CN103014015B - 编码猪γ干扰素的基因片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计合成新的猪γ干扰素成熟肽核苷酸序列。成功地构建了重组酵母表达质粒pPICZαC-IFN-γ，不仅在毕赤酵母中对猪γ干扰素实现了正确表达，而且使猪γ干扰素在毕赤酵母菌中表达更容易，表达量更高，为基因工程大规模生产发酵奠定了基础。

Description

编码猪γ干扰素的基因片段及其应用

本申请是申请日为2010年3月26日，申请号为：201010139485.4，发明名称为“编码猪α干扰素的基因片段及其应用”的专利申请之分案申请。

技术领域

本发明涉及编码猪γ干扰素的基因片段及其应用。

背景技术

近年来猪病毒性传染病日益泛滥，已严重地威胁着我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快迅变异，常导致疫苗免疫失败；加之不断出现新的病毒病，目前还尚无成功的疫苗接种预防。另一方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而一些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，一些国家已明令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作为一种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。

传统的生产方法：由中草药等诱生剂诱导产生干扰素，因纯化工艺复杂，产量少、作用缓和等诸多因素影响而极大限制了在临床和科研的应用。

随着猪干扰素基因的克隆成功，对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大肠杆菌中表达了PoIFN-α1基因，得到了一个含189个氨基酸的前体蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然PoIFN-α1生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。Pol JM等(1991)研究发现：rPoIFN-α1能够抑制伪狂犬病毒（PRV）强毒和中等毒力病毒在猪鼻腔黏膜组织stroma细胞层的增殖，PRV接种干扰素处理的猪成纤维细胞和猪肾细胞，病毒滴度明显下降。Horisberger MA（1992）比较了重组PoIFN-α（rPoIFN-α）和重组PoIFN-γ（rPoIFN-γ）在猪的细胞中抗病毒活性的区别，发现rPoIFN-α可大大降低猪水泡性口炎病毒（VSV）在猪PK-15上引起的病变，并能削弱猪水泡性口炎病毒（VSV）和流感病毒在猪肾细胞中的复制，但rPoIFN-α和rPoIFN-γ对门戈病毒（一种脑心肌炎病毒）都有抗病毒作用。Jordan LT等（1994）发现rPoIFN-α对传染性胃肠炎病毒（TGEV）有很好的预防作用。Tonomura N等（1996）研究发现HuIFN-α处理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干扰素处理的Vero中降低，瞬时表达试验表明PRV IE启动子的转录被选择性抑制。BuddaertW（1998）对rPoIFN-α在体内、外对猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的抗病毒活性进行了研究，发现PRRSV在体内、外对rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明显抑制PRRSV的产量和感染细胞的数量。chinsangaram J.等（2001）人用大肠杆菌表达rPoIFN-α或rPolFN-β并分别进行了抗口蹄疫病毒（FMDV）实验，发现rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV复制是在蛋白质翻译水平上的，主要是激活双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）作用的结果：在细胞中加入PKR抑制剂2-氨基嘌呤后，病毒的产量就会上升；而RNase L和PKR基因缺失的细胞在干扰素的作用下仍能感染FMDV，这充分说明了PKR在抑制病毒复制中起作用。

我国学者也对猪α干扰素进行了多项研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了其成熟蛋白的单纯表达，表达产物具有较高的抗病毒活性。杜以军等利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒pAd-PoIFN-α转染HEK-293A细胞，滴度为10⁷TCID₅₀/mL。RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。谢海燕等(2004)克隆了猪IFN-α基因，构建了原核表达载体，初步对其进行了原核表达研究；我国学者夏春等（2005）报道了用pQE30表达载体在大肠杆菌原核表达的rPoIFN-α在猪源细胞和非猪源细胞系上可显著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，证明了原核表达PoIFN-α的可行性及将基因工程原核表达的PoIFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂可行性。曹瑞兵等对猪IFN-α1基因进行了改造，在保留编码蛋白序列的同时，使用了大肠埃希菌的偏爱密码子，将合成的猪IFN-α1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中，实现了猪IFN-α1在大肠埃希菌中的高效表达，且重组猪IFN-α1具有较高的抗病毒活性，约为6.4×10⁶U/mg。此外，葛丽等(2005)克隆了猪IFN-α基因，构建了真核表达载体，初步对其做了毕赤酵母分泌表达研究。刘占通等对丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因进行克隆，得到了上述4个品系的猪IFN-α基因，证明核苷酸同源性均在97.2％以上，氨基酸同源性均在92.8％以上。

在猪β干扰素基因研究方面，2000年夏春等首次对猪干扰素β基因进行分子克隆与测序，克隆片段长668个核苷酸，编码186个氨基酸。其中，76～636位含有1个ORF，蛋白分子量为21.8Ku。除此之外，温纳相（2005）和彭贵青（2005）也对猪干扰素β的基因进行了分子克隆与测序，并检测其生物活性。

在表达方面，曹瑞兵（2004）和吴阳（2006）分别对猪β干扰素的基因进行了原核表达，表达量分别为17.3%和18%，表达产物均为融合蛋白。其中曹瑞兵用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后，细胞病变抑制法(CPE₅₀)测定结果表明，重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）的感染。而后，为了研制高活性的重组猪β干扰素，曹瑞兵（2006）对猪干扰素β进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达质粒pPICZαA-PIB，pPICZαA-PIB电转化导入毕赤酵母菌株X-33后经甲醇诱导发酵高产量分泌表达猪IFN-β，其中B1株酵母的IFN-β产量最高，约为2.5×10⁵U/mL，其表达量约为60μg/mL，比活为4.17×10⁶U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDS-PAGE和Western-blot检测，结果表明表达产物是分子量约为28Ku和25Ku蛋白的混合物，两者均可与猪IFN-β阳性抗血清发生特异反应。表达产物比猪IFN-β理论推导分子量(约20.8Ku)大，推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组猪IFN-β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用，并且猪IFN-β对伪狂犬病毒在牛肾细胞（MadenDarby Bovine Kidney cells，MDBK）上早期增殖的抑制效果最为明显。

在猪γ干扰素基因研究方面，IFN-γ虽然只有一种基因，但其结构更为复杂，如编码人和鼠IFN-γ的基因长约6Kb，各包含有4个外显子和3个内含子。IFN-γ与I型干扰素(IFN-α与IFN-β)田在基因和蛋白质水平上没有明显的相关性(DeGrado,et al,1991)。虽然IFN-γ具有其它干扰素大多数的生物学活性，但在特异性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫调节活性方面要高100-10000倍(Pace,et al,1985)。猪IFN-γ全基因编码166个氨基酸残基，其中包括20aa的信号肽(Dijkmans,et al,1990)。信号肽切除后，产生146个氨基酸的IFN-γ单体，分子量为17.3ku，天然活性状态的IFN-γ是由两个IFN-γ单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白((Boehm,etal,1997)。猪IFN-γ与人、小鼠、猫和犬的IFN-γ分别具有60%,41%,72%和72%的同源性，而与IFN-β及IFN-α家族没有明显的同源性(Farrar and Schreiber,1993)。

国外最早于1990年由Roger等从基因水平开展了对猪γ干扰素的研究，他们以人γ干扰素的cDNA为探针，克隆了猪γ干扰素基因，发现与人γ干扰素在DNA和氨基酸的水平上分别有75%和59%的同源性(Dijkmans et al.,1990)。随后，Vandenbroeck等利用原核表达系统表达了猪γ干扰素(Vandenbroeck et al.,1991)。

在我国，郭镰军等于2001年首次克隆报道了猪γ干扰素基因序列(郭稼军等，2001)。迄今为止，夏春，曹瑞兵(吴文学等，2002;曹瑞兵等，2003;曹瑞兵等，2004)等人以原核系统表达的干扰素具有较好的生物学活性。曹瑞兵等从经刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN-γ基因，经改造后插入原核表达载体pRLC，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在，经变性、复性、脱盐、凝胶层析纯化处理,重组猪IFN-γ具有较高的干扰素活性。赵英杰等成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株，亚细胞定位分析表明，目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。其对长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析，说明几种我国地方猪IFN-γ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变，同时也证实了长白猪干扰素-γ基因的正确、完整克隆。为了研究和应用猪重组干扰素-γ预防和治疗病毒性疫病，夏春将大白猪IFN-γ基因插入到酵母整合载体pHIL-S1，构建了重组GS115工程菌。经过SDS-PAGE、Western-blot分析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性测定，证实猪IFN-γ分子量为18Ku，在GS115中的表达量为18%，具有抗VSV的活性。用猪IFN-γ处理猪肺巨噬细胞系Marc-145后，经细胞病变抑制法测定，猪IFN-γ可以抵抗猪蓝耳病病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)感染。

但以上技术均具有原基因密码子的表达量低、抗病毒活性低的缺陷。

发明内容

本发明的目的是依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子对猪α、β和γ干扰素成熟肽核苷酸序列进行基因修饰和改造，并构建出重组酵母表达质粒pPICZαC-IFN-α、pPICZαC-IFN-β和pPICZαC-IFN-γ，其可以在毕赤酵母中对猪α、β和γ干扰素正确且高效表达。密码子改造后所分泌的蛋白干扰素具有更好的抗病毒活性。

干扰素具有很高的生物活性，1mg即具有1亿个活性单位。基因重组猪α、β干扰素都属于Ⅰ型干扰素，具有广谱抗病毒活性；基因重组猪γ干扰素属于Ⅱ型干扰素，具有很好的免疫调节作用。通过基因工程方法，根据密码子的偏嗜性，重新合成猪α、β、γ三种干扰素基因核苷酸序列，在优化诱导表达条件的基础上，提高干扰素蛋白在毕赤酵母菌中的表达量，为大规模发酵生产奠定了基础。因此，在本发明基础上，猪α、β、γ三种干扰素推广应用前景广阔。

本发明提供了一种编码猪α干扰素的基因片段，其具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物Pα₁具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列；下游引物Pα₂具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪α干扰素的重组毕赤酵母。

本发明还提供了一种编码猪β干扰素的基因片段，其具有如SEQID NO.4所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物Pβ₁具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；下游引物Pβ₂具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪β干扰素的重组毕赤酵母。

本发明还提供一种编码猪γ干扰素的基因片段，其具有如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物Pγ₁具有如SEQID NO.8所示的核苷酸序列；下游引物Pγ₂具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪γ干扰素的重组毕赤酵母。

构建重组酵母时，采用的表达载体优选是pPICZαC，重组质粒优选是pMD-IFN-α、pMD-IFN-β和pMD-IFN-γ。

与传统方法的表达的干扰素相比，本发明通过研究，达到了表达量高，成本较低，效价较高，质量稳定，因此为产品转化创造了先决条件，具有很好的市场潜力和较强的市场竞争力，更易在规模化猪场中广泛推广应用。基因重组的猪α干扰素具有很好的抗病毒作用，可以单独使用治疗多种猪病毒性疾病；将表达的猪γ干扰素作为疫苗佐剂，与不同的疫苗联合，可以研制出免疫效果更好的新型疫苗，将对猪病毒性疾病防治产生积极的影响。因此，本发明在市场上具有良好的应用前景。在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。本发明通过精心设计，对猪三种干扰素进行了基因修饰和改造，经显示系统表明，密码子改造后所分泌蛋白猪三种干扰素具有更好的抗病毒活性。

附图说明

图1是本发明实施例的PoIFN-α改造前后的氨基酸序列关联性；

图2是本发明实施例的PoIFN-α改造前后的碱基序列关联性；

图3是本发明实施例的PoIFN-β改造前后的氨基酸序列关联性；

图4是本发明实施例的PoIFN-β改造前后的碱基序列关联性；

图5是本发明实施例的PoIFN-γ改造前后的氨基酸序列关联性；

图6是本发明实施例的PoIFN-γ改造前后的碱基序列关联性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

（一）基因改造

应用DNASTAR（Version 5.0）基因分析软件，参照NCBI GenBank上登载的猪干扰素α基因成熟肽核苷酸序列(AY331298)、猪干扰素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和猪干扰素γ基因成熟肽序列(EU249804)，参照赵翔等毕赤酵母菌的密码子用法分析以及TaKaRa公司的Pichia酵母密码子表等，按照该序列氨基酸顺序不变，因此表达的蛋白质不发生变化，同时根据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计新序列，送由大连宝生物工程有限公司重新合成序列。

1、猪α干扰素新序列，如SEQ ID NO.1所示，共501bp；编码166个氨基酸，如SEQ ID NO.10所示。

引物：

Pα₁（SEQ ID NO2）：CG GAATTC CTGTGACTTGCCACAAACCCACT（标有下划线处为EcoRⅠ限制性内切酶）

Pα₂（SEQ ID NO.3）：GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG

（标有下划线处为KpnⅠ限制性内切酶）

上、下游引物的理论跨幅为518bp，退火温度：58℃

2、猪β干扰素新序列，如SEQ ID NO.4所示，共498bp；编码165个氨基酸，如SEQ ID NO.11所示。

Pβ₁（SEQ ID NO.5）：CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT

（标有下划线处为EcoRⅠ限制性内切酶）

Pβ₂（SEQ ID NO.6）：GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG

（标有下划线处为KpnⅠ限制性内切酶）

上、下游引物的理论跨幅为513bp，退火温度：52℃

3、猪γ干扰素新序列，如SEQ ID NO.7所示，共432bp；编码143个氨基酸，如SEQ ID NO.12所示。

Pγ₁（SEQ ID NO.8）：CG GAATTC CCAG GCT CCATTT TTCAA

（标有下划线处为EcoRⅠ限制性内切酶）

Pγ₂（SEQ ID NO.9）：GGGGTACCTTACTTGGAGGCTCTCTGAC

（标有下划线处为KpnⅠ限制性内切酶）

上、下游引物的理论跨幅为449bp，退火温度：50.7℃

（二）重组表达质粒的构建(以pPICZαC-IFN-α为例，pPICZαC-IFN-β、pPICZαC-IFN-γ与此相同)

1、重组质粒与表达载体的双酶切

对重组质粒pMD-IFN-α进行EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，双酶切反应体系如下：

将上述成分加入0.5mL的Eppendorf管中，混匀，37℃酶切过夜。-20℃保存备用。同时对表达载体pPICZαC进行EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，双酶切反应体系同上。

2、酶切产物的回收和纯化

参照OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒GelExtraction KitⅠ）使用说明书进行。具体步骤如下：

将100μL酶切产物于1.0%的低熔点的琼脂糖凝胶中电泳。电泳结束后，在紫外灯下用干净的刀片迅速将目的片段从琼脂糖凝胶中切下，置于一个新的1.5mL的Eppendorf管中。加入等倍于凝胶体积的Binding Buffer，在55～65℃水浴温育约7min，每隔1～2min混合一次，直至琼脂糖凝胶完全溶解。将液体移至黄色的HiBind^TMDNAMinicolumn管中，下套2mL Collection Tubes，12，000r/min离心1min，弃去Collection Tubes中的废液。往HiBind^TMDNA Minicolumn管中加入300μL Binding Buffer,12，000r/min离心1min，弃去Collection Tubes中的废液。往HiBind^TMDNA Minicolumn管中加入700μL的DNA Wash Buffer，静置2～3min，12，000r/min离心1min洗柱，弃滤液。重复步骤（5）一次，空管离心1min。将HiBind^TMDNAMinicolumn管移至新的1.5mLEppendorf管中。加入30μL的ElutionBuffer，12，000r/min离心1min，离心所得溶液于-20℃保存。

3、目的基因片段与载体质粒的连接

将上述各组分加入0.5mLEppendorf管中，离心混匀，置温箱中16℃过夜连接。

4、连接产物的转化

取上面的连接产物10μL加到50μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞悬液中，轻轻吹匀，冰浴30min，另取50μL的感受态细胞悬液不加质粒作空白对照。42℃热应激90s，迅速冰浴5min。加入1mL LB Z^-培养液，37℃摇床上120～130r/min培养45min。5，000r/min离心5min，弃去上清800μL，剩余的重悬菌泥并涂布于LB Zeocin⁺培养基平皿上，置37℃温箱中放置约30min至表面液体吸收完全后，倒置培养16～18h。设置对照组：A组为Zeocin^-对照组，培养基中不含Zeocin^TM，接种DH5α，观察细菌生长情况；B组为Zeocin⁺对照组，培养基中含有Zeocin^TM（25μg/mL），接种DH5α，观察细菌对Zeocin^TM的药敏性。

5、重组表达质粒的PCR鉴定

对LB Zeocin+培养基平皿上长出的可疑菌落，接种于2mL含ZeocinTM（25μg/mL）低盐LB液体培养基中，37℃250r/min振摇培养过夜，从菌液中抽提质粒。以重组质粒DNA为模板，加入目的片段的特异性引物进行PCR鉴定。以重组质粒DNA为模板，在0.5mL的Eppendorf管中依次加入以下成分：

上述混合液瞬时离心混匀，阳性质粒命名为pPICZαC-IFN-α。

6、重组质粒pPICZαC-IFN-α的单酶切鉴定

用限制性内切酶SacⅠ对经PCR检测为阳性的重组质粒进行单酶切鉴定，反应体系如下：

酶切反应体系置于37℃恒温水浴过夜后，于0.8%琼脂糖凝胶中低压电泳检测结果。

7、重组质粒pPICZαC-IFN-α的双酶切鉴定

用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ对经PCR检测为阳性的重组表达质粒进行双酶切鉴定，反应体系如下：

将上述各组分加入0.5mL的EP管中，混匀，放置水浴锅中37℃酶切4h，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

8、重组表达质粒pPICZαC-IFN-α目的基因的序列测定

（三）携带目的基因的重组酵母的构建

1、毕赤酵母X-33感受态细胞的制备

根据Invitrogen公司实验手册进行，用无菌牙签挑取单菌落PichiaPastoris X-33接种于5mL的YPD培养液中，28～30℃振荡培养过夜。取部分过夜培养物(按0.1%的比例)重新接种于50mL的YPD培养液中，28～30℃振荡培养直至菌液OD₆₀₀=1.2～1.5。4℃，8，500r/min离心5min收集菌体，用50mL预冷的灭菌水重悬菌体。同样离心收集菌体，用25mL预冷的灭菌水重悬菌体。离心后用2mL预冷的1mol/L的山梨醇重悬菌体，4℃，8，500r/min离心5min收集菌体。最后用50～80μL预冷的1mol/L的山梨醇重悬菌体，即得到感受态酵母细胞，用于当天电转化，不要冻存细胞。

2、重组质粒pPICZαC-IFN-α的线性化及回收

根据Invitrogen公司实验手册进行，用SacⅠ单酶切pPICZαC-IFN-α，使之线性化，酶切反应体系如下:

同时对空载体pPICZαC也进行线性化，体系同上。

将上述各组分加入Eppendorf管中，混匀，放置水浴锅中37℃酶切8h。电泳检测线性化完全后，进行目的基因的回收纯化。

3、重组质粒pPICZαC-IFN-α的电击转化

取80μL新鲜制备的感受态酵母细胞与20μL线性化的重组质粒轻轻混匀。转入预冷的电转杯（Eppendorf公司，100μL）中冰浴5min。设定电转化参数为1500V。电转化后立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇，轻轻混匀后将转化物移入5mL的培养管。30℃静置培养1.0h，然后加入1mL YPD液体，30℃，200r/min振荡培养1.0h。离心收集菌体，用50～200μL YPD重悬并铺于新鲜制备的YPDS平板（含100μg/mL Zeocin^TM）上，将平板倒置，于30℃温箱中培养3～5d。

4、重组酵母菌菌液PCR鉴定

用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，接种于1mL的YPDS液体培养基中（含200μg/mL Zeocin^TM），30℃，200r/min振荡培养过夜。

将pPICZαC-IFN-α转化的重组酵母、pPICZαC转化的重组酵母以及未转化酵母X-33在YPD液体培养基上培养16～20h后，冰浴5min，5，000r/min离心5min后弃去上清；菌泥用破菌缓冲液重悬，同样离心弃去上清后，加入200μL酵母裂解液重悬菌泥，并加入等体积的0.5mm酸洗玻璃珠和等体积的Tris饱和酚，旋涡器上振荡3min；12，000r/min离心10min后取上清，上清中加入等体积的异丙醇，4℃作用至少10min，沉淀DNA；12，000r/min离心弃上清，75%的乙醇和无水乙醇洗涤后晾干，加入40μL双蒸水（含RNase）溶解备用。

重组酵母DNA的快速提取本实验也用到这种方法：将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendorf管中，加100μL的灭菌水，100℃煮10min，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30min，100℃煮10min，12,000r/min离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR鉴定。

PoIFN-α反应程序：94℃预变性4min，然后再开始以下循环：94℃30s，50℃30s,72℃30s，运行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR结束后，各取5μLPCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪中观察结果。

（四）高抗性整合子的初步诱导表达

用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，挑于1mL的YPDS液体培养基中（含200μg/mLZeocin^TM），30℃，200r/min振荡培养过夜。

用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，挑于20mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD₆₀₀=2～6,此时细胞处于对数生长期。1500～3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于1mL的BMMY中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在15mL的试管中振荡培养。每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，进行诱导培养。培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-70℃保存。

（五）表达产物的检验

1、表达产物的SDS-PAGE分析

培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析。

2、表达产物的Western-blot分析（β干扰素市场上无商品化的单抗）

取上清进行Western-blot分析，分别以小鼠抗猪α、γ干扰素单克隆抗体为一抗，山羊抗小鼠-IgG-HRP为二抗，对转移到硝酸纤维膜上的表达蛋白进行处理，DAB显色。

（六）猪α、β和γ干扰素蛋白质含量的检测

对诱导表达产物上清进行SDS-PAGE蛋白电泳,然后进行染色脱色，置于薄层扫描仪进行灰度扫描，通过Labwork软件系统来分析，利用牛血清蛋白做定量对照，来计算样品总蛋白含量及其总蛋白中猪干扰素的有效含量，不同样品的灰度扫描相对值的测定结果。

结果如下：

PoIFN-α泳道总蛋白总蛋白浓度为77.654mg/L

PoIFN-α有效蛋白浓度为54.105mg/L

样品中猪IFN-α的有效含量占样品总蛋白含量的百分比

PoIFN-α：54.105／77.654×100%≈69.67%

PoIFN-β泳道总蛋白浓度为84.75mg/L

PoIFN-β有效蛋白浓度为66.98mg/L

样品中猪IFN-β的有效含量占样品总蛋白含量的百分比：

PoIFN-β：66.98／84.75×100%≈79.03%

PoIFN-γ泳道总蛋白浓度为100.44mg/L

PoIFN-γ有效蛋白浓度为79.976mg/L

样品中猪IFN-γ的有效含量占样品总蛋白含量的百分比：

PoIFN-γ：79.976／100.44×100%≈79.63%

VSV滴度的测定10^5.5TCID₅₀/mL

表达的猪α干扰素效价：未经改造是1.817x10⁶U/L，经改造的效价为5.87×10⁷U/L。

表达的猪β干扰素效价：未经改造是3.52x10⁶U/L，经改造的效价为1.02×10⁸U/L

表达的猪γ干扰素效价：未经改造是1.01x10⁶U/L，经改造的效价为1.60×10⁷U/L。

（七）全部的序列关联性

PoIFN-α改造前后表达的氨基酸序列不发生变化，变化的只是核苷酸的碱基排列顺序（密码子改造），由图1和图2可知，改造前后，表达的蛋白没有发生变化，碱基序列相似性只有78.6%，变化有25.8%。

PoIFN-β改造前后表达的氨基酸序列不发生变化，变化的只是核苷酸的碱基排列顺序（密码子改造），由图3和图4可知，改造前后，表达的蛋白没有发生变化，碱基序列相似性只有78.5%，变化有25.8%。

PoIFN-γ改造前后表达的氨基酸序列不发生变化，变化的只是核苷酸的碱基排列顺序（密码子改造），由图5和图6可知，改造前后，表达的蛋白没有发生变化，碱基序列相似性只有75.5%，变化有30.7%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种编码猪γ干扰素的基因片段在构建可表达猪γ干扰素的重组毕赤酵母中的应用，其特征在于，所述编码猪γ干扰素的基因片段如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，用于扩增该序列的上游引物Pγ₁如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；下游引物Pγ₂如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；用于扩增该序列的PCR方法退火温度为50.7℃； 

其中，采用的表达载体是pPICZαC，重组质粒是pMD-IFN-γ。 

2.权利要求1所述的应用，其特征在于， 

1)对重组质粒pMD-IFN-γ和表达载体pPICZαC分别进行EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，两种酶切产物经T4DNA连接酶在温箱中16℃过夜连接； 

2)取连接产物10μL加到50μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞悬液中，轻轻吹匀，冰浴30min，42℃热应激90s，迅速冰浴5min，加入1mL LB Z-培养液，37℃摇床上120～130r/min培养45min，5000r/min离心5min，弃去上清800μL，剩余的重悬菌泥涂布于LBZeocin⁺培养基平皿上，置37℃温箱中放置约30min至表面液体吸收完全后，倒置培养16～18h；对LB Zeocin+培养基平皿上长出的可疑菌落，接种于2mL含Zeocin^TM25μg/mL低盐LB液体培养基中，37℃250r/min振摇培养过夜，从菌液中抽提质粒，以重组质粒DNA为模板，加入特异性引物Pγ₁和Pγ₂进行PCR鉴定阳性菌落；用限制性内切酶SacⅠ对经PCR检测为阳性的重组质粒进行单酶切鉴定，用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ对经PCR检测为阳性的重组表达质粒进行双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶中低压电泳检测结果； 

3)用SacⅠ单酶切pPICZαC-IFN-γ，使之线性化，酶切反应条件为水浴锅中37℃酶切8h，电泳检测线性化完全后，进行目的基因的回收纯化；取80μL新鲜制备的毕赤酵母X-33感受态细胞与20μL线性化的重组质粒轻轻混匀，转入预冷的100μL电转杯中冰浴5min， 设定电转化参数为1500V，电转化后立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇，轻轻混匀后将转化物移入5mL的培养管，30℃静置培养1.0h，然后加入1mL YPD液体，30℃，200r/min振荡培养1.0h，离心收集菌体，用50～200μL YPD重悬并铺于新鲜制备的YPDS平板上，将平板倒置，于30℃温箱中培养3～5d，所述YPDS为含100μg/mL Zeocin^TM培养基； 

4)用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，接种于1mL含200μg/mL Zeocin^TM的YPDS液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养过夜；将pPICZαC-IFN-γ转化的重组酵母、pPICZαC转化的重组酵母以及未转化酵母X-33在YPD液体培养基上培养16～20h后，冰浴5min，5000r/min离心5min后弃去上清；菌泥用破菌缓冲液重悬，同样离心弃去上清后，加入200μL酵母裂解液重悬菌泥，并加入等体积的0.5mm酸洗玻璃珠和等体积的Tris饱和酚，旋涡器上振荡3min；12000r/min离心10min后取上清，上清中加入等体积的异丙醇，4℃作用至少10min，沉淀DNA；12000r/min离心弃上清，75％的乙醇和无水乙醇洗涤后晾干，加入40μL含RNase双蒸水溶解备用； 

将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendorf管中，加100μL的灭菌水，100℃煮10min，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30min，100℃煮10min，12000r/min离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR鉴定；PoIFN-γ反应程序：94℃预变性4min，然后再开始以下循环：94℃30s，50℃30s,72℃30s，运行30个循环，最后72℃延伸10min；PCR结束后，各取5μL PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪中观察结果； 

5)用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，挑于1mL含200μg/mLZeocin^TM的YPDS液体培养基中，30℃， 200r/min振荡培养过夜；用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin^TM抗性的单菌落，挑于20mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD₆₀₀＝2～6,此时细胞处于对数生长期，1500～3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于1mL的BMMY中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在15mL的试管中振荡培养，每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养，培养至96h收集样品，离心，取上清； 

6)对诱导表达产物上清进行SDS-PAGE蛋白电泳,然后进行染色脱色，置于薄层扫描仪进行灰度扫描，通过Labwork软件系统来分析，利用牛血清蛋白做定量对照，来计算样品总蛋白含量及其总蛋白中猪干扰素的有效含量。