CN106496320A

CN106496320A - 家猪isg15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用

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Publication number: CN106496320A
Application number: CN201611001646.7A
Authority: CN
Inventors: 陈陆; 李双双; 李永涛; 杨霞; 常洪涛; 王新卫; 赵军; 王川庆
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开一种家猪ISG15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用。家猪ISG15重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述家猪ISG15重组蛋白的基因，及包含所述基因的重组质粒和重组菌株。所述家猪ISG15重组蛋白、基因、重组质粒、重组菌株之任一在制备治疗猪伪狂犬病（PR）药物中的应用。本发明ISG15重组蛋白可以有效减少伪狂犬病病毒（PRV）的抗原量，能够有效控制PRV急性感染，为控制病毒感染提供了新途径。

Description

家猪ISG15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种家猪ISG15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用。

背景技术

ISG15是干扰素刺激基因15 (interferon-stimulated gene 15，isg15)，其编码蛋白为ISG15蛋白。病毒或I型干扰素的刺激可以诱导ISG15蛋白高效表达，其分子质量约为17ku。ISG15具有细胞因子活性、调节干扰素信号通路、抗病毒及抗细菌感染等功能，在先天性免疫中发挥着重要作用。ISG15蛋白在不同种生物间存在一定差异，目前关于ISG15的报道主要集中在人和鼠上，均是在抗病毒等方面的研究，目前没有关于家猪中该蛋白作用的报道。

猪伪狂犬病（porcine pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，PRV）引起的一种以仔猪发热、脑脊髓炎及妊娠母猪流产为主要特点的急性传染病，本病广泛分布于世界各地，猪群一旦发生该病，将很难根除，给养猪业造成了巨大的经济损失。2011年以来，我国突然再次暴发，此次流行突出表现在普防猪伪狂犬疫苗的猪群中，猪伪狂犬病野毒感染的阳性率维持相当高或持续升高的状态，并出现免疫母猪群大比例流产和中大猪死亡情况，这给我国养猪业尤其是种猪行业造成巨大损失。鉴于现有疫苗不能对PRV感染猪群提供完全保护的现状，研究能够控制PRV急性感染和降低猪群PRV野毒阳性率的新途径显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种家猪ISG15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

家猪ISG15重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述家猪ISG15重组蛋白的基因。

较好地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者为与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列互补的核苷酸序列。

包含所述基因的重组质粒。

较好地，所述重组质粒，优选其原始载体为原核表达载体pET28a。

包含所述重组质粒的重组菌株。

较好地，所述重组菌株，优选宿主细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞。

本发明所述家猪ISG15重组蛋白、基因、重组质粒、重组菌株之任一在制备治疗猪伪狂犬病药物中的应用。

本发明利用PCR技术对家猪ISG15基因的全长cDNA序列进行扩增，并且成功获得了该基因的CDS全长序列。其次，本发明成功构建了重组原核表达载体pET28a-ISG15，并且成功实现了家猪ISG15在大肠杆菌中的表达，并优化诱导条件后，表达量较高。由于目的蛋白带有his标签能够与Ni-Agarose特异性结合，分离的目的蛋白纯度较高，而且Ni-Agarose可再生反复利用。因此，本发明采用Ni-Agarose对目的蛋白进行分离纯化。纯化产物经SDS-PAGE分析条带较为单一，表明成功获得了21kDa大小的目的蛋白。

经过试验证明，本发明重组蛋白可以有效减少PRV的抗原量，能够有效控制PRV急性感染，为控制病毒感染提供了新途径。

附图说明

图1为家猪ISG15基因扩增产物的电泳图，其中，1：DL2000 DNA marker；2：家猪ISG15基因扩增产物。

图2为重组质粒pET28a-ISG15的双酶切鉴定的电泳图，其中，1：DL15000 DNAmarker；2：重组质粒；3：重组质粒双酶切结果；4：重组质粒单酶切结果；5：目的基因；6：DL2000 DNA marker。

图3为重组菌株pET28a-ISG15诱导表达产物的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白Marker；2：0.2mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解全菌；3：0.5mmol/mLIPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解全菌；4：1.0mmol/mLIPTG的pET28a-ISG15重组菌株裂解全菌；5：0.2mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解上清；6：0.5mmol/mLIPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解上清；7：1.0mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解上清；8：0.2mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解沉淀；9：0.5mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解沉淀；10：1.0mmol/mL IPTG诱导的pET28a-ISG15重组菌株裂解沉淀；11：未经诱导（即0mmol/mL IPTG）的pET28a-ISG15重组菌株裂解全菌；12：0.5mmol/mLIPTG诱导的空载体（即pET28a）裂解全菌。

图4为重组菌株pET28a-ISG15诱导表达产物的纯化产物的电泳图，其中，1：低分子量蛋白marker（14.3 KDa～97.2 KDa）；2-6：pET28a-ISG15表达纯化产物。

图5为qPCR检测家猪ISG15蛋白抗PRV作用。

图6为家猪ISG15抗PRV作用。

图7为各组织中病毒载量分析。

图8为淋巴细胞中细胞因子分析。

具体实施方式

实施例1 家猪ISG15重组蛋白的制备

1 材料与方法

1.1 试验动物

保育猪5只，来自河南农业大学猪病门诊送检病例。

1.2 菌株、细胞与载体

原核表达载体pET28a、大肠杆菌DH5α感受态细胞等购自大连宝生物工程有限公司；PK15细胞购自中国典型培养物保藏中心。

1.3试剂和培养基

1.3.1 试剂

T4 DNA连接酶、pMD18-T 载体、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、低分子量蛋白Marker（14.3 KDa～97.2 KDa）、限制性内切酶等购自Takara公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；DEPC购自Ameresco公司；猪源外周血淋巴细胞分离液购自索莱宝生物科技有限公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3.2 培养基

100mL LB肉汤培养基的制备方法：称取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1g氯化钠加入100mL蒸馏水中（pH值7.0±0.1，25℃），121℃高压灭菌30min，4℃保存备用。

100mL LB固体培养基的制备方法：称取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1g氯化钠、1.5g琼脂粉加入100mL蒸馏水中（pH值7.0±0.1，25℃），121℃高压灭菌30min，待温度降至60℃左右，在无菌操作台倒板，4℃保存备用。

1.4 基因片段的克隆

1.4.1 设计引物

从GenBank 中查出已登录野猪ISG15 基因的cDNA 序列，根据ISG15 基因的CDS区序列设计引物。上游引物F1：GCGGATCCCTATGGGTAGGGAACTGAAGGT（下划线部分为BamH I酶切位点），下游引物R1：GCCTCGAGCTTTATTAGCACTCGGTGAGGT（下划线部分为Xho I酶切位点）。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 总RNA的提取

通过心脏采集家猪血液，按照猪源外周血淋巴细胞分离液说明书方法分离外周血淋巴细胞。用Trizol法提取家猪血液淋巴细胞总RNA，参照Trizol试剂说明书进行具体操作。提取的总RNA最后用无菌0.1%( v/v) DEPC水溶解。

1.4.3 基因扩增

将RNA反转录，20μL反应体系：模板10μL(78μg/mL)，Oligo(dT)(2μmol/μL)1μL，dNTP(10mmol/μL)1μL，反转录酶M-MLV (200U/μL)0.5μL，RNA酶抑制剂RRI (40U/μL)0.5μL，0.1%( v/v) DEPC水3μL，5×buffer 4μL；反应条件：42℃ 1h，95℃ 5min。以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增家猪ISG15基因，50μL反应体系：2×Es Taq MasterMix 25μL，上下游引物F1和R1各1μL（20pmmol/μL），cDNA模板5μL，灭菌双蒸水18μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10 min。取适量PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1，在预期位置出现单一条带。用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，与pMD18-T载体连接，连接体系：pMD18-T载体1μL(50pmol/μL)，T₄DNAligase 1μL(350U/μL)，Solution I 5μL，目的片段4μL(80ug/mL)；连接条件：16℃，过夜；转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，筛选阳性克隆，摇菌，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，PCR鉴定后（50μL反应体系：2×Es Taq MasterMix 25μL，上下游引物F1和R1各1μL（20pmmol/μL），质粒DNA 5μL，灭菌双蒸水18μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10 min），阳性克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将鉴定正确的重组质粒命名为pMD18-T-ISG15。上述转化-筛选的具体过程为：取-70℃保存的感受态细菌DH5α 1支（100μL），置冰上，加入10μl连接反应产物，冰上放置30分钟，42℃ 90秒，冰上放置5分钟，加入1000μL无抗生素的LB液体培养基，37℃摇床摇菌1小时，8000rpm离心2分钟，留少量上清（约100μL），重悬细菌后，均匀涂布含100μg/mLAmp、20μg/mL X-gal、0.1mmol/L IPTG的LB固体培养基，置37℃温箱过夜，挑选白色菌落。

1.4.4 序列比对

经测序，家猪ISG15基因序列如SEQ ID No.1所示，家猪ISG15基因长501bp，DNAMAN分析碱基组成为A(21.36%)、C(24.95%)、T(16.77%)和G(36.93%)。其中，嘧啶碱基(C+T)占41.72%，嘌呤碱基(A+G)占58.29%，GC含量为60.69%。与NCBI参考序列NM_001128469.1相似性为99.2%，在206，207，339，360bp四处发生基因突变。DNAStar软件分析所得家猪ISG15基因序列与牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)、野猪(Sus scrofa)、猕猴(Macacaauratus)、家兔(Oryctolagus cunicμLus)、犬(Canis familiaris)、马（Equuscaballuas）、黑猩猩（Pan troglodytes）等动物的ISG15基因序列的核酸同源性。结果表明，家猪与野猪的同源性为99.2%，与人、猕猴等其他物种的同源性高达74%-83%。

1.5重组质粒pET28a-ISG15的构建与鉴定

将pMD18-T-ISG15和原核表达载体pET28a分别用BamH I和Xho I双酶切。pMD18-T-ISG15 50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，BamH I和Xho I各2μL，pMD18-T-ISG15 10μL（260μg/mL），无菌双蒸水31μL；原核表达载体pET28a 50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，BamH I和Xho I各2μL，pET28a (400μg/mL) 10μL，无菌双蒸水31μL；酶切条件：37℃酶切4h。电泳并利用SanPrep柱式DNA回收试剂盒回收ISG15和pET28a线性片段，在T4 DNA 连接酶的作用下，16℃过夜后将回收的ISG15连接于同样酶切并回收的pET28a表达载体上，连接体系(10μL)：回收的ISG15（60.2μg/mL）3μL，回收的pET28a（60.7μg/mL）5μL，T4 DNALigase 1μL(350U/μL)，10×T4 DNALigase buffer 1μL。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆（方法同1.4.3，只是Amp换成Kna，不加X-gal和IPTG），SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，进行双酶切鉴定（50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，BamH I和Xho I各2μL，质粒DNA (300μg/mL) 10μL，无菌双蒸水31μL；酶切条件：37℃酶切4h）。同时设置单酶切（50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，BamH I 2μL，质粒DNA (300μg/mL) 10μL，无菌双蒸水33μL；酶切条件：37℃酶切4h）、疑似重组质粒（即1.5中回收的pET28a与回收的ISG15的连接产物）、目的基因（即1.4.3中ISG15 的PCR产物）作为对照。结果见图2，可知双酶切后，得到了大小约为527bp 的条带，与预期片段大小相符合，并送华大基因公司测序。将鉴定正确的重组质粒命名为pET28a-ISG15。

1.6 pET28a-ISG15重组菌株的诱导表达与SDS-PAGE 分析

将重组质粒pET28a-ISG15和表达载体pET28a（空载体）分别转化至E.coli BL21感受态细胞（购自大连宝生物工程有限公司），涂布于含卡那霉素(100μg/mL)的LB 固体培养基上，挑斑于含卡那霉素(100μg/mL)的LB 液体培养基上，37℃过夜培养后按体积比为1:100比例转种于LB液体培养基，OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入IPTG（终浓度分别为0 mmol/mL、0.2mmol/mL、0.5mmol/mL、1.0mmol/mL），37℃诱导5h后收集1mL菌液，离心后弃上清，300μL PBS重悬菌体，超声破碎5min，取20μL（诱导全菌样品），进行SDS-PAGE电泳；超声破碎后剩余样品，离心后，分别取上清20μL（诱导上清样品）和沉淀（用300μL PBS重悬后取20μL，诱导沉淀样品），再分别进行SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳结果见图3，诱导重组质粒pET28a-ISG15转化的全菌和上清均在约21kDa 处出现条带，与目的蛋白约21kDa 的大小相符合，表明ISG15重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。

1.7 ISG15重组蛋白的纯化和抗病毒活性检测

1.7.1 ISG15重组蛋白的纯化：取1.6中0.5mmol/mL IPTG诱导重组质粒pET28a-ISG15表达5h 后的菌液，12000r/min 离心10min，将上清用0.45μm滤膜过滤后加入Ni-Agarose柱中，咪唑洗脱液洗脱后得到纯化的重组蛋白，进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯化效果。重复5次试验。结果见图4，在约21kDa 出现单一条带，基本上无其它杂带，表明目的蛋白纯化成功，将纯化的重组蛋白命名为ISG15重组蛋白，测序获知其氨基酸序列见SEQ IDNO.2。

1.7.2 抗病毒活性检测：

（1）、1.7.1中ISG15重组蛋白纯化后，超滤浓缩去除咪唑后，过滤除菌，获得ISG15重组蛋白溶液，用BCA法测定纯化蛋白含量后，按100μg/mL的剂量分别加到含10%FBS的DMEM培养基和含2%FBS的DMEM中，分别计为含ISG15蛋白的培养基和含ISG15蛋白的维持液；同时将含10%FBS的DMEM培养基和含2%FBS的DMEM，分别计为不含ISG15蛋白的培养基和不含ISG15蛋白的维持液；取空载体表达产物（制备过程：取1.6中0.5mmol/ml IPTG诱导表达载体pET28a表达5h 后的菌液，12000r/min 离心10min，将上清用0.45μm滤膜过滤后加入Ni-Agarose柱中，咪唑洗脱液洗脱后，超滤浓缩去除咪唑后，过滤除菌得到纯化的空载体表达产物）分别加到含10%FBS的DMEM培养基和含2%FBS的DMEM中，分别计为含空载体表达产物的培养基和含空载体表达产物的维持液，其中空载体表达产物的添加量与对应添加的ISG15重组蛋白溶液等体积。

（2）、设计四个试验组，具体为：

ISG15蛋白预处理PK15细胞：用2mL含ISG15蛋白的培养基培养PK15细胞，待细胞长至孔底面积的80%左右，接种PRV（0.01MOI），37℃孵育1h，加入2mL不含ISG15蛋白的维持液，37℃，5%CO₂，培养24h收取病毒液；

空载体表达产物预处理PK15细胞：用2mL含空载体表达产物的培养基培养PK15细胞，待细胞长至孔底面积的80%左右，接种PRV（0.01MOI），37℃孵育1h，加入2mL不含ISG15蛋白的维持液，37℃，5%CO₂，培养24h收取病毒液；

PRV感染PK15细胞后添加ISG15蛋白：用2mL不含ISG15蛋白的培养基培养PK15细胞，待细胞长至孔底面积的80%左右，接种PRV（0.01MOI），37℃孵育1h，加入2mL含ISG15蛋白的维持液，37℃，5%CO₂，培养24h收取病毒液；

PRV感染PK15细胞后添加空载体表达产物：用2mL不含ISG15蛋白的培养基培养PK15细胞，待细胞长至孔底面积的80%左右，接种PRV（0.01MOI），37℃孵育1h，加入2mL含空载体表达产物的维持液，37℃，5%CO₂，培养24h收取病毒液；

每组病毒液反复冻融两次（-70℃冷冻，室温融解），离心收获上清液。酚氯仿法提取DNA，荧光定量检测。

参考PRV EP0基因和猪β-actin设计引物，用于荧光定量PCR检测，F-EP0：CGGGCGAAGACAAACAAAGG，R-EP0：GGGCGGTAGAAGCCAAAGATC；F1-β-actin：CCCAAAGCCAACCGTGAGAAG，R1-β-actin：AGAAAGGGCGTGGCAAAGAGAG。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR反应体系（20µL）：SYBR® Premix Ex Taq^TM10µL，上下游引物各0.5µL（20pmol/µL），模板cDNA 2µL，双蒸水7µL；反应程序：95℃预变性1min，然后95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸20s，共40个循环。采用Lightcycler 1.5荧光定量PCR仪进行PCR反应、信号收集以及数据分析，按照2^-ΔΔCt方法进行计算。荧光定量检测结果见图5，显示家猪ISG15蛋白预处理PK15细胞发挥了抗PRV增殖的作用。

实施例2 家猪ISG15蛋白对猪源病毒的作用

本发明构建了PiggyBac-ISG15真核表达载体，建立了稳定表达猪ISG15的PK15细胞系，探究ISG15对猪源病毒的作用。

2.1 细胞、毒株、质粒与菌株

PK15细胞购自中国典型培养物保藏中心，用含10%胎牛血清的DMEM，37℃，5%CO₂培养。伪狂犬病病毒（PRV）Fa株购自中国兽药监察所。PiggyBac转座子系统（Novagen）购自上海北诺生物科技有限公司。TOP10感受态细胞购自北京鼎国生物技术有限公司。

2.2 PiggyBac-ISG15真核表达载体的构建与鉴定

根据猪ISG15基因序列设计上下游引物，并插入Xba I和BamH I限制性内切酶酶切位点，预测扩增片段546bp。上游引物F2：

GCTCTAGACTATGCATCATCACCATCACCATGGTAGGGAACTGAAGGT，并加入His标签（下划线部分序列分别为Xba I酶切位点和His标签），下游引物R2：

GCGGATCCCTTTATTACTAGCACTCGGTGAGGT（下划线部分序列为BamH I酶切位点），引物由上海生工生物工程有限公司合成。TRIzol法从猪外周血淋巴细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，反应体系（20μL）：模板10μL(78μg/mL)，Oligo(dT)(2μmol/μL)1μL，dNTP (10mmol/μL)1μL，反转录酶M-MLV (200U/μL)0.5μL，RNA酶抑制剂RRI (40U/μL)0.5μL，0.1% （v/v）DEPC水3μL，5×buffer 4μL；反应条件：42℃1h，95℃5 min。以得到的cDNA为模板PCR扩增家猪ISG15基因，50μL反应体系：2×Es Taq MasterMix 25μL，上下游引物F2和R2各1μL（20pmmol/μL），cDNA模板5μL，灭菌双蒸水18μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10 min。取适量PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，将ISG15和真核表达载体PiggyBac分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，ISG15 50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，Xba I和BamH I各2μL，ISG15 10μL（260μg/mL），无菌双蒸水31μL；真核表达载体PiggyBac 50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，Xba I和BamH I各2μL，PiggyBac (396μg/mL) 10μL，无菌双蒸水31μL；酶切条件：37℃酶切4h。电泳并利用SanPrep柱式DNA回收试剂盒回收ISG15和PiggyBac线性片段，在T4 DNA 连接酶的作用下，16℃过夜后将回收的ISG15连接于同样酶切并回收的PiggyBac表达载体上，连接体系(10μL)：回收的ISG15（60.2μg/mL）3μL，回收的PiggyBac（74μg/mL）5μL，T₄DNA ligase 1μL(350U/μL)，10×T₄DNA ligase buffer 1μL。将连接产物转化至感受态细胞Top10，筛选阳性克隆（方法同1.4.3，只是不加X-gal和IPTG，其他都相同），摇菌，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，PCR鉴定（50μL反应体系：2×Es Taq MasterMix 25μL，上下游引物F2和R2各1μL（20pmmol/μL），质粒DNA模板5μL，灭菌双蒸水18μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10 min）后，进行酶切鉴定（50μL酶切体系：10× K buffer 5μL，Xba I和BamH I各2μL，质粒DNA (300μg/mL) 10μL，无菌双蒸水31μL；酶切条件：37℃酶切4h），送华大基因测序。将测序正确的重组质粒使用去内毒素质粒中提试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取质粒命名为PB-ISG15，保存备用。

2.3 PK15细胞嘌呤霉素最佳筛选浓度测定

将嘌呤霉素加入到含10%胎牛血清的DMEM中，配制10个嘌呤霉素浓度梯度，嘌呤霉素的终浓度分别为1~10μg/mL，作为营养液，备用。将PK15细胞悬液接种至24孔板，每孔500μL培养液（含10%胎牛血清的DMEM），约7×10⁴个细胞，37℃，5%CO₂培养。待细胞生长密度达到孔底面积的80%左右时，将培养液更换为嘌呤霉素终浓度1~10μg/ml的营养液，每个浓度设3个重复，并设一组使用无药培养液做对照。每隔24h观察并记录细胞形态，连续7天，以3天内细胞全部死亡的最低药物浓度为最佳筛选浓度。

2.4 稳定转染与筛选

将PK15细胞悬液接种至6孔板，每孔2mL培养液（含10%胎牛血清的DMEM），约3.5×10⁵个细胞，37℃，5%CO₂培养，待细胞密度达到孔底面积的60%-80%时分为三组开始转染：空白对照组，不加任何质粒；试验组，每孔加入2μg PB-ISG15重组质粒和0.8μg Super PiggyBactransposase expression vector进行共转染；阴性对照组，每孔加入与试验组相应含量的PiggyBac空载体质粒和Super PiggyBac transposase expression vector进行共转染。转染步骤按照Lipofectamine^TM 2000说明书进行。转染6h弃去转染液，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培养基，37℃，5%CO₂继续培养。转染48h后，将孔内细胞传代接种到新的6孔板中，每孔2mL培养液（含10%胎牛血清的DMEM），约6×10⁵个细胞，37℃，5%CO₂培养，培养12h加入终浓度为最佳筛选浓度的嘌呤霉素进行筛选，每3天更换一次筛选培养液（培养基+嘌呤霉素）。当空白对照组细胞全部死亡时开始筛选，通过有限稀释法筛选具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光的细胞群，从试验组和阴性对照组中筛选出来的细胞分别命名为PB-ISG15细胞和对照PB细胞。

2.5病毒滴度检测

为进一步探索猪ISG15基因的抗病毒功能，选取伪狂犬病病毒（PRV）Fa株为代表，检测过表达ISG15对病毒复制的影响。

将2.4筛选出的PB-ISG15细胞与对照PB细胞分别接种至6孔板中，每孔2mL培养液（含10%胎牛血清的DMEM），约接种4×10⁵个细胞，待细胞汇合后，每孔接种0.01MOI的PRV，每组设三个重复，接种后分别再培养12h，24h和36h，将细胞及培养液混合物反复冻融三次（-70℃冷冻，室温融解），收获病毒液，酚氯仿法抽提DNA，荧光定量检测（同1.7.2），结果见图6（纵坐标为相对值，即ISG15过表达细胞--PB-ISG15细胞与载体对照细胞--对照PB细胞检查结果的比值），显示ISG15具有抗PRV的作用。

实施例3 家猪ISG15重组蛋白的应用

本发明通过对家猪人工感染伪狂犬病病毒，建立了猪伪狂犬病模型，用实施例1中得到的ISG15重组蛋白进行治疗实验，同时测定了实验期间几种细胞因子相对表达变化规律，为探讨ISG15基因在猪伪狂犬病的抗病机理奠定理论基础。

3.1主要试剂和仪器

伪狂犬病病毒（PRV）Fa株购自中国兽药监察所；TRIzol购自invitrogen 公司；SYBRGreen I Mix购自于大连宝生物工程(Takara) 公司；淋巴细胞分离液购自灏洋生物制品公司。

3.2 家猪ISG15重组蛋白的准备（应用实施例1中的方法制备）

3.3 试验猪分组

健康猪12只，随机分为2组，每组6只。对所有猪进行人工感染猪伪狂犬病病毒，在人工感染伪狂犬病病毒后2天，开始治疗试验，A组肌肉注射本发明的家猪ISG15重组蛋白，300μg/只/天；B组肌肉注射等量的生理盐水，直到试验结束。

3.4人工感染试验

将vero细胞接种至96孔细胞培养板中，每孔100μL培养液（DMEM），约1万个细胞，37℃，5%CO₂培养至长满单层；将伪狂犬病病毒Fa株用DMEM进行10倍倍比稀释，接种稀释度分别为10^-1～10^-8的病毒液，0.1mL/孔，每个稀释度6个重复，于37℃，5%CO₂继续培养72h，每天观察细胞病变效应。按Reed-Muench法计算出PRV病毒液的TCID₅₀=10^-7/0.1mL。全部试验猪滴鼻2mL/只。在攻毒的第2d、5d、8d、11d、14d、17d 从猪的静脉采集所有猪的外周血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，保存于-70℃备用，用于ISG15、IFN-γ、IL-2的荧光定量PCR检测。

3.5 临床观察与病原检测

为证实试验猪成功感染伪狂犬病病毒，每天测量直肠体温，观察临床病症表现，直至试验结束。对实验过程中死亡的猪立刻进行剖检，检查内脏病变。实验结束后宰杀所有试验猪，剖检，检查内脏病变。病料组织-70℃保存，用于荧光定量PCR检测。

3.6 检测脑、肺、脾组织中PRV载量的荧光定量PCR检测

酚氯仿法抽提DNA，荧光定量检测（引物、体系及条件和1.7.2相同），结果显示见图7：接毒未给蛋白组家猪在攻毒后5、8、11、14、17d家猪脑、肺、脾部PRV DNA含量相对于2d均在不断增加，而接毒给蛋白组家猪在攻毒后脑、肺、脾部PRV DNA含量相对有少量增加，但在8d之后迅速降低，且在攻毒后14d和17d时家猪脑、肺、脾部PRV DNA含量显著低于2d相应组织中的PRV DNA含量。

3.7 ISG15、IFN-γ、IL-2的荧光定量PCR检测

将上述分离的淋巴细胞及组织采用Trizol抽提法提取总RNA，反转录成cDNA，20μL反应体系：模板10μL(78μg/mL)，Oligo(dT)(2μmol/μL)1μL，dNTP (10mmol/μL)1μL，反转录酶M-MLV (200U/μL)0.5μL，RNA酶抑制剂RRI (40U/μL)0.5μL，0.1%( v/v)DEPC水3μL，5×buffer4μL；反应条件：42℃ 1h，95℃ 5min，于-20℃保存备用。参考家猪的ISG15、相应的细胞因子序列和猪β-actin外显子序列设计引物，进行荧光定量PCR检测：

F-ISG15：GGTGCAAAGCTTCAGAGACC，

R-ISG15：GTCAGCCAGACCTCATAGGC；

F-IFN-γ：AATGGTAGCTCTGGGAAACTG，

R-IFN-γ：ACTTCTCTTCCGCTTTCTTAGG；

F-IL-2：ACAGTTGCTTTTGAAGGAAGTTAAGAA，

R-IL-2：CCTGCTTGGGCATGTAAAATTT；

F2-β-actin：GGTGCAAAGCTTCAGAGACC，

R2-β-actin：GTCAGCCAGACCTCATAGGC。

引物均由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR反应体系（20µL）：SYBR®Premix Ex Taq^TM10µL，上下游引物各0.5µL（20pmol/µL），模板cDNA 2µL，双蒸水7µL；反应程序：95℃预变性1min，然后95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸20s，共40个循环。采用Lightcycler 1.5荧光定量PCR仪进行PCR反应、信号收集以及数据分析，按照2^-ΔΔCt方法进行计算。

荧光定量结果显示如图8：1）人工感染家猪5d内，两组ISG15表达水平基本一致，之后两组ISG15的表达量开始缓慢升高，但注射蛋白组明显比注射生理盐水组的ISG15表达量高；2）人工感染家猪8d内，两组诱生Th1型淋巴因子IFN-γ表达水平逐渐增高，注射生理盐水组略高于注射蛋白组，但在9d之后，注射蛋白组家猪淋巴细胞分泌PRV特异性IFN-γ的表达水平逐渐下降，而注射生理盐水组家猪淋巴细胞分泌PRV特异性IFN-γ的表达水平一直处于增高状态；3）人工感染家猪8d内，两组诱生Th1型淋巴因子IL-2表达水平逐渐增高，但之后，注射蛋白组家猪淋巴细胞分泌PRV特异性IL-2的表达水平逐渐下降，而注射生理盐水组家猪淋巴细胞分泌PRV特异性IL-2的表达水平一直处于增高状态。说明ISG15可以有效减少PRV的抗原量，能够有效控制PRV急性感染。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 家猪ISG15重组蛋白及其编码基因、重组质粒、重组菌株和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

atgggtaggg aactgaaggt gaagatgctg ggaggcaagg agatcctggt gcccttgagg 60

gactgcatga tggcatcgga cctgaagcag cagatcgccc gggagatcgg tgtgcccgcc 120

ttccagcagc gtctggctca cccagccggc aatgtgcttc aggatggggt gcccctggtc 180

aaccagggcc tgggcccagg cagcacagtc ctgttgatgg tgcaaagctt cagagaccca 240

ctgagcatcc tggtgaggaa cgacaagggt cgcagcaacg cctatgaggt ctggctgacg 300

cagacagtgg ctgagctcaa gcagcaggtg tgtcagcagg agggcgtgca agctgaccag 360

ttctggctga ctttcgaggg gaagcccatg gaggatgagc accagctggg ggagtatgac 420

ctcaagccta tgtgcaccgt gtatatgaat ctgcgcctgc gggggggcgg gacagggcca 480

ggggagcacc tcaccgagtg c 501

<210> 2

<211> 167

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Met Gly Arg Glu Leu Lys Val Lys Met Leu Gly Gly Lys Glu Ile Leu

1 5 10 15

Val Pro Leu Arg Asp Cys Met Met Ala Ser Asp Leu Lys Gln Gln Ile

20 25 30

Ala Arg Glu Ile Gly Val Pro Ala Phe Gln Gln Arg Leu Ala His Pro

35 40 45

Ala Gly Asn Val Leu Gln Asp Gly Val Pro Leu Val Asn Gln Gly Leu

50 55 60

Gly Pro Gly Ser Thr Val Leu Leu Met Val Gln Ser Phe Arg Asp Pro

65 70 75 80

Leu Ser Ile Leu Val Arg Asn Asp Lys Gly Arg Ser Asn Ala Tyr Glu

85 90 95

Val Trp Leu Thr Gln Thr Val Ala Glu Leu Lys Gln Gln Val Cys Gln

100 105 110

Gln Glu Gly Val Gln Ala Asp Gln Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly Lys

115 120 125

Pro Met Glu Asp Glu His Gln Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Lys Pro Met

130 135 140

Cys Thr Val Tyr Met Asn Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Thr Gly Pro

145 150 155 160

Gly Glu His Leu Thr Glu Cys

165

Claims

1.家猪ISG15重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码如权利要求1所述家猪ISG15重组蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者为与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列互补的核苷酸序列。

4.一种包含如权利要求2或3所述基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：原始载体为原核表达载体pET28a。

6.一种包含如权利要求4所述重组质粒的重组菌株。

7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：宿主细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞。

8.如权利要求1所述家猪ISG15重组蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组质粒、权利要求6或7所述重组菌株之任一在制备治疗猪伪狂犬病药物中的应用。