R＝G/A，Y＝T/C，K＝G/T)

(2)从鹧鸪脾脏提取总RNA。

(3)通过RT-PCR，应用上述引物pBAFF1和pBAFF2为特异性引物，扩增出一段cDNA的序列，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，根据上述扩增得到的鹧鸪BAFF序列设计正义引物GSP1(5’-CTTCCAGAGCTGTTCCACGCTTAAAGC-3’)和反义引物

GSP2(5’-AGCGTGGAACAGCTCTGGAAGAACA-3’)分别用以扩增出上述cDNA3‘-和5‘-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2和P3，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。

(5)根据P1、P2和P3获得的三个序列的重叠区域拼接得到全长cDNA序列，并设计首尾引物FL1(5′-GAGCAGCGATGAAATC CGTGGACTG-3′)和FL2(5′-GGCTTCAGAGGAGTCTAACTGCACC-3′)，利用长距离PCR扩增pBAFF全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。

上述鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下：

(1)根据已知B淋巴细胞刺激因子全长cDNA两段高度保守区域设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物pBAFF1：5′-CTGYY TGCARCTGATTGCWGACAG-3′(Y＝T/C，R＝G/A，W＝A/T)和反义寡核苷酸兼并引物pBAFF2：5′-GCACCAAARAANGTRYCRTCK C-3’(N＝A/T/G/C，R＝G/A，Y＝T/C，K＝G/T)；

(2)利用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手册，提取鹧鸪脾脏组织总RNA。

(3)应用RT-PCR方法，应用上述引物pBAFF1和pBAFF2为特异性引物，扩增出一段cDNA的序列，长为412bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为：以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO₄2μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：50℃30min反转录反应，94℃2min变性，30个PCR循环(94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min)，最后72℃孵育10min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约410bp的基因片段，置4℃保存。

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒(Takara公司)，根据上述扩增得到的P1序列设计正义引物GSP1(5′-CTTCCAGAGCTGTTCCACGCTTAAAGC-3′)和反义引物GSP2(5′-AGCGTGGAACAGCTCTGGAAGAACA-3′)分别用以扩增出上述cDNA3’-和5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(557bp)和P3(385bp)，分别克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。

(5)根据P1、P2和P3的重叠区域拼接得到全长cDNA序列，并设计首尾引物FL1(5′-GAGCAGCGATGAAATC CGTGGACTG-3′)和FL2(5′-GGCTTCAGAGGAGTCTAACTGCACC-3′)，利用长距离PCR扩增出pBAFF全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。

将所得序列与GeneBank数据库序列进行相似性搜索，发现pBAFF与鸡、鹅、鸭、人和鼠分别有95％、92％、88％、76％和51％的序列相似率。可以确定该序列是鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO.1所示。

对该基因的进一步研究表明：该基因主要在鹧鸪免疫器官中表达，包括法氏腔上囊、脾脏和胸腺。其中法氏腔上囊表达水平最高，脾脏次之，胸腺最低；该基因的重组融合蛋白具有psBAFF的高活性功能；该基因编码的蛋白对鹧鸪B淋巴细胞具有明显的促存活/增殖效应，充分表明本发明克隆得到的基因就是鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的cDNA。

上述鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法，生产重组鹧鸪BAFF，作为鹧鸪类免疫增强剂。

所说的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入鹧鸪体内，增加其免疫力，在饲养中应用。

附图说明

图1是鹧鸪BAFF全长cDNA的克隆过程示意图；其中P1代表同源克隆片段；P2代表3’-RACE产物；P3代表5’-RACE产物；箭头代表引物位置；全长cDNA共881bp。

图2是鹧鸪BAFF全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。

图3是鹧鸪BAFF与鸡(cBAFF，GenBank No.AF506010)、鸭(dBAFF，GenBank No.DQ445092)、鹅(gBAFF，GenBank No.DQ874394)、人(hBAFF，GenBank No.AF116456)、鼠BAFF(mBAFF，GenBank No.AF119383)全长氨基酸序列同源性比较图。其中“*”表示比对残基完全相同，“：”和“.”分别表示比对残基为保守和半保守；跨膜区域用直线标出，弗林蛋白酶切位点用方框标出，切割后的C端为BAFF的胞外可溶功能区。

图4是鹧鸪BAFF mRNA在各组织中的表达水平分析图。β-actin作为内参。1-9分别表示为：肌肉、小肠、法氏囊、肝、肾、脾、胸腺、心和脑。

图5是融合蛋白His-psBAFF在BL21(DE3)中的诱导表达，Ni⁺柱纯化的SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果。条带1是未经IPTG诱导的全菌蛋白，2是经IPTG(0.1mM)诱导20h后的全菌蛋白，3是经Ni⁺柱纯化后的可溶性psBAFF，4经Ni²⁺-NTA纯化后的His-psBAFF的western-blo tting鉴定结果，在目的蛋白位置出现了特异性条带。

图6是本发明克隆的基因对鹧鸪法氏囊B淋巴细胞的促存活作用结果示意图。鹧鸪法氏囊B细胞分别在不同浓度的psBAFF刺激下B细胞的存活，以加BSA或protein control的细胞为阴性对照，psBAFF+2μg/ml PMA培养的细胞为阳性对照，培养24h后，psBAFF能刺激B细胞的存活，且随psBAFF浓度的增加，其刺激作用增强，表明psBAFF的上述生物学活性具有剂量依赖效应，但达到一定浓度后，psBAFF的刺激作用不再增加。重组psBAFF单独刺激鹧鸪法氏囊B细胞存活最适浓度为10μg/ml，重组psBAFF+PMA共刺激的最适蛋白浓度为8μg/ml。阴性蛋白质对照则无此效应。

图7所示为分别用10μg/ml psBAFF和8μg/ml psBAFF+2μg/ml PMA刺激法氏囊B细胞，细胞培养24h后，10μg/ml psBAFF处理的B细胞存活数约是阴性对照的3～4倍；细胞培养48h后，10μg/ml psBAFF处理的B细胞存活数是对照组的3～4倍。8μg/ml psBAFF+2μg/ml PMA共刺激的B细胞也有类似促B细胞存活效应。该结果强有力的证明了psBAFF可以促进离体培养的鹧鸪法氏囊B细胞的存活。

具体实施方式

本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

鹧鸪(Francolinus pintadeanus)，人工饲养。

(1)引物设计：应用ClustalX软件对已克隆出的人、鼠、鸡B淋巴细胞刺激因子全长cDNA序列进行同源性比对分析，精心选取两段高保守区域设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物正义寡核苷酸兼并引物pBAFF 1：5’-CTGYY TGCARCTGATTGCWGACAG-3’(Y＝T/C，R＝G/A，W＝A/T)与反义寡核苷酸兼并引物pBAFF2：5’-GCACCAAARAANGTRYCRTCK C-3’(N＝A/T/G/C，R＝G/A，Y＝T/C，K＝G/T)。

(2)提取总RNA：利用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)按照操作手册提取出约0.5克鹧鸪脾脏组织的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。

(3)应用RT-PCR方法，以上述pBAFF1和pBAFF2为特异性引物，扩增出鹧鸪BAFFcDNA的一段序列，全长为412bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为：以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO₄2μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：50℃30min反转录反应，94℃2min变性，30个PCR循环(94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min)，最后72℃孵育10min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约410bp的基因片段，置4℃保存。

(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒(Takara公司)，根据上述扩增得到的P1序列设计正义引物GSP1和反义引物GSP2分别用以扩增出上述cDNA3’-和5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(557bp)和P3(385bp)，分别克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。操作按照试剂盒操作手册要求进行。

(5)如图1所示，根据P1、P2和P3的重叠区域拼接出鹧鸪BAFF全长cDNA序列，并设计首尾引物FL1和FL2，利用长距离PCR扩增出pBAFF全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定，得到如图2所示的鹧鸪BAFF全长cDNA序列及推测编码氨基酸序列。

(6)同源检索：将所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GeneBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核苷酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析，如图3所示，发现pBAFF与鸡(GenBank登录号AF506010)、鹅(GenBank登录号DQ874394)、鸭(GenBank登录号DQ445092)、人(GenBank登录号AF116456)和鼠(GenBank登录号AF119383)分别有95％、92％、88％、76％和51％的序列相似率。可以确定该序列是鹧鸪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的全长cDNA。并且其开放阅读框如SEQ ID NO.1序列，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

1、鹧鸪BAFF基因在各组织的表达水平分析：

采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了鹧鸪肝(liver)、肾(kidney)、胸腺(thymus)、腔上囊(bursa)、脾(spleen)、心(heart)及脑(brain)的总RNA，运用半定量RT-PCR法对鹧鸪BAFF基因在各组织的表达水平进行了研究，结果如图4所示，鹧鸪BAFF基因主要表达在鹧鸪的免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾脏和胸腺；其中法氏腔上囊表达水平最高，脾脏次之，胸腺最低。实验中鹧鸪β-actin作为内参，采用的引物为β-actin F(5′-TGAACCCCAGCCAACAG-3′)和β-actin R(5′-CCACAGGACTCCATACCCAAG-3′)。RT-PCR体系如实施例1。

2、可溶性鹧鸪BAFF重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达：

以实施例1得到的鹧鸪BAFF全长cDNA为模板，设计引物psBAFF1(5’-TCAGGACATATGTCTGTTGTCCACACAGAAG-3’)(斜体部分为Nde I酶切位点)和psBAFF2(5’-ACTGAGGGATCCTCAGAGGAGTCTAACTGCACCA-3’)(斜体部分为BamH I酶切位点)克隆出鹧鸪BAFF cDNA胞外可溶区段(psBAFF)，引物分别引入酶切位点Nde I和BamHI，亚克隆入pET-28a载体，构建重组载体pET-28a-psBAFF。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，胞浆内可高效可溶性表达出目的蛋白NusA-His-psBAFF，此融合蛋白经促存活与增殖实验(图6、7)，活性检测证实具psBAFF的高活性功能，NusA-His标签不影响目的蛋白活性。

3、重组目的蛋白psBAFF的Ni⁺亲和纯化：

IPTG诱导含有重组载体pET-28a-psBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)5小时后，4℃收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，4℃，13,000×g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni⁺-NTA柱。简要过程是：3体积binding buffer平衡Ni⁺-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6倍体积washbuffer(60mM咪唑，0.5MNaCl，20Mm Tris-HCl pH7.9)洗去未结合上Ni⁺-NTA柱的杂蛋白，PBS透析除盐，以SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并以紫外分光光度计检测蛋白浓度，如图5(条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni⁺柱纯化得到纯度达95％的活性目的蛋白。

4、western blotting分析

western blotting中所用一抗为羊抗His6，二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。其简要步骤是：将诱导的产物先行SDS-PAGE，然后以浸入式将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然后依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与抗His6单抗孵育1h，与HRP标记的鼠抗羊IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图5(条带4)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。

5、鹧鸪BAFF对鹧鸪法氏腔上囊B淋巴细胞促存活作用实验

采用淋巴细胞分离液常规无菌分离鹧鸪法氏腔上囊淋巴细胞(约98％为B淋巴细胞)，用RPMI 1640细胞培养液调整细胞浓度至约4.3×10⁷个/ml，在96孔板中每孔加入100μl。再分组依次加入重组蛋白及乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)溶液，重组蛋白的终浓度分别为2、4、8、10、12μg/ml，PMA终浓度均为2μg/ml，以加2μg/ml PMA的培养细胞为阳性对照，以加PBS和不同浓度的BSA的培养细胞为阴性对照。在37℃、5％CO₂浓度条件下培养24h/48h。每孔加20μl MTT(5mg/ml)反应4h，离心(1000转×10min)，小心吸去上清每孔加150μl DMSO(1.10g/ml)，低速震荡10min后于酶标仪检测490nm处的光吸收值(OD)。实验设3个复孔，取其平均值，应用STATISTIC 6.0统计分析软件对样本数据进行t检验，确定差异显著性。在体外通过MTT细胞毒试验检测鹧鸪BAFF对鹧鸪法氏囊B淋巴细胞促存活作用，如图6所示，鹧鸪法氏囊B细胞分别在不同浓度的psBAFF刺激下B细胞的存活，且随psBAFF浓度的增加，其刺激作用增强，表明psBAFF的上述生物学活性具有剂量依赖效应，但达到一定浓度后，psBAFF的刺激作用不再增加。重组psBAFF单独刺激鹧鸪法氏囊B细胞存活最适浓度为10μg/ml，重组psBAFF+PMA共刺激的最适蛋白浓度为8μg/ml。阴性蛋白质对照则无此效应。分别用10μg/ml psBAFF和8μg/ml psBAFF+2μg/ml PMA刺激法氏囊B细胞，细胞培养24h后，10μg/ml psBAFF处理的B细胞存活数约是阴性对照的3～4倍；细胞培养48h后，10μg/mlpsBAFF处理的B细胞存活数是对照组的3～4倍。8μg/ml psBAFF+2μg/ml PMA共刺激的B细胞也有类似促B细胞存活效应(图7)。该结果强有力的证明了psBAFF可以促进离体培养的鹧鸪法氏囊B细胞的存活。

实施例3：

将实施例1获得的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，生产重组鹧鸪BAFF，作为鹧鸪类免疫增强剂。

实施例4：

将实施例1获得的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转让鹧鸪体内，增加其免疫力，在饲养中应用。

按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰鹧鸪B淋巴细胞刺激因子基因并用于所述研究和生成。

Claims (4)

1.鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA，其特征在于，是SEQ ID NO.1所示的序列。

2.一种权利要求1所述的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法，其步骤如下：

(1)根据已知物种的B淋巴细胞刺激因子cDNA保守序列设计引物：

正义寡核苷酸兼并引物pBAFF1：5′-CTGYYTGCARCTGATTGCWGACAG-3′，

反义寡核苷酸兼并引物pBAFF2：5′-GCACCAAARAANGTRYCRTCK C-3’；

(2)从鹧鸪脾脏提取总RNA；

(3)通过RT-PCR方法，以上述引物pBAFF1和pBAFF2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定；

(4)应用cDNA末端快速扩增方法，根据已获得的P1核苷酸序列设计引物：

正义引物GSP2：5′-AGCGTGGAACAGCTCTGGAAGAACA-3′，

反义引物GSP1：5′-CTTCCAGAGCTGTTCCACGCTTAAAGC-3′，

分别用以扩增出BAFF cDNA 3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2和P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定；

(5)根据P1、P2和P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL15′-GAGCAGCGATGAAATC CGTGGACTG-3′，FL25′-GGCTTCAGAGGAGTCTAACTGCACC-3′，

一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。

3.一种权利要求1所述的鹧鸪B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基因工程方法，生产重组鹧鸪B淋巴细胞刺激因子，作为鹧鸪类免疫增强剂。

4.鹧鸪B淋巴刺激因子，其特征在于，是SEQ ID NO.2所示的序列。

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