CN112143749A

CN112143749A - 一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用

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Publication number: CN112143749A
Application number: CN202010880537.7A
Authority: CN
Inventors: 李振义; 杜金玲; 白俊岩
Original assignee: Beijing Yinong Biotechnology Co ltd; Yantai Baoying Biotechnology Co ltd; Beijing Baoyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Baoyi Biotechnology Co ltd; Beijing Yinong Biotechnology Co ltd; Hebei Baoying Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112143749B

Abstract

本发明公开了一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用，其特征在于，所述方法包括将犬α‑干扰素基因通过linker与犬SETD2基因连接形成编码CaIFN‑α‑SETD2的融合基因，将所述CaIFN‑α‑SETD2的融合基因经酶切、连接，导入大肠杆菌，得到重组表达菌，所述重组表达菌可诱导表达CaIFN‑α‑SETD2融合蛋白。本发明的试验证明：本发明制备的长效重组犬干扰素制品是一种高效、长效、广谱的抗犬病毒类药物制品，其是通过犬干扰素基因和SETD2蛋白进行融合表达，一方面提高干扰素蛋白分子量，延长了干扰素制品的半衰期，同时融合蛋白中的SETD2也在干扰素抗病毒免疫过程中起到正向调节作用，增强了干扰素抗病毒能力。

Description

一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是1957年英国和瑞士科学家在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现的一种细胞因子，并根据其可干扰病毒的复制而命名。干扰素家族主要分为三个亚家族：即Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)、Ⅱ型干扰素(IFN-Ⅱ)、Ⅲ型干扰素(IFN-Ⅲ)。其中，Ⅰ型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应细胞因子，由宿主天然免疫细胞在识别病毒后产生并分泌，包括IFN-α(13种亚型)、IFNβ、IFNε、IFNτ、IFNκ、IFNω、IFNδ和IFNζ等多种类型。

Ⅰ型IFN-α/β主要在病毒、双链RNA、多肽、细菌脂多糖以及细胞因子的诱导下由成纤维细胞、淋巴细胞及浆细胞样树突状细胞产生。其发挥抗病毒功能主要通过诱导细胞内JAK-STAT信号活化并激活干扰素诱导基因(IFN-stimulated gene,ISG)表达来实现。IFN主要通过与细胞膜上的相应受体(IFNAR)结合来激活细胞内的酪氨酸激酶JAK家族，首先催化JAK1和TYK2发生磷酸化；JAK1和TYK2是结合在IFNAR胞内段的激酶，JAK家族被激活的激酶反过来再使IFN受体酪氨酸残基发生磷酸化。IFN-α/β黏附STAT1-STAT2二聚体和干扰素调节因子9，形成干扰素刺激基因因子3(ISGF3)，转位进入细胞核与存在于IFN-α/β诱导基因启动子或增强子中的干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response element)顺式作用元件结合，调控相关基因的表达。最终实现其抗病毒免疫反应。不同种类IFN的诱导因素不同，所结合的受体种类及其详细的信号转导途径也不尽相同。IFN可诱导数百种ISG产物来抑制许多不同家族的RNA和DNA病毒。而这些产物中有部分直接具有抗病毒活性，还有部分则参与对其他有抗病毒活性部分ISG的调节，ISG编码的蛋白在病毒感染宿主的不同阶段发挥着抗病毒功能。

组蛋白甲基转移酶SETD2，由2564个氨基酸组成，分子量约300kDa。成熟的SETD2蛋白主要是由6个亚单位组成：(1)AWS结构域(2)SET结构域(3)PostSET结构域(4)Asp-B-Hydre_N结构域(5)C-端的WW结构域(6)SRI结构域。6个亚单位中，与功能相关的结构域是位于C末端的WW及SRI结构域和中间的SET结构域。SETD2是IFN-α介导的抗病毒免疫过程中的一个关键的正向调节因子。SETD2同时通过翻译后修饰和表观遗传修饰两种机制共同介导IFN信号通路的调控，SETD2通过其具有甲基转移酶活性的SET结构域促进IFN-α下游STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰，进而促进JAK1与STAT1的相互作用，增强JAK1介导的STAT1的磷酸化修饰，促进STAT1的磷酸化激活，增强其与DNA结合能力，上调抗病毒基因ISGs的表达。同时，SETD2也直接参与调控一些ISGs基因启动子远端的区域具有转录活化标志的H3K36me3的修饰，进一步促进并维持基因的转录，从而促进IFN的抗病毒免疫反应。综上，亟待研发一种长效重组犬干扰素制品及其制备方法与应用。

发明内容

为此，本发明提供一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种长效重组犬干扰素的制备方法，所述方法包括将犬α-干扰素基因通过linker与犬SETD2基因连接形成编码CaIFN-α-SETD2的融合基因，将所述CaIFN-α-SETD2的融合基因经酶切、连接，导入大肠杆菌，得到重组表达菌，所述重组表达菌可诱导表达CaIFN-α-SETD2融合蛋白。

本发明的一个实施例中，所述CaIFN-α-SETD2的融合基因为如下a1)或a2)或a3)：

a1)如SEQ ID NO：2所示的序列；

a2)严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述CaIFN-α-SETD2融合蛋白的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述CaIFN-α-SETD2融合蛋白的DNA分子。

本发明的一个实施例中，所述CaIFN-α-SETD2融合基因通过重组表达载体pET-CaIFN-α-SETD2导入所述大肠杆菌；

所述重组表达载体pET-CaIFN-α-SETD2为将所述CaIFN-α-SETD2融合基因的DNA分子替换Xho I和Nde I酶切位点之间的小片段得到的载体。

本发明的一个实施例中，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID.3所示。

本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌为BL21。

本发明的一个实施例中，所述将重组表达菌接种至含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜；

将过夜培养的菌液按培养基量的2％接种于灭菌发酵罐中，37℃通气培养，控制发酵罐搅拌速度500～700r/min、溶氧为60～90％，pH值7.0；

待重组表达菌生长至对数生长中期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下诱导5h，将发酵产物纯化，得到所述CaIFN-α-SETD2融合蛋白。

本发明还提供一种长效重组犬干扰素制品，其包括稳定剂、甲基纤维素以及上述所述方法制备的CaIFN-α-SETD2融合蛋白。

上述所述的方法制备得到的长效重组犬干扰素在如下b1)、b2)、b3)或b4)应用，b1)制备抗犬细小病毒病的产品；b2)制备抗犬瘟热病毒病的产品；b3)制备抗犬副流感病毒病的产品；b4)制备抗犬腺病毒病的产品，也属于本发明保护的范围。

本发明具有如下优点：

本发明的试验证明：本发明制备的长效重组犬干扰素制品是一种高效、长效、广谱的抗犬病毒类药物制品，其是通过犬干扰素基因和SETD2蛋白进行融合表达，一方面提高干扰素蛋白分子量，延长了干扰素制品的半衰期，同时融合蛋白中的SETD2也在干扰素抗病毒免疫过程中起到正向调节作用，增强了干扰素抗病毒能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的CaIFN-α-SETD2的融合基因重组表质粒酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DL5000marker；1:酶切片段；2：水对照；

图2为本发明实施例提供的重组表达蛋白CaIFN-α-SETD2融合蛋白的western-blot鉴定图，其中，M：蛋白Marker；1：重组菌；7：未诱导表达菌体；

图3为本发明实施例提供的96孔细胞培养板加样示意图；

图4为本发明实施例提供本发明CaIFN-α-SETD2融合蛋白在血液中的浓度变化曲线。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、CaIFN-α-SETD2融合基因的设计与合成

1、根据GenBank已公布的犬α-干扰素基因序列(Genbank：NP_001006655.1)和犬SETD2基因序列(Genbank：XP_864158.1)，将两个基因以linker GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC)串联，参照大肠杆菌偏爱性进行密码子优化，并在5'端和3'端分别加入NdeI酶切位点CATATG和XhoI酶切位点CTCGAG，人工合成编码CaIFN-α-SETD2的融合基因。合成CaIFN-α-SETD2的融合基因序列如SEQ ID NO.2所示。CaIFN-α-SETD2的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、pET-CaIFN-α-SETD2融合表达载体的构建

(1)目的基因酶切：用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的CaIFN-α-SETD2基因双酶切，酶切体系(20μl)：干扰素基因1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH₂O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒进行回收并纯化。

(2)载体酶切：选用载体pET30a(+)，用限制性内切酶Nde I和Xho I对载体pET30a(+)双酶切，酶切体系(20μl)：pET30a(+)1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH₂O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。

(3)目的基因与载体的连接：将CaIFN-α-SETD2基因酶切产物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接，连接体系(10μl)：10×Buffer 1μl，pET30a(+)酶切产物2μl，干扰素基因酶切产物2μl，T4 DNA连接酶1μl，ddH₂O 4μl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。

(4)转化：取10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500μl，于37℃，200r/min培养1h，取100μl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。

(5)质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，用Nde I与Xho I双酶切重组质粒，经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载体条带和3717bp的外源片段，大小与预期完全符合，电泳结果见图1。重组质粒命名为pET-CaIFN-α-SETD2。

3、发酵培养：pET-CaIFN-α-SETD2质粒转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种至适量的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜；菌液按培养基量的2％接种于灭菌发酵罐中，37℃通气培养，控制发酵罐搅拌速度500～700r/min、溶氧为60～90％，pH值7.0；待菌体生长至对数生长中期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下诱导5h。

4、菌体破碎

培养结束后，离心收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次，制成10％的PBS悬液，在2～8℃下用高压匀浆机破碎细菌，破碎后的菌液，以8000r/min离心15分钟，收集包涵体。

5、重组蛋白的纯化

用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体，磁力搅拌器洗涤30分钟，4℃条件下，8000r/min离心10分钟，去上清后重复洗涤一次。加入8mol/L尿素溶解洗涤包涵体，于冰浴中超声清洗30分钟，8000r/min离心20分钟去沉淀，取上清即为包涵体溶解液，溶液4℃过夜，将溶液在超滤复性设备上进行复性，按5～10体积换液，复性结束后，经8000r/min，离心去沉淀，收集上清液就是所需蛋白溶液，将蛋白液以0.3ml/min的速度加入层析柱中，用pH 7.0磷酸盐缓冲液以1ml/min的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰，0.22μm的滤膜过滤除菌。采用紫外分光光度计法，测定蛋白含量≥3.8mg/ml。

6、重组蛋白的western-blot鉴定

上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后，经100V，70min转至PVDF膜，TBST洗膜2次，1％BSA封闭液37℃封闭1.5h后TBST洗膜3次，兔源干扰素单克隆抗体作为一抗，加入1:1000稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的山羊抗兔IgG-HRP二抗，TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测，诱导后重组菌体中的重组蛋白大小为137kd，与CaIFN-α-SETD2融合蛋白大小一致，如图2所示。

实施例2、长效重组犬干扰素制品的制备

本实施例中用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH值7.0)稀释实施例1制备得到的CaIFN-α-SETD2融合蛋白，按总体积1:10比例加入稳定剂，同时加入甲基纤维素，充分搅拌，使每毫升成品中CaIFN-α-SETD2融合蛋白含量不低于0.01mg，每毫升成品中甲基纤维素含量为0.5mg。

试验实施例1、rCaIFN-α-SETD2长效重组犬干扰素制品生物学活性测定

1、rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品稀释

在无菌条件下，将制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品用测定培养液稀释至每1ml含1000IU，在96孔细胞培养板中作4倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作4孔。

2、对照品参考干扰素制品的稀释

在无菌条件下，将参考干扰素制品按标示量溶解后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU，在96孔细胞培养板中作4倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作2孔。

3、测定方法MDCK细胞在培养基中贴壁生长，每周一、三、五传3次，1：5传代，用完全培养基生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每毫升含有2.5×10⁵～3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，如图3所示，注:A1～A10：对照品参考干扰素制品，B1～B10为A1～A10的重复；C1～C10：供试干扰素制品，D1～D10、E1～E10、F1～F10为C1～C10的重复；A11～E11；MDCK细胞对照孔；A12～E12：VSV病毒对照孔。每孔100μl，于37℃、5％CO₂孵育4～6h，将稀释完成的待测干扰素制品和对照品参考干扰素制品溶液移入接种MDCK细胞的培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO₂孵育24h，弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至1000TCID ₅₀/ml，每孔100μl，于37℃、5％CO₂孵育24h(镜检供试干扰素制品溶液50％病变点在IU/ml)，然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液室温放置30min后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分。

4、染色结果观察

将置温箱24h培养物倒置于显微镜下观察，首先观察细胞对照孔和病毒对照孔中的细胞出现75～100％的明显病变，正常细胞对照孔中的细胞全部生长良好无病变时，则表明本次实验对照系统合格，否则弃去重做。

当干扰素保护空CPE不再进展，即可观察结果，将上述细胞板盖打开，弃去各孔内液体于消毒液中，加结晶紫染色1～2滴/孔，3～5分钟后用细水流冲洗孔内残余染色液，干燥后即可记录结果：++++表示全部细胞病变；+++表示75％细胞病变；++表示50％细胞病变；+表示25％细胞病变。按Reed-Muench法计算干扰素的抗病毒活性。

试验实施例2、rCaIFN-α-SETD2制品在犬体内半衰期测定

将本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品和未融合SETD2的rCaIFN-α制品同时进行半衰期检测，选用50～60日龄健康易感比格犬10只，随机分为2组，每组5只，分别肌肉注射rCaIFN-α-SETD2和rCaIFN-α制品，注射剂量均按每kg体重10万单位，每日一次，连用3日，于最后一次注射后1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h采血，应用HPLC测定血液中重组干扰素的浓度，如表1所示，血清中干扰素浓度测定结果(ng/ml)。

表1

注：表中体现干扰素浓度均为5只犬的算术平均值。

如图4所示，试验结果表明本发明制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品在犬血液中的浓度显著高于同期注射的rCaIFN-α制品，而且rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长。

试验实施例3、rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品在预防犬病毒性疾病中应用

参照试验实施例2的rCaIFN-α-SETD2在犬体内的半衰期情况，将本发明制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品和未融合SETD2的rCaIFN-α制品同时进行犬病毒性疾病的预防，再次验证了rCaIFN-α-SETD2融合表达后半衰期显著延长，并能很好的防治犬病毒性疾病，具体试验如下：

1、犬细小病毒病预防试验

选用50～60日龄健康易感比格犬30只，分为3组，每组10只，第1组和第2组为干扰素预防组，分别肌肉注射rCaIFN-α和rCaIFN-α-SETD2制品，注射剂量均按每kg体重10万单位，每日一次，连用3日，第3组为攻毒对照组(未预防)，于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验，分别以CPV/BJ/19株(10^6.0TCID₅₀/ml)攻毒，每只口服病毒液3.0ml，各组同条件下隔离饲养，观察临床症状，按照肠炎型犬细小病毒病症状评分标准进行评分，如表2所示，肠炎型犬细小病毒病症状评分表。

结果rCaIFN-α-SETD2融合蛋白注射组犬4h攻毒时，5只犬犬细小病毒平均评分为0.8分；48h攻毒时，5只犬犬细小病毒平均评分为2.8分；rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时，5只犬犬细小病毒平均评分为1.2分；48h攻毒时，5只犬犬细小病毒平均评分为4.4分；而攻毒对照组5只犬评分分别为4.6和4.4分。试验结果见表3所示，防治肠炎型犬细小病毒病。

试验结果表明本发明的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白对犬细小病毒具有更好的抵御作用，同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长。

表2

表3

注：“/”表示未进行此项。

2、犬瘟热病毒病预防试验

选用50～60日龄健康易感比格犬30只，分为3组，每组10只，第1组和第2组为干扰素预防组，分别肌肉注射rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品，注射剂量均按每kg体重10万单位，每日一次，连用3日，第3组为攻毒对照组(未预防)，于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验，分别以犬瘟热强毒CDV/BJ/14株攻毒，每只滴鼻接种2.0ml、同时肌肉注射2.0ml(含100ID₅₀)，各组同条件下隔离饲养，观察临床症状，按照犬瘟热病毒强毒攻毒症状评分标准进行评分，如表4所示，犬瘟热病毒强毒攻毒犬症状评分表。

结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时，5只犬瘟热病毒平均评分为0.4分；48h攻毒时，5只犬犬瘟热病毒平均评分为2.6分；rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时，5只犬瘟热病毒平均评分为0.6分；48h攻毒时，5只犬瘟热病毒平均评分为4.6分；而攻毒对照组5只犬评分分别为4.6和4.8分。

试验结果表明本发明的rCaIFN-α-SETD2对犬瘟热病毒具有更好的抵御作用，同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长，如表5所示，防治犬瘟热病毒病。

表4

表5

注：“/”表示未进行此项。

3、犬副流感病毒病预防试验

选用50～60日龄健康易感比格犬30只，分为3组，每组10只，第1组和第2组为干扰素预防组，分别肌肉注射基因重组犬rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品，注射剂量均按每kg体重使用10万单位，每日一次，连用3日，第3组为攻毒对照组(未预防)，于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验，分别以CPIV/QD/16株攻毒，每只滴鼻接种1.0ml、同时气管注射3.0ml(含100ID₅₀)，各组同条件下隔离饲养，观察临床症状，按照犬副流感强毒攻毒症状评分标准进行评分，如表6所示，犬副流感强毒攻毒犬症状评分表。

结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时，5只犬副流感病毒平均评分为0.8分；48h攻毒时，5只犬副流感病毒平均评分为2.8分；rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时，5只犬副流感病毒平均评分为1.0分；48h攻毒时，5只犬副流感病毒平均评分为4.6；而攻毒对照组5只犬评分分别为4.8和4.6分。

试验结果表明本发明的重组rCaIFN-α-SETD2对犬副流感病毒具有更好的抵御作用，同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长，如表7所示，防治犬副流感病毒病。

表6

表7

注：“/”表示未进行此项。

4、犬腺病毒2型预防试验

选用50～60日龄健康易感比格犬30只，分为3组，每组10只，第1组和第2组为干扰素预防组，肌肉注射基因重组犬rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品，注射剂量均按每kg体重使用10万单位，每日一次，连用3日，第3组为攻毒对照组(未预防)，分别于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验，分别以CAV2/BJ/13株攻毒，每只滴鼻接种2.0ml、同时肌肉注射2.0ml(含100ID₅₀)，各组同条件下隔离饲养，观察临床症状，按照犬腺病毒2型强毒攻毒症状评分标准进行评分，如表8所示，犬腺病毒2型强毒攻毒犬症状评分表。

结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时，5只犬腺病毒2型平均评分为0.6分；48h攻毒时，5只犬腺病毒2型平均评分为2.6分；rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时，5只犬腺病毒2型平均评分为0.8分；48h攻毒时，5只犬腺病毒2型平均评分为4.4分；而攻毒对照组5只犬评分均为4.6分。

试验结果表明本发明的重组rCaIFN-α-SETD2对犬腺病毒2型具有更好的抵御作用，同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长，如表9所示，本发明的重组蛋白对防治犬腺病毒2型的抵御作用。

表8

表9

注：“/”表示未进行此项。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京宝易生物技术有限公司，烟台市宝盈生物技术有限公司，北京义农生物科技有限公司

<120> 一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用

<130> GG20803822A

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1238

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Cys Tyr Leu Ala Asp Thr His Gly Gln Cys Asn Trp Arg Val Leu

1 5 10 15

Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His

20 25 30

Phe Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Asn Glu Leu Phe Asp Gly Glu Arg

35 40 45

Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys

50 55 60

Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met

65 70 75 80

Thr Leu Leu Asp Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Gln Ala Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu

115 120 125

Asp Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg

130 135 140

Ala Glu Ile Gly Arg Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg

145 150 155 160

Ile Arg Arg Arg Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

165 170 175

Lys Arg Met Gln Cys Glu Cys Thr Pro Leu Ser Lys Asp Glu Arg Ala

180 185 190

Gln Gly Glu Ile Ala Cys Gly Glu Asp Cys Leu Asn Arg Leu Leu Met

195 200 205

Ile Glu Cys Ser Ser Arg Cys Pro Asn Gly Asp Tyr Cys Ser Asn Arg

210 215 220

Arg Phe Gln Arg Lys Gln His Ala Asp Val Glu Val Ile Leu Thr Glu

225 230 235 240

Lys Lys Gly Trp Gly Leu Arg Ala Ala Lys Asp Leu Pro Ser Asn Thr

245 250 255

Phe Val Leu Glu Tyr Cys Gly Glu Val Leu Asp His Lys Glu Phe Lys

260 265 270

Ala Arg Val Lys Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Asn Ile His Tyr Tyr Phe

275 280 285

Met Ala Leu Lys Asn Asp Glu Ile Ile Asp Ala Thr Gln Lys Gly Asn

290 295 300

Cys Ser Arg Phe Met Asn His Ser Cys Glu Pro Asn Cys Glu Thr Gln

305 310 315 320

Lys Trp Thr Val Asn Gly Gln Leu Arg Val Gly Phe Phe Thr Thr Lys

325 330 335

Leu Val Pro Ser Gly Ser Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Gln Phe Gln Arg

340 345 350

Tyr Gly Lys Glu Ala Gln Lys Cys Phe Cys Gly Ser Ala Asn Cys Arg

355 360 365

Gly Tyr Leu Gly Gly Glu Asn Arg Val Ser Ile Arg Ala Ala Gly Gly

370 375 380

Lys Met Lys Lys Glu Arg Ser Arg Lys Lys Asp Ser Val Asp Gly Glu

385 390 395 400

Leu Glu Ala Leu Met Glu Asn Gly Glu Gly Leu Ser Asp Lys Asn Gln

405 410 415

Val Leu Ser Leu Ser Arg Leu Met Val Arg Ile Glu Thr Leu Glu Gln

420 425 430

Lys Leu Thr Cys Leu Glu Leu Ile Gln Asn Thr His Ser Gln Ser Cys

435 440 445

Leu Lys Ser Phe Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Leu Leu Trp Ile Trp

450 455 460

Met Ala Glu Leu Gly Asp Gly Arg Glu Ser Asn Gln Lys Leu Gln Glu

465 470 475 480

Glu Ile Ile Lys Thr Leu Glu His Leu Pro Ile Pro Thr Lys Asn Met

485 490 495

Leu Glu Glu Ser Lys Val Leu Pro Ile Ile Gln Arg Trp Ser Gln Thr

500 505 510

Lys Thr Ala Ile Pro Gln Leu Ser Glu Gly Asp Gly Tyr Ser Ser Glu

515 520 525

Asn Thr Ser Arg Ala His Thr Pro Leu Asn Thr Pro Asp Pro Ser Thr

530 535 540

Lys Leu Ser Thr Glu Ala Asp Thr Asp Thr Pro Lys Lys Leu Met Phe

545 550 555 560

Arg Arg Leu Lys Ile Ile Ser Glu Asn Ser Met Asp Ser Ala Ile Ser

565 570 575

Asp Ala Thr Ser Glu Leu Glu Gly Lys Asp Gly Lys Glu Asp Leu Asp

580 585 590

Gln Leu Glu Asn Val Pro Ile Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Ser Gln

595 600 605

Gln Leu Leu Thr Gln Gln Leu Pro Glu Ser Lys Val Glu Ser Glu Ile

610 615 620

Thr Val Glu Ala Ser Lys Leu Pro Thr Thr Glu Pro Glu Ala Asp Thr

625 630 635 640

Glu Ile Glu Pro Lys Glu Gly Asn Gly Thr Lys Leu Glu Glu Thr Ile

645 650 655

Ala Glu Glu Thr Pro Ser Gln Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Asp Val

660 665 670

Glu Ser Glu Arg Ser Gln Glu Gln Pro Asp Lys Thr Val Asp Ile Ser

675 680 685

Asp Leu Ala Thr Lys Leu Leu Asp Ser Trp Lys Asp Leu Lys Glu Val

690 695 700

Tyr Arg Ile Pro Lys Lys Ser Gln Thr Glu Lys Glu Asn Thr Ile Thr

705 710 715 720

Glu Arg Gly Arg Asp Ala Val Gly Phe Arg Asp Gln Thr Ala Ala Pro

725 730 735

Lys Thr Pro Asn Arg Ser Arg Glu Arg Asp Pro Asp Lys Gln Thr Gln

740 745 750

Asn Lys Glu Lys Arg Lys Arg Arg Gly Ser Leu Ser Pro Pro Ser Ser

755 760 765

Ala Tyr Glu Arg Gly Thr Lys Arg Pro Asp Asp Arg Tyr Asp Thr Pro

770 775 780

Thr Ser Lys Lys Lys Val Arg Ile Lys Asp Arg Asn Lys Leu Ser Thr

785 790 795 800

Glu Glu Arg Arg Lys Leu Phe Glu Gln Glu Val Ala Gln Arg Glu Ala

805 810 815

Gln Lys Gln Gln Gln Gln Met Gln Thr Leu Gly Met Thr Ser Pro Leu

820 825 830

Pro Tyr Asp Ser Leu Gly Tyr Asn Ala Pro His His Pro Phe Ala Gly

835 840 845

Tyr Pro Pro Gly Tyr Pro Met Gln Ala Tyr Val Asp Pro Ser Asn Pro

850 855 860

Asn Ala Gly Lys Val Leu Leu Pro Thr Pro Ser Met Asp Pro Val Cys

865 870 875 880

Ser Pro Ala Pro Tyr Asp His Ser Gln Pro Leu Val Gly His Ser Thr

885 890 895

Glu Pro Leu Ala Ala Pro Pro Pro Val Pro Val Val Pro His Val Ala

900 905 910

Ala Pro Val Glu Val Ser Ser Ser Gln Tyr Val Ala Gln Asn Asp Gly

915 920 925

Val Val His Gln Asp Ser Ser Val Thr Val Leu Pro Val Pro Ala Pro

930 935 940

Gly Pro Val Gln Gly Gln Asn Tyr Gly Val Trp Asp Ser Asn Gln Gln

945 950 955 960

Ser Val Ser Val Gln Gln Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Ser Gln Ala Thr

965 970 975

Ile Tyr Tyr Gln Gly Gln Thr Cys Pro Thr Val Tyr Gly Val Thr Ser

980 985 990

Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Pro Pro Ile Val Gln Ser Tyr Ala Gln Pro

995 1000 1005

Ser Leu Gln Tyr Ile Gln Gly Gln Gln Ile Phe Thr Ala His Pro Gln

1010 1015 1020

Gly Val Val Val Gln Pro Ala Thr Ala Val Thr Thr Ile Val Ala Pro

1025 1030 1035 1040

Gly Gln Pro Gln Pro Leu Gln Pro Pro Glu Met Val Val Thr Asn Asn

1045 1050 1055

Leu Leu Asp Leu Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Pro Lys Thr Ile Val

1060 1065 1070

Leu Pro Pro Asn Trp Lys Thr Ala Arg Asp Pro Glu Gly Lys Ile Tyr

1075 1080 1085

Tyr Tyr His Val Ile Thr Arg Gln Thr Gln Trp Asp Pro Pro Thr Trp

1090 1095 1100

Glu Ser Pro Gly Asp Asp Ala Ser Leu Glu His Glu Ala Glu Met Asp

1105 1110 1115 1120

Leu Gly Thr Pro Thr Tyr Asp Glu Asn Pro Met Lys Thr Ser Lys Lys

1125 1130 1135

Pro Lys Thr Ala Glu Ala Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ala Lys Lys Ser

1140 1145 1150

Lys Glu Val Phe Arg Lys Glu Met Ser Gln Phe Ile Val Gln Cys Leu

1155 1160 1165

Asn Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Cys Lys Val Gly Arg Ile Thr Thr Thr

1170 1175 1180

Glu Asp Phe Lys His Leu Ala Arg Lys Leu Thr His Gly Val Met Asn

1185 1190 1195 1200

Lys Glu Leu Lys Tyr Cys Lys Asn Pro Glu Asp Leu Glu Cys Asn Glu

1205 1210 1215

Asn Val Lys His Lys Thr Lys Glu Tyr Ile Lys Lys Tyr Met Gln Lys

1220 1225 1230

Phe Gly Ala Val Tyr Lys

1235

<210> 2

<211> 3717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgtgctacc tggcggacac ccacggtcag tgtaactggc gtgttctgac cctgctgggt 60

cagatgcgtc gtctgtctgc tggttcttgc gaccacttca ccaacgactt cgctttcccg 120

aatgaactgt tcgacggtga gcgtctgcag gaagctcagg ctctgtctgt tgttcacgtt 180

atgacccaga aagttttcca cctgttctgc ccggacacct cttctgctcc gtggaacatg 240

accctgctgg atgaactgtg ctctggtctg tctgaacagc tggacgacct ggaagcttgc 300

ccgctgcagg aagctggtca ggctgaaacc ccgctgatgc acgaagactc taccctgcgt 360

acctacttcc agcgtatctc tctggacctg caggaccgta accactctcc gtgcgcttgg 420

gaaatggttc gtgctgaaat cggtcgttct tacttctctt ctaccatcct gcaggaacgt 480

atccgtcgtc gtaaaacggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat gaaacgtatg 540

cagtgcgaat gcaccccgct gtctaaagac gaacgtgctc agggtgaaat cgcttgcggt 600

gaagactgcc tgaaccgtct gctgatgatc gaatgctctt ctcgttgccc gaacggtgac 660

tactgctcta accgtcgttt ccagcgtaaa cagcacgctg acgttgaagt tatcctgacc 720

gaaaaaaaag gttggggtct gcgtgctgct aaagacctgc cgtctaacac cttcgttctg 780

gaatactgcg gtgaagttct ggaccacaaa gaattcaaag ctcgtgttaa agaatacgct 840

cgtaacaaaa acatccacta ctacttcatg gctctgaaaa acgacgaaat catcgacgct 900

acccagaaag gtaactgctc tcgtttcatg aaccactctt gcgaaccgaa ctgcgaaacc 960

cagaaatgga ccgttaacgg tcagctgcgt gttggtttct tcaccaccaa actggttccg 1020

tctggttctg aactgacctt cgactaccag ttccagcgtt acggtaaaga agctcagaaa 1080

tgcttctgcg gttctgctaa ctgccgtggt tacctgggtg gtgaaaaccg tgtttctatc 1140

cgtgctgctg gtggtaaaat gaaaaaagaa cgttctcgta aaaaagactc tgttgacggt 1200

gaactggaag ctctgatgga aaacggtgaa ggtctgtctg acaaaaacca ggttctgtct 1260

ctgtctcgtc tgatggttcg tatcgaaacc ctggaacaga aactgacctg cctggaactg 1320

atccagaaca cccactctca gtcttgcctg aaatctttcc tggaacgtca cggtctgtct 1380

ctgctgtgga tctggatggc tgaactgggt gacggtcgtg aatctaacca gaaactgcag 1440

gaagaaatca tcaaaaccct ggaacacctg ccgatcccga ccaaaaacat gctggaagaa 1500

tctaaagttc tgccgatcat ccagcgttgg tctcagacca aaaccgctat cccgcagctg 1560

tctgaaggtg acggttactc ttctgaaaac acctctcgtg ctcacacccc gctgaacacc 1620

ccggacccgt ctaccaaact gtctaccgaa gctgacaccg acaccccgaa aaaactgatg 1680

ttccgtcgtc tgaaaatcat ctctgaaaac tctatggact ctgctatctc tgacgctacc 1740

tctgaactgg aaggtaaaga cggtaaagaa gacctggacc agctggaaaa cgttccgatc 1800

gaagaagaag aagaactgca gtctcagcag ctgctgaccc agcagctgcc ggaatctaaa 1860

gttgaatctg aaatcaccgt tgaagcttct aaactgccga ccaccgaacc ggaagctgac 1920

accgaaatcg aaccgaaaga aggtaacggt accaaactgg aagaaaccat cgctgaagaa 1980

accccgtctc aggacgaaga agaaggtgtt tctgacgttg aatctgaacg ttctcaggaa 2040

cagccggaca aaaccgttga catctctgac ctggctacca aactgctgga ctcttggaaa 2100

gacctgaaag aagtttaccg tatcccgaaa aaatctcaga ccgaaaaaga aaacaccatc 2160

accgaacgtg gtcgtgacgc tgttggtttc cgtgaccaga ccgctgctcc gaaaaccccg 2220

aaccgttctc gtgaacgtga cccggacaaa cagacccaga acaaagaaaa acgtaaacgt 2280

cgtggttctc tgtctccgcc gtcttctgct tacgaacgtg gtaccaaacg tccggacgac 2340

cgttacgaca ccccgacctc taaaaaaaaa gttcgtatca aagaccgtaa caaactgtct 2400

accgaagaac gtcgtaaact gttcgaacag gaagttgctc agcgtgaagc tcagaaacag 2460

cagcagcaga tgcagaccct gggtatgacc tctccgctgc cgtacgactc tctgggttac 2520

aacgctccgc accacccgtt cgctggttac ccgccgggtt acccgatgca ggcttacgtt 2580

gacccgtcta acccgaacgc tggtaaagtt ctgctgccga ccccgtctat ggacccggtt 2640

tgctctccgg ctccgtacga ccactctcag ccgctggttg gtcactctac cgaaccgctg 2700

gctgctccgc cgccggttcc ggttgttccg cacgttgctg ctccggttga agtttcttct 2760

tctcagtacg ttgctcagaa cgacggtgtt gttcaccagg actcttctgt taccgttctg 2820

ccggttccgg ctccgggtcc ggttcagggt cagaactacg gtgtttggga ctctaaccag 2880

cagtctgttt ctgttcagca gcagtactct ccggctcagt ctcaggctac catctactac 2940

cagggtcaga cctgcccgac cgtttacggt gttacctctc cgtactctca gaccaccccg 3000

ccgatcgttc agtcttacgc tcagccgtct ctgcagtaca tccagggtca gcagatcttc 3060

accgctcacc cgcagggtgt tgttgttcag ccggctaccg ctgttaccac catcgttgct 3120

ccgggtcagc cgcagccgct gcagccgccg gaaatggttg ttaccaacaa cctgctggac 3180

ctgccgccgc cgtctccgcc gaaaccgaaa accatcgttc tgccgccgaa ctggaaaacc 3240

gctcgtgacc cggaaggtaa aatctactac taccacgtta tcacccgtca gacccagtgg 3300

gacccgccga cctgggaatc tccgggtgac gacgcttctc tggaacacga agctgaaatg 3360

gacctgggta ccccgaccta cgacgaaaac ccgatgaaaa cctctaaaaa accgaaaacc 3420

gctgaagctg acacctcttc tgaactggct aaaaaatcta aagaagtttt ccgtaaagaa 3480

atgtctcagt tcatcgttca gtgcctgaac ccgtaccgta aaccggactg caaagttggt 3540

cgtatcacca ccaccgaaga cttcaaacac ctggctcgta aactgaccca cggtgttatg 3600

aacaaagaac tgaaatactg caaaaacccg gaagacctgg aatgcaacga aaacgttaaa 3660

cacaaaacca aagaatacat caaaaaatac atgcagaaat tcggtgctgt ttacaaa 3717

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggggsggggs ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 40

Claims

1.一种长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，所述方法包括将犬α-干扰素基因通过linker与犬SETD2基因连接形成编码CaIFN-α-SETD2的融合基因，将所述CaIFN-α-SETD2的融合基因经酶切、连接，导入大肠杆菌，得到重组表达菌，所述重组表达菌可诱导表达CaIFN-α-SETD2融合蛋白。

2.如权利要求1所述的长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，

所述CaIFN-α-SETD2的融合基因为如下a1)或a2)或a3)：

a1)如SEQ ID NO：2所示的序列；

3.如权利要求1所述的长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，

所述CaIFN-α-SETD2融合基因通过重组表达载体pET-CaIFN-α-SETD2导入所述大肠杆菌；

4.如权利要求1所述的长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，

所述linker的核苷酸序列如SEQ ID.3所示。

5.如权利要求3所述的长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，

所述大肠杆菌为BL21。

6.如权利要求1所述的长效重组犬干扰素的制备方法，其特征在于，

将所述重组表达菌接种至含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜；

7.一种长效重组犬干扰素制品，其包括稳定剂、甲基纤维素以及权利要求1-5所述方法制备的CaIFN-α-SETD2融合蛋白。

8.权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到的长效重组犬干扰素在如下b1)、b2)、b3)或b4)应用，

b1)制备抗犬细小病毒病的产品；

b2)制备抗犬瘟热病毒病的产品；

b3)制备抗犬副流感病毒病的产品；

b4)制备抗犬腺病毒病的产品。