CN107286254A

CN107286254A - 犬白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素

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Publication number: CN107286254A
Application number: CN201710676075.5A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 李树启; 高耀辉; 戚仕梅; 赖鹏飞; 周炜; 蒋敏之; 刘家炉
Original assignee: Wuhu Phil Biological Products Industry Research Institute Co Ltd
Current assignee: Wuhu Phil Biological Products Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-10-24
Also published as: CN108840946A

Abstract

本发明公开了犬白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素，将犬白蛋白、犬干扰素α和犬白介素2通过柔性柔性linker连接，得到犬白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组犬长效干扰素，可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高18倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

Description

犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素。将犬白蛋白、犬干扰素α和犬白介素2通过柔性柔性linker连接，得到犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组犬长效干扰素。

背景技术

根据中国宠物行业现状分析，截止到2014年末我国宠物行业的市场规模已经达到1058亿人民币，而中国宠物医疗行业目前仅占约20％，相比较宠物行业相对成熟的美国市场，其宠物医疗的产值比达到50％，中国宠物医疗行业存在巨大的发展空间。

犬是人类忠诚的朋友，随着国内宠物犬等犬类饲养数量的大幅度增加，犬类疾病发病率、死亡率的不断升高，给人类造成精神和经济上的双重损失。犬与人类亲密接触导致人类被犬病毒感染的几率极高，如狂犬病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒等，都会给人类健康带来极大的威胁。

据相关科学研究报道干扰素作为一类重要的细胞因子，在对犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等疾病的治疗中均具有一定的疗效。因此积极研究干扰素在犬病毒性疾病治疗中具有广阔的应用前景。

血清白蛋白是血浆的重要成分，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，是理想的药物载体。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。IFN-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。

细胞因子IL-2即白细胞介素-2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。

而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白及其制备方法，将犬白蛋白、犬干扰素α和犬白介素2通过柔性柔性linker连接，得到犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白。

本发明另一目的在于提供上述犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的编码基因。

本发明还有一个目的在于提供一种长效犬干扰素，利用上述犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白与冻干保护剂混合之后，经冷冻干燥制备得到一种犬长效干扰素，所述犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高18倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

本发明采取的技术方案为：

一种犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本发明还提供的编码犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

所述基因组1和所述基因组2均可编码融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转率效率。利用软件检测发现犬白蛋白、犬IFN-α、犬IL-2原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.25、0.27、0.19，GC百分比为48.8％、59.7％、39.6％；而通过对犬白蛋白、犬IFN-α、犬IL-2基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.97、1.0、1.0，GC百分比50.3％、55.6％、48.8％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。

进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2。

含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本发明的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

本发明还提供了犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

进一步的，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；

进一步的，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2，其制备方法为：

(1)、设计引物，通过反转录获得或人工分别合成连接有柔性linker序列的犬白蛋白、犬干扰素α和犬白细胞介素2的目的基因；通过柔性linker将犬白蛋白、犬干扰素α、犬白细胞介素2的目的基因连接起来，连接后的目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING400〈2〉所示或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示；

(2)、将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

(3)、将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rAlb-IFNα-IL2。

进一步的，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。

进一步的，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

进一步的，所述基因组1的获取方法为：

a.引物设计

犬白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F1：

CGGGATCCATGAAGTGGGTAACTTT，带有BamHI酶切位点；

下游Alb-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGACTAAGGCAGCTTG，带有柔性linker；

犬干扰素α(IFN-α)的引物序列为：

上游IFN-α-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCCCTGCCC，带有柔性linker；

下游IFN-α-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCTTTCCTCCTCCTTACT，带有柔性linker；

犬白细胞介素2(IL-2)的引物序列为：

上游IL-2-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGTACAAAATGCAACTC，带有柔性linker；

下游IL-2-R1：CCCTCGAGAGTCAGTGTTGAGAAG，带有XhoI酶切位点；

b.从犬肝脏中提取RNA，通过反转录获得犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉所示和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

分别以犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因为模板，并分别利用犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的上下游引物进行PCR扩增。

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组RNA 1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接犬Alb和犬IFNα基因，获得Alb-IFNα基因:

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IFN-α模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

d.利用柔性linker连接Alb-IFNα基因和犬IL2基因，获得rAlb-IFNα-IL2基因：

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，Alb-IFNα基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IL-2模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IL-2下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

基因组2是对基因组1进行优化之后，人工合成的基因，所述基因组2的获取方法为：

a.引物设计

犬白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F2：CGGGATCCATGAAATGGGTTACCTT，带有BamHI酶切位点；

下游Alb-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCAACCAGAGCAGCCT，带有柔性linker；

犬干扰素α(IFN-α)的引物序列为：

上游IFN-α-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCTCTGCCGT，带有柔性linker；

下游IFN-α-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCTTTACGACGACGAAC，带有柔性linker；

犬白细胞介素2(IL-2)：

上游IL-2-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGTACAAAATGCAGC，带有柔性linker；

下游IL-2-R2：

CCCTCGAGGGTCAGGGTAGAGAA，带有XhoI酶切位点。

b.所述犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCELISTING 400〈7〉、SEQUENCE LISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示；

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组DNA1.0μL 1.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45S，60℃退火45S，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接犬Alb和犬IFNα基因，获得Alb-IFNα基因:

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IFN-α模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，Alb-IFNα基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IL-2模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IL-2下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了一种犬长效干扰素，所述犬长效干扰素由所述的犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

本发明还提供了所述犬长效干扰素的应用，其半衰期长达72小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.通过柔性linker将犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2基因实现融合表达，提高了干扰素半衰期，与普通干扰素相比，提高了18倍；

2.通过对犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2基因进行优化，提高了犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2融合蛋白的表达量。

3.以重组大肠杆菌pET-32a/Alb-IFNα-IL2作为表达菌株，通过引入分子伴侣pGro7质粒，在蛋白表达时产生包涵体较少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵体变性和复性的过程，大大缩短了融合蛋白表达的时间；

4.本发明公开的由犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2组成的融合蛋白不仅具有IFN-α的广谱抗病毒作用，同时显著提高了犬自身的免疫应答。

附图说明

图1为实施例1中的犬白蛋白基因、犬干扰素α基因与犬白细胞介素2基因RT-PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL2000；泳道1：犬白蛋白基因RT-PCR扩增产物；泳道2：犬干扰素α基因RT-PCR扩增产物；泳道3：犬白介素2基因RT-PCR扩增产物；

图2为实施例1中的犬Alb、IFN-α和IL-2的目的基因连接之后的PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL10000；泳道1：犬白蛋白基因、犬干扰素α基因与犬白介素2基因连接扩增产物；

图3为实施例1中的阳性克隆质粒的PCR扩增及双酶切鉴定结果；泳道M：DNAMarker DL10000；泳道1：重组质粒双酶切结果；泳道2：质粒PCR结果；

图4为实施例1中的重组蛋白的SDS-PAGE电泳检查结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导后的菌体破碎后上清；泳道2：重组菌诱导后的菌体破碎后沉淀；泳道3：空载对照；

图5为实施例1得到的融合蛋白的Western Blot鉴定结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导破碎后沉淀；泳道2：为重组菌诱导破碎后上清；

图6为实施例5中由实施例1中的融合蛋白制得的重组犬长效干扰素α对VSV致细胞病变的抑制作用；1为VSV病毒对照孔；2为HEp-2细胞对照孔；A3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；B3-12为梯度稀释(从右向左)的重组长效犬干扰素α处理孔；

图7为实施例8中由实施例1中的融合蛋白制得的重组犬长效干扰素α肌肉注射血药浓度-时间变化曲线。

具体实施方式

实施例1

犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1.犬白蛋白(Alb)、犬干扰素α(IFN-α)与犬白细胞介素2(IL-2)目的基因的获取与扩增

引物设计：

根据Genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物见表1，在犬白蛋白的上游引物中引入EcoRI酶切位点，在下游引物中引入Linker序列，在犬干扰素α的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列，在犬白细胞介素2的上游引物引入Linker序列，在下游引物中引入SalI酶切位点。

表1 PCR扩增引物

RT-PCR获取目的基因：

从犬肝脏组织中提取RNA，通过反转录获得犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉和SEQUENCELISTING 400〈6〉所示；

RT-PCR反应体系(25μL)见表2

表2 RT-PCR反应体系

RNase Free水	10μL
		dNTP Mix	10μL
反转录酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组RNA	1.5μL

反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1850bp、620bp和490bp左右出现特异条带，其结果如图1所示，说明制备得到了犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表3、表4所示：

表3 Alb-IFN-αPCR反应体系

表4 Alb-IFN-α-IL-2PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2910bp左右出现特异条带，其结果如图2所示，图2中出现了Alb-IFNα和IL-2扩增产物条带，这是因为在Alb-IFNα和IL-2基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序无误后，PCR胶回收产物与pET-32a质粒均使用BamHI和XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表5中的20μL体系做双酶切：

表5双酶切体系

通用buffer	2μL
		限制性内切酶(一对)	1μL+1μL
载体或回收片段	2ul
		RNase Free水	14μL

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表6中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表6酶连体系

目的片段DNA	10μL
		表达载体	3μL
buffer	2μL
		连接酶	1μL
RNase Free水	4μL

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板过夜培养；挑取LB平板上的单菌落进行目的基因PCR鉴定，阳性克隆菌质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示工程菌构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2910bp处检测出单一条带，其结果如图3所示。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，工程菌记为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2；在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD≈1.0)，加入终浓度100μg/ml IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，其结果如图4所示，从图中可以看出，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在125KD左右处可见优势表达条带，说明在沉淀和上清中均成功表达了融合蛋白。

加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3S，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1His亲和层析

粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上，用Binding Buffer Ⅰ(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution buffer Ⅰ(50mM三羟甲基氨基甲烷，20～500mM咪唑，PH8.0)洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.2DEAE阴离子交换层析

将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，PH6.5)中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，再用Binding Buffer Ⅱ过柱至A280nm值稳定后，用Elution Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，PH6.5)线性梯度洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding Buffer Ⅲ(50mMNa₂HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding Buffer Ⅲ洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNα-IL2效价及比活性，比活性≥10⁵IU/mg，蛋白合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由犬白蛋白、犬干扰素α与犬白细胞介素2组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白采用上述方法制备得到。

实施例2

一种犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，制备方法同实施例1，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例1对照，上清液中125KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号V205。

实施例3

一种犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其制备方法如下：

对实施例1中的犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2进行优化，人工合成犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2目的基因，优化后，三者的核苷酸序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈7〉、SEQUENCELISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示。

1.1密码子优化

遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。因此，本实施例中对的犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2基因密码子进行优化。

1.2密码子优化后结果分析

通常密码子适应指数(CAI)＝1.0时被认为该基因在该表达系统中的最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转率效率。利用软件检测发现犬白蛋白、犬IFN-α、犬IL-2原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.25、0.27、0.19，GC百分比为48.8％、59.7％、39.6％；而通过对犬白蛋白、犬IFN-α、犬IL-2基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.97、1.0、1.0，GC百分比50.3％、55.6％、48.8％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

1.3引物设计：

表7 PCR扩增引物

将优化后的犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的基因组DNA分别稀释至0.05mg/mL。利用PCR扩增获得目的基因，25μL反应体系如表8所示：

表8 PCR反应体系

RNase Free水	10.5μL
		dNTP Mix	10.0μL
Taq DNA聚合酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组DNA	1.0μL

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

犬Alb、犬IFN-α与犬IL-2的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别在1850bp、620bp和490bp左右出现特异条带，说明制备得到了优化后的犬Alb、犬IFN-α和犬IL-2的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表9、表10所示：

表9 Alb-IFNαPCR反应体系

表10 rAlb-IFNα-IL2PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2910bp左右出现特异条带，为Alb-IFNα和IL-2扩增产物条带，这是因为在Alb-IFNα和IL-2基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序后无误的PCR的胶回收产物与pET-32a质粒均使用BamHI、XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表11中的20μL体系做双酶切：

表11双酶切体系

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表12中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表12

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的LB平板中过夜培养；取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经BamHI、XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2910bp左右处出现单一条带，说明含有rAlb-IFNα-IL2融合基因的表达载体构建成功。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，工程菌记为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2；在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD≈1.0)，加入终浓度100μg/ml IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在125KD左右处可见优势表达条带，说明在上清和沉淀中均得到了重组蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1His亲和层析

5.2DEAE阴离子交换层析

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding Buffer Ⅲ(50mMNa₂HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding BufferⅢ洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNα-IL2效价及比活性，比活性≥10⁵IU/mg，蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由犬白蛋白、犬干扰素α与犬白细胞介素2组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

实施例4

一种犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其他同实施例3，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例3对照，上清液中125KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

实施例5

一种犬长效干扰素，由实施例1、2、3、4中的融合蛋白分别与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例6

实施例1～4得到的犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的鉴定

6.1蛋白含量的定量检测

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定实施例1～4得到的融合蛋白浓度分别2.5mg/ml、2.4mg/ml、2.6mg/ml、2.6mg/ml。

6.2 SDS-PAGE电泳检测

与空菌相比，融合蛋白在125KD左右有一条浓染的新增蛋白条带，如图4所示。

6.3 Western Blot结果

分别检测实施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗犬α干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:10000稀释)。重组长效犬干扰素样品能与抗犬干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，125KD左右处出现特异性条带，如图5所示。

实施例7

实施例5中的四份犬长效犬干扰素冻干剂的效价检测

按照微量细胞病变抑制法，用培养基将Hep-2细胞配成5×10⁵细胞/ml细胞悬浮液，每孔接种0.1ml移入96孔细胞培养板。37℃、5％CO₂培养24h，加入不同剂量的重组长效犬干扰素，24h后吸弃，再分别接种100TCID50VSV病毒。

试验结果

结果表明获得的重组长效犬干扰素对VSV引起HEp-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组长效犬干扰素处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥10⁵IU/ml，如图6所示。

实施例8

实施例5中的分别由实施例1～4的融合蛋白得到的四份重组长效犬干扰素冻干剂(分别记为A、B、C、D)在犬体内的半衰期的测定

A为实施例1制备的冻干剂、B为实施例2制备的冻干剂、C为实施例3制备的冻干剂、D为实施例4制备的冻干剂。

细胞病变抑制法测定rAlb-IFNα-IL2的血药浓度与时间关系

取六只体重大致相同的肉犬(雌雄各半)，颈部皮下注射2mg/ml重组犬长效干扰素α冻干剂2ml，分别在1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h静脉采血，血样4℃凝固，3500rpm低温离心10min分离血清，各时点每只犬血样于-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中rAlb-IFNα-IL2的浓度，用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表13。

表13重组长效犬干扰素α肌肉注射后血清中主要动力学参数

结果表明重组长效犬干扰素有较长的半衰期。经测定半衰期能达到72h左右，较普通干扰素提高约18倍。

实施例9

实施例5中的四份重组长效犬干扰素冻干剂对犬细胞免疫应答影响的测定

取六只体重大致相同的肉犬分为两组，记为实验组和对照组；实验组颈部皮下注射2mg/ml重组长效犬干扰素冻干剂2ml，对照组颈部皮下注射2mL的PBS，取注射4周后犬外周血，之后每周取一次血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，淋巴细胞经过无血清RPMI1640培养基洗2次后，用完全培养基重悬、调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，24孔细胞培养板每孔加入1ml淋巴细胞，37℃，5％CO₂培养72h，收集淋巴细胞培养时上清。ELISA检测培养上清中IFNγ、IL-4含量，按试剂盒说明书进行，检测结果如表14所示：

表14 ELISA检测各组犬细胞免疫应答水平

结果表明注射重组长效犬干扰素后，能够显著提高犬外周血中细胞因子IFNγ、IL-4的含量，增强了细胞免疫应答水平，显著提高免疫力水平。

上述参照实施例对一种犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

<120> 犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 970

<212> PRT

<213> 融合蛋白

<400> 1

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Leu Val Arg Arg Glu Ala Tyr Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu

35 40 45

Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Ala Lys Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Ala Cys Ala Ala Glu

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Asp Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Asp Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ala

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Pro Pro Leu Val Ala Pro Glu Pro

130 135 140

Asp Ala Leu Cys Ala Ala Phe Gln Asp Asn Glu Gln Leu Phe Leu Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Gln Tyr Lys Gly Val Phe Ala Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Gly Pro Lys Ile Glu Ala

195 200 205

Leu Arg Glu Lys Val Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Phe Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile Ser

245 250 255

Lys Val Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Val Glu Arg Asp

305 310 315 320

Glu Leu Pro Gly Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Thr Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Lys Leu Gly Lys Val Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys

450 455 460

Pro Glu Ser Glu Arg Met Ser Cys Ala Glu Asp Phe Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Gly Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu

530 535 540

Lys Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asn Lys Glu Gly Cys Phe

580 585 590

Ser Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Val

595 600 605

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Leu Pro Cys Ser

610 615 620

Phe Ser Val Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys His Ser Leu Cys Cys Leu

625 630 635 640

Ala Cys Asp Leu Pro Asp Thr His Ser Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu

645 650 655

Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Ser Ser Cys Asp His

660 665 670

Tyr Thr Thr Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg

675 680 685

Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys

690 695 700

Val Phe His Leu Phe Cys Thr Asn Met Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met

705 710 715 720

Thr Leu Leu Gly Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp

725 730 735

Leu Asp Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu

740 745 750

Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu

755 760 765

Tyr Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg

770 775 780

Ala Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Leu Thr Ile Leu Gln Glu Arg

785 790 795 800

Val Arg Arg Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met

805 810 815

Tyr Lys Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Thr Leu Val Leu Val

820 825 830

Ala Asn Ser Ala Pro Ile Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Glu Gln

835 840 845

Gln Met Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Asn Gly Val

850 855 860

Asn Asn Tyr Glu Asn Pro Gln Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

865 870 875 880

Tyr Thr Pro Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln Cys Leu Ala

885 890 895

Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu Gly Leu Pro Gln Ser Lys

900 905 910

Asn Val His Leu Thr Asp Thr Lys Glu Leu Ile Ser Asn Met Asn Val

915 920 925

Thr Leu Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Asn Cys Glu Tyr

930 935 940

Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr

945 950 955 960

Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr

965 970

<210> 2

<211> 2910

<212> DNA

<213> 基因组1

<400> 2

atgaagtggg taacttttat ttccctcttc tttctcttta gctctgctta ttccaggggc 60

ttggttcgac gagaagcata taagagtgag attgctcatc ggtacaatga tttgggagaa 120

gaacatttca gaggcctggt gctggttgcc ttttctcagt atctccagca gtgtccattt 180

gaggatcatg tgaaactagc caaggaagtg actgagtttg caaaagcctg tgctgctgaa 240

gagtcagggg ccaactgtga caaatccctt cacaccctgt tcggggacaa gctgtgcacg 300

gtggcctccc tccgggacaa gtacggggac atggccgact gctgcgagaa gcaggagccc 360

gacaggaacg agtgcttcct ggcgcacaag gacgacaacc cgggcttccc cccgctggtg 420

gcccccgagc ccgacgcgct gtgcgccgcc ttccaggaca acgagcagct gttcctgggg 480

aagtacctgt acgaaattgc cagaagacat ccgtacttct acgccccaga actcctgtac 540

tatgctcaac agtataaagg agtctttgcg gagtgctgcc aggccgcaga caaggccgcc 600

tgcctgggac ccaagattga ggctttgagg gaaaaagtac tgctttcatc tgccaaggag 660

agattcaagt gtgccagcct ccaaaaattc ggagatagag cctttaaagc ctggtcagta 720

gctcgcctga gccagcgatt tcccaaagct gactttgcag agatctccaa ggtggtgaca 780

gatcttacca aagtccacaa ggaatgctgc catggtgacc tgctggagtg tgcagatgac 840

agggcggatc ttgccaagta tatgtgtgaa aatcaagatt caatctccac taaactgaag 900

gaatgctgtg ataagcctgt gttggaaaaa tcccagtgtc ttgctgaggt ggaaagagat 960

gagttacctg gtgacctgcc ctcattagct gctgattttg ttgaagataa ggaggtttgc 1020

aaaaactatc aggaggcaaa ggatgtgttc ctgggcacgt ttttgtatga atacgcaaga 1080

aggcatccag agtactctgt ctcattgctt ttgagactcg ccaaggaata tgaagccaca 1140

ctagagaaat gctgtgccac cgatgatcct cctacatgct atgccaaagt gcttgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggatga gcctcagaat ttagtcaaaa caaactgtga actttttgaa 1260

aaacttggag agtatggctt ccaaaatgcg ctcttagttc gttacaccaa gaaagcaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct cgtggaggtc tcaagaaaac taggaaaagt gggcaccaaa 1380

tgttgtaaga aacctgaatc agagagaatg tcctgtgctg aagactttct gtccgtggtc 1440

ctgaaccggt tgtgtgtgtt gcacgagaag accccagtga gcgagagagt taccaaatgc 1500

tgctcagagt ccttggtgaa cagacgacca tgcttttctg gtctggaagt cgatgagacc 1560

tatgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcactttcc atgcagattt atgcacactt 1620

cctgaggctg agaaacaagt caagaaacaa actgcacttg ttgaactgct gaaacacaag 1680

cccaaggcaa cagatgaaca actgaaaact gttatgggag attttggagc ctttgtagag 1740

aagtgctgcg cagctgaaaa taaagagggc tgcttttctg aagagggtcc aaaactcgtt 1800

gctgctgctc aagctgcctt agtcggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctatggcc 1860

ctgccctgct ccttctcggt ggccctggtg ctgctcagct gccactccct gtgctgtctg 1920

gcttgcgacc tgcccgacac ccacagcctg cgcaactgga gggtcctgac gctcctggga 1980

cagatgagga gactctccgc cagctcttgt gaccactaca ccactgactt tgccttcccc 2040

aaggaactgt ttgatggcca gcggctccag gaggcgcaag ccctctctgt ggtccacgtg 2100

atgacccaga aggtcttcca cctcttctgc acgaacatgt cctctgctcc ttggaacatg 2160

accctcctgg gggaattgtg ctcggggctc tctgagcagc tggatgacct ggatgcctgt 2220

cccctgcagg aggcagggct ggccgagacc cccctcatgc atgaagactc caccctgagg 2280

acctacttcc aaaggatctc cctctacctg caagacagga accacagccc gtgtgcctgg 2340

gagatggtcc gagcagaaat cgggagatcc ttcttctcct tgaccatctt gcaagaaaga 2400

gtaaggagga ggaaaggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctatgta caaaatgcaa 2460

ctcttgtctt gcatcgcact gacgcttgta cttgtcgcaa acagtgcacc tattacttca 2520

agctctacaa aggaaacaga gcaacagatg gagcaattac tgctggattt acagttgctt 2580

ttgaatggag ttaataatta tgagaacccc caactctcca ggatgctcac atttaagttt 2640

tacacgccca agaaggccac agaatttaca caccttcaat gtctagcaga agaactcaaa 2700

aacctggagg aagtgctagg tttacctcaa agcaaaaacg ttcacttgac agacaccaag 2760

gaattaatca gcaatatgaa tgtaacactt ctgaaactaa agggatctga aacaagttac 2820

aactgtgaat atgatgacga gacagcaacc attacagaat ttctgaacaa atggattacc 2880

ttttgtcaaa gcatcttctc aacactgact 2910

<210> 3

<211> 2910

<212> DNA

<213> 基因组2

<400> 3

atgaaatggg ttaccttcat ctctctgttc ttcctgttct cttctgctta ctctcgtggt 60

ctggttcgtc gtgaagctta caaatctgaa atcgctcacc gttacaacga cctgggtgaa 120

gaacacttcc gtggtctggt tctggttgct ttctctcagt acctgcagca gtgcccgttc 180

gaagaccacg ttaaactggc taaagaagtt accgaattcg ctaaagcttg cgctgctgaa 240

gaatctggtg ctaactgcga caaatctctg cacaccctgt tcggtgacaa actgtgcacc 300

gttgcttctc tgcgtgacaa atacggtgac atggctgact gctgcgaaaa acaggaaccg 360

gaccgtaacg aatgcttcct ggctcacaaa gacgacaacc cgggtttccc gccgctggtt 420

gctccggaac cggatgctct gtgcgctgcg ttccaggaca acgagcagct gttcctgggt 480

aaatacctgt acgaaatcgc tcgtcgtcac ccgtacttct acgctccgga actgctgtac 540

tacgctcagc agtacaaagg tgttttcgct gaatgctgcc aggctgctga caaagctgct 600

tgcctgggtc cgaaaatcga agctctgcgt gaaaaagttc tgctgtcttc tgctaaagaa 660

cgtttcaaat gcgcttctct gcagaaattc ggtgaccgtg ctttcaaagc ttggtctgtt 720

gctcgtctgt cgcagaggtt cccgaaagct gacttcgctg aaatctctaa agttgttacc 780

gacctgacca aagttcacaa agaatgctgc cacggtgacc tgctggaatg cgctgacgac 840

cgtgctgacc tggctaaata catgtgcgaa aaccaggact ctatctctac caaactgaaa 900

gaatgctgcg acaaaccggt tctggaaaaa tctcagtgcc tggctgaagt tgaacgtgac 960

gaactgccgg gtgacctgcc gtctctggct gctgacttcg ttgaagataa ggaagtgtgc 1020

aagaactacc aggaagctaa agacgttttc ctgggtacct tcctgtacga atacgctcgt 1080

cgtcacccgg aatactctgt ttctctgctg ctgcgtctgg ctaaagaata cgaagctacc 1140

ctggaaaaat gctgcgctac cgacgacccg ccgacctgct acgctaaagt tctggacgaa 1200

ttcaaaccgc tggttgacga accgcagaac ctggttaaaa ccaactgcga actgttcgaa 1260

aaactgggtg aatacggttt ccagaacgct ctgctggttc gttacaccaa aaaagctccg 1320

caggtttcta ccccgaccct ggttgaagtt tctcgtaaac tgggtaaagt tggtaccaaa 1380

tgctgcaaaa aaccggaatc tgaacgtatg tcttgcgctg aagacttcct gtctgttgtt 1440

ctgaaccgtc tgtgcgttct gcacgaaaaa accccggttt ctgaacgtgt taccaaatgc 1500

tgctctgaat ctctggttaa ccgtcgtccg tgcttctctg gtctggaagt tgacgaaacc 1560

tacgttccga aagaattcaa cgctgaaacc ttcaccttcc acgctgacct gtgcaccctg 1620

ccggaagctg aaaaacaggt taaaaaacag accgctctgg ttgaactgct gaaacacaaa 1680

ccgaaagcta ccgacgaaca gctgaaaacc gttatgggtg acttcggtgc tttcgttgaa 1740

aaatgctgcg ctgctgaaaa caaagaaggt tgcttctctg aagaaggtcc gaaactggtt 1800

gctgctgctc aggctgctct ggttggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctatggct 1860

ctgccgtgct ctttctctgt tgctctggtt ctgctgtctt gccactctct gtgctgcctg 1920

gcttgcgacc tgccggacac ccactctctg cgtaactggc gtgttctgac cctgctgggt 1980

cagatgcgtc gtctgtctgc ttcttcttgc gaccactaca ccaccgactt cgctttcccg 2040

aaagaactgt tcgacggtca gcgtctgcag gaagctcagg ctctgtctgt tgttcacgtt 2100

atgacccaga aagttttcca cctgttctgc accaacatgt cttctgctcc gtggaacatg 2160

accctgctgg gtgaactgtg ctctggtctg tctgaacagc tggacgacct ggacgcttgc 2220

ccgctgcagg aagctggtct ggctgaaacc ccgctgatgc acgaagactc taccctgcgt 2280

acctacttcc agcgtatctc tctgtacctg caggaccgta accactctcc gtgcgcttgg 2340

gaaatggttc gtgctgaaat cggtcgttct ttcttctctc tgaccatcct gcaggaacgt 2400

gttcgtcgtc gtaaaggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctatgta caaaatgcag 2460

ctgctgtctt gcatcgctct gaccctggtt ctggttgcta actctgctcc gatcacctct 2520

tcttctacca aagaaaccga acagcagatg gaacagctgc tgctggacct gcagctgctg 2580

ctgaacggtg ttaacaacta cgaaaacccg cagctgtctc gtatgctgac cttcaaattc 2640

tacaccccga aaaaagctac cgaattcacc cacctgcagt gcctggctga agaactgaaa 2700

aacctggaag aagttctggg tctgccgcag tctaaaaacg ttcacctgac cgacaccaaa 2760

gaactgatct ctaacatgaa cgttaccctg ctgaaactga aaggttctga aacctcttac 2820

aactgcgaat acgacgacga aaccgctacc atcaccgaat tcctgaacaa atggatcacc 2880

ttctgccagt ctatcttctc taccctgacc 2910

<210> 4

<211> 1824

<212> DNA

<213> 优化前犬白蛋白基因序列

<400> 4

atgaagtggg taacttttat ttccctcttc tttctcttta gctctgctta ttccaggggc 60

ttggttcgac gagaagcata taagagtgag attgctcatc ggtacaatga tttgggagaa 120

gaacatttca gaggcctggt gctggttgcc ttttctcagt atctccagca gtgtccattt 180

gaggatcatg tgaaactagc caaggaagtg actgagtttg caaaagcctg tgctgctgaa 240

gagtcagggg ccaactgtga caaatccctt cacaccctgt tcggggacaa gctgtgcacg 300

gtggcctccc tccgggacaa gtacggggac atggccgact gctgcgagaa gcaggagccc 360

gacaggaacg agtgcttcct ggcgcacaag gacgacaacc cgggcttccc cccgctggtg 420

gcccccgagc ccgacgcgct gtgcgccgcc ttccaggaca acgagcagct gttcctgggg 480

aagtacctgt acgaaattgc cagaagacat ccgtacttct acgccccaga actcctgtac 540

tatgctcaac agtataaagg agtctttgcg gagtgctgcc aggccgcaga caaggccgcc 600

tgcctgggac ccaagattga ggctttgagg gaaaaagtac tgctttcatc tgccaaggag 660

agattcaagt gtgccagcct ccaaaaattc ggagatagag cctttaaagc ctggtcagta 720

gctcgcctga gccagcgatt tcccaaagct gactttgcag agatctccaa ggtggtgaca 780

gatcttacca aagtccacaa ggaatgctgc catggtgacc tgctggagtg tgcagatgac 840

agggcggatc ttgccaagta tatgtgtgaa aatcaagatt caatctccac taaactgaag 900

gaatgctgtg ataagcctgt gttggaaaaa tcccagtgtc ttgctgaggt ggaaagagat 960

gagttacctg gtgacctgcc ctcattagct gctgattttg ttgaagataa ggaggtttgc 1020

aaaaactatc aggaggcaaa ggatgtgttc ctgggcacgt ttttgtatga atacgcaaga 1080

aggcatccag agtactctgt ctcattgctt ttgagactcg ccaaggaata tgaagccaca 1140

ctagagaaat gctgtgccac cgatgatcct cctacatgct atgccaaagt gcttgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggatga gcctcagaat ttagtcaaaa caaactgtga actttttgaa 1260

aaacttggag agtatggctt ccaaaatgcg ctcttagttc gttacaccaa gaaagcaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct cgtggaggtc tcaagaaaac taggaaaagt gggcaccaaa 1380

tgttgtaaga aacctgaatc agagagaatg tcctgtgctg aagactttct gtccgtggtc 1440

ctgaaccggt tgtgtgtgtt gcacgagaag accccagtga gcgagagagt taccaaatgc 1500

tgctcagagt ccttggtgaa cagacgacca tgcttttctg gtctggaagt cgatgagacc 1560

tatgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcactttcc atgcagattt atgcacactt 1620

cctgaggctg agaaacaagt caagaaacaa actgcacttg ttgaactgct gaaacacaag 1680

cccaaggcaa cagatgaaca actgaaaact gttatgggag attttggagc ctttgtagag 1740

aagtgctgcg cagctgaaaa taaagagggc tgcttttctg aagagggtcc aaaactcgtt 1800

gctgctgctc aagctgcctt agtc 1824

<210> 5

<211> 561

<212> DNA

<213> 优化前犬IFN-α基因序列

<400> 5

atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgc tcagctgcca ctccctgtgc 60

tgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggt cctgacgctc 120

ctgggacaga tgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgcc 180

ttccccaagg aactgtttga tggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc 240

cacgtgatga cccagaaggt cttccacctc ttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg 300

aacatgaccc tcctggggga attgtgctcg gggctctctg agcagctgga tgacctggat 360

gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggcc gagacccccc tcatgcatga agactccacc 420

ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaag acaggaacca cagcccgtgt 480

gcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgac catcttgcaa 540

gaaagagtaa ggaggaggaa a 561

<210> 6

<211> 465

<212> DNA

<213> 优化前犬IL-2基因序列

<400> 6

atgtacaaaa tgcaactctt gtcttgcatc gcactgacgc ttgtacttgt cgcaaacagt 60

gcacctatta cttcaagctc tacaaaggaa acagagcaac agatggagca attactgctg 120

gatttacagt tgcttttgaa tggagttaat aattatgaga acccccaact ctccaggatg 180

ctcacattta agttttacac gcccaagaag gccacagaat ttacacacct tcaatgtcta 240

gcagaagaac tcaaaaacct ggaggaagtg ctaggtttac ctcaaagcaa aaacgttcac 300

ttgacagaca ccaaggaatt aatcagcaat atgaatgtaa cacttctgaa actaaaggga 360

tctgaaacaa gttacaactg tgaatatgat gacgagacag caaccattac agaatttctg 420

aacaaatgga ttaccttttg tcaaagcatc ttctcaacac tgact 465

<210> 7

<211> 1824

<212> DNA

<213> 优化后犬白蛋白基因序列

<400> 7

atgaaatggg ttaccttcat ctctctgttc ttcctgttct cttctgctta ctctcgtggt 60

ctggttcgtc gtgaagctta caaatctgaa atcgctcacc gttacaacga cctgggtgaa 120

gaacacttcc gtggtctggt tctggttgct ttctctcagt acctgcagca gtgcccgttc 180

gaagaccacg ttaaactggc taaagaagtt accgaattcg ctaaagcttg cgctgctgaa 240

gaatctggtg ctaactgcga caaatctctg cacaccctgt tcggtgacaa actgtgcacc 300

gttgcttctc tgcgtgacaa atacggtgac atggctgact gctgcgaaaa acaggaaccg 360

gaccgtaacg aatgcttcct ggctcacaaa gacgacaacc cgggtttccc gccgctggtt 420

gctccggaac cggatgctct gtgcgctgcg ttccaggaca acgagcagct gttcctgggt 480

aaatacctgt acgaaatcgc tcgtcgtcac ccgtacttct acgctccgga actgctgtac 540

tacgctcagc agtacaaagg tgttttcgct gaatgctgcc aggctgctga caaagctgct 600

tgcctgggtc cgaaaatcga agctctgcgt gaaaaagttc tgctgtcttc tgctaaagaa 660

cgtttcaaat gcgcttctct gcagaaattc ggtgaccgtg ctttcaaagc ttggtctgtt 720

gctcgtctgt cgcagaggtt cccgaaagct gacttcgctg aaatctctaa agttgttacc 780

gacctgacca aagttcacaa agaatgctgc cacggtgacc tgctggaatg cgctgacgac 840

cgtgctgacc tggctaaata catgtgcgaa aaccaggact ctatctctac caaactgaaa 900

gaatgctgcg acaaaccggt tctggaaaaa tctcagtgcc tggctgaagt tgaacgtgac 960

gaactgccgg gtgacctgcc gtctctggct gctgacttcg ttgaagataa ggaagtgtgc 1020

aagaactacc aggaagctaa agacgttttc ctgggtacct tcctgtacga atacgctcgt 1080

cgtcacccgg aatactctgt ttctctgctg ctgcgtctgg ctaaagaata cgaagctacc 1140

ctggaaaaat gctgcgctac cgacgacccg ccgacctgct acgctaaagt tctggacgaa 1200

ttcaaaccgc tggttgacga accgcagaac ctggttaaaa ccaactgcga actgttcgaa 1260

aaactgggtg aatacggttt ccagaacgct ctgctggttc gttacaccaa aaaagctccg 1320

caggtttcta ccccgaccct ggttgaagtt tctcgtaaac tgggtaaagt tggtaccaaa 1380

tgctgcaaaa aaccggaatc tgaacgtatg tcttgcgctg aagacttcct gtctgttgtt 1440

ctgaaccgtc tgtgcgttct gcacgaaaaa accccggttt ctgaacgtgt taccaaatgc 1500

tgctctgaat ctctggttaa ccgtcgtccg tgcttctctg gtctggaagt tgacgaaacc 1560

tacgttccga aagaattcaa cgctgaaacc ttcaccttcc acgctgacct gtgcaccctg 1620

ccggaagctg aaaaacaggt taaaaaacag accgctctgg ttgaactgct gaaacacaaa 1680

ccgaaagcta ccgacgaaca gctgaaaacc gttatgggtg acttcggtgc tttcgttgaa 1740

aaatgctgcg ctgctgaaaa caaagaaggt tgcttctctg aagaaggtcc gaaactggtt 1800

gctgctgctc aggctgctct ggtt 1824

<210> 8

<211> 561

<212> DNA

<213> 优化后犬IFN-α基因序列

<400> 8

atggctctgc cgtgctcttt ctctgttgct ctggttctgc tgtcttgcca ctctctgtgc 60

tgcctggctt gcgacctgcc ggacacccac tctctgcgta actggcgtgt tctgaccctg 120

ctgggtcaga tgcgtcgtct gtctgcttct tcttgcgacc actacaccac cgacttcgct 180

ttcccgaaag aactgttcga cggtcagcgt ctgcaggaag ctcaggctct gtctgttgtt 240

cacgttatga cccagaaagt tttccacctg ttctgcacca acatgtcttc tgctccgtgg 300

aacatgaccc tgctgggtga actgtgctct ggtctgtctg aacagctgga cgacctggac 360

gcttgcccgc tgcaggaagc tggtctggct gaaaccccgc tgatgcacga agactctacc 420

ctgcgtacct acttccagcg tatctctctg tacctgcagg accgtaacca ctctccgtgc 480

gcttgggaaa tggttcgtgc tgaaatcggt cgttctttct tctctctgac catcctgcag 540

gaacgtgttc gtcgtcgtaa a 561

<210> 9

<211> 465

<212> DNA

<213> 优化后犬IL-2基因序列

<400> 9

atgtacaaaa tgcagctgct gtcttgcatc gctctgaccc tggttctggt tgctaactct 60

gctccgatca cctcttcttc taccaaagaa accgaacagc agatggaaca gctgctgctg 120

gacctgcagc tgctgctgaa cggtgttaac aactacgaaa acccgcagct gtctcgtatg 180

ctgaccttca aattctacac cccgaaaaaa gctaccgaat tcacccacct gcagtgcctg 240

gctgaagaac tgaaaaacct ggaagaagtt ctgggtctgc cgcagtctaa aaacgttcac 300

ctgaccgaca ccaaagaact gatctctaac atgaacgtta ccctgctgaa actgaaaggt 360

tctgaaacct cttacaactg cgaatacgac gacgaaaccg ctaccatcac cgaattcctg 420

aacaaatgga tcaccttctg ccagtctatc ttctctaccc tgacc 465

Claims

1.犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1。

2.一种编码如权利要求1所述的犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。

5.权利要求1所述的犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将含有核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示的基因组1或核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示的基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2，其制备方法为：

(2)、将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

9.一种犬长效干扰素，其特征在于，所述犬长效干扰素由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

10.根据权利要求9所述的犬长效干扰素，其特征在于，所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖。