CN102692509B

CN102692509B - 重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂

Info

Publication number: CN102692509B
Application number: CN201210147131.3A
Authority: CN
Inventors: 鑫婷; 贾红; 朱鸿飞; 袁维峰; 侯绍华; 郭晓宇
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: CN102692509A

Abstract

本发明属于免疫检测领域。本发明提供了重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂。所述试剂包括作为特异性刺激原的重组蛋白混合物，该重组蛋白混合物能够刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应。利用本发明所述检测试剂建立的皮内变态反应试验与PPD皮内变态反应试验相比，具有更高的特异性，可区分牛分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染，因此可有效用于牛结核病的临床检测。

Description

重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的新型试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的一种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内约有5000万头牛感染了结核病，每年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织（WHO）指出：“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5.83%和5.43%。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10.18%以上，甚至更高。

牛结核菌素皮内变态反应试验（GB/T 18646）为世界动物卫生组织（OIE）规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使PPD检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且PPD生产工艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间PPD质量的稳定。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原（如PPD）刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测（如ELISA）从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PPD作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。

为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性靶（The early secreted antigenic target6ku protein,ESAT-6）、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白65（Heat shock protein 65，HSP-65）、抗原85B（antigen 85B,Ag-85B）、10kDa的培养滤液抗原（10kDa culture filtrate antigen,CFP-10）等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合（又称“鸡尾酒法”）作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测，通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。

因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。

本发明人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了PPD的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PPD进行皮内变态反应实验和IFN-γ释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的新型试剂及方法。

本发明的发明原理为：由于在皮内变态反应和γ-IFN释放试验中使用传统的PPD作为刺激原时，存在着成分复杂，特异性差的缺点，而现有用来替代PPD作为刺激原的重组牛结核杆菌蛋白的敏感性不理想。本发明尝试用这些重组蛋白或其混合物替代PPD作为刺激原，检测牛分枝杆菌感染。

首先，本发明提供了一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，其中包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，所述重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN-γ。其中所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

本发明中，三种重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的混合比例为1~2：1~2：1~2，包括但不限于1：1：1、2：2：1和1：1：2，其中优选为1：1：1。

本发明对所述三种重组蛋白及其混合物进行了皮内变态反应和IFN-γ释放试验，实验结果证明：（1）本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于PPD 作为刺激原的皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验；（2）本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于单一重组蛋白；（3）重组蛋白混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于相同蛋白的串联共表达产物。

在各种不同成分不同比例的重组蛋白混合物中，由CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的混合三种成分2::1:1混合的混合物作为刺激原进行皮内变态反应时，能特异性的检测牛分枝杆菌感染牛，且敏感度较高，最小刺激量可达0.3mgg/ml。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其中包括本发明所述的诊断试剂和ELISA检测所需的试剂。所述ELISA检测所需试剂包括但不限于包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗等。

另一方面，本发明还提供了用于制备重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂的引物，其中包括4对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，第四引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。

另一方面，本发明提供了所述引物在在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。

另一方面，本发明提供了一种制备重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂的方法，该方法包括：（a）PCR扩增获得的编码基因；（b）重组表达步骤（a）获得的编码基因得到3种重组蛋白；（c）将步骤（b）获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。

在一个实施方案中，所述制备方法步骤（a）中PCR扩增所用4对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:11所示。

在一个实施方案中，所述制备方法步骤（b）中得到的三种重组蛋白的具有分别具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一个实施方案中，其中步骤（c）中的混合比例混合比例为1~2：1~2：1~2，包括但不限于1：1：1、2：2：1和1：1：2，其中优选为2：1：1。

另一方面，本发明提供了一种牛结核病诊断方法，该方法包括下述步骤（a）剃毛后测量牛颈部上1/3处皮肤厚度；（b）向测量部位施用权利要求1至3任一项所述的诊断试剂；（b）72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。

在本发明的一个具体实施方案中，所述诊断方法包括下列步骤：a)在牛的颈部上1/3处剃毛，并用游标卡尺测量该部位的皮肤厚度；b)在剃毛部位用1ml注射器皮内注射0.1ml终浓度为0.5mg/ml的本发明所述的重组蛋白混合物；c)注射72h后，游标卡尺测量注射部位的皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。该方法的判断标准为：当皮厚差小于2mm时判定为阴性，皮厚差≥2mm时判定为牛分枝杆菌感染阳性。

另一方面，本发明还提供了一种牛结核病诊断方法，该方法包括：a)采集抗凝血，加入细胞培养板；b)然后向上述细胞培养板中加入本发明所述的，37℃下共孵育24小时；c)收集上层血浆作为待检样品，用ELISA方法检测血浆样品中牛IFN-γ的释放水平。

本发明的优点

本发明的检测牛分枝杆菌感染的新型检测试剂具有特异性高、生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉、可标准化生产等优点，本发明的新型牛分枝杆菌检测试剂盒及方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以PPD为刺激原的皮内变态反应及IFN-γ释放试验的不足，具有较强的的特异性和敏感性，因此可用于牛结核病的临床检测。

附图说明：

图1.牛分枝杆菌特异性蛋白PCR扩增产物电泳结果。泳道M：DL2000plus分子量Marker；泳道1：CFP-10/ESAT-6串联基因产物；泳道2：MPB70PCR扩增产物；泳道3：Ag85B PCR扩增产物。

图2.重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。泳道1：CFP-10重组蛋白纯化产物；纯化产物对照；泳道2：ESA-6重组蛋白纯化产物；泳道3：串联表达的CFP10/ESAT6重组蛋白纯化产物泳道4：pET-32a(+)空载体标签蛋白（PET）纯化产物；泳道5：MPB70重组蛋白纯化产物；泳道6：Ag85B重组蛋白纯化产物。

图3.重组蛋白MPB70和Ag85B作为CFP-10和ESAT-6的补充抗原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，1代表CFP10/ESAT6、MPB70和Ag85B以等比例混合作为刺激原；2代表CFP-10/ESAT-6串联蛋白。

图4.三种重组蛋白以不同混合方式作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，组合1代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合；组合2代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B等比例混合。

图5.重组蛋白混合物的剂量筛选结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差。

图6.载体标签蛋白PET作为皮内变态反应试验刺激原检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，PET代表载体标签蛋白。

图7.重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物作为皮内变态反应试验刺激原检测牛结核阴性牛结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合作为刺激原，蛋白终浓度为0.3mg/ml。

图8.重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物（重组蛋白浓度为0.3mg/ml）作为皮内变态反应试验刺激原临床检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，左图代表检测的40头结核病阴性牛数据，右侧图为30头结核病阳性牛数据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1重组质粒的构建

1.1牛分枝杆菌基因组DNA的提取

用M.bovis ValleeⅢ菌株（购自中国兽医药品监察所）培养物，参照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒（购自北京博大泰克基因技术有限责任公司）说明书所述方法进行。

1.2引物的设计

根据GenBank中M.bovis AF2122/97基因组DNA（登录号为BX248333）的ESAT-6、CFP-10和MPB70、Ag85B基因序列设计特异性引物，上游引物携带Bam H I酶切位点，下游引物携带HindⅢ酶切位点，引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1（下划线处为保护性碱基及酶切位点）。

表1 PCR引物名称、序列及扩增产物的大小

1.3重组质粒的构建及鉴定

1）串联CFP10/ESAT6重组质粒的构建

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，分别用Pfu DNA Polymerase分别扩增ESAT-6、CFP-10基因，具体反应体系如下：

CFP-10和ESAT-6基因的扩增循环参数均为：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃再延伸10min；用琼脂糖胶回收试剂盒(（购自OMEGA,USA）分别回收纯化上述PCR产物，将其标记为CFP10-PCR和ESAT6-PCR，按照下述反应条件扩增CFP10/ESAT6串联基因产物：

用琼脂糖胶回收试剂盒(（购自OMEGA,USA）回收纯化上述PCR产物（见图1.，该PCR产物为648bp），用Bam H I和Hind Ⅲ双酶切后，定向克隆到pET32a(+)载体中，获得的重组质粒经双酶切和测序鉴定正确后，命名为PET-CFP10/ESAT-6。

2）MPB70和Ag85B重组质粒的构建

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，分别用Pfu DNA Polymerase分别扩增MPB70和Ag85B基因，具体反应体系如下：

这两个基因的扩增循环参数为：95℃预变性10min，95℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃再延伸10min PCR扩增产物电泳检测，结果见图1，MPB70和Ag85B基因基因产物分别约为582bp和978bp，与预期大小一致。

用琼脂糖胶回收试剂盒(（购自OMEGA,USA）分别回收纯化上述PCR产物，纯化产物分别用Bam H I和HindⅢ双酶切后，定向克隆到pET32a(+)载体中，获得的重组质粒经双酶切和测序鉴定正确后，分别命名为PET-MPB70和PET-Ag85B。

实施例2 重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的表达及纯化

2.1重组蛋白的诱导表达、纯化

将实施例1制备的重组质粒PET-CFP10/ESAT-6转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm=0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL PBS（pH 7.4）洗涤两次，10ml PBS（pH 7.4）重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清。蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱（His Trap FF Crude column，购自GE公司）按操作手册在蛋白纯化仪（AKTA purifier，购自GE公司）上进行纯化，并用脱盐层析柱（HiTrap 26/10 Desalting column，购自GE公司）进行脱盐，将重组蛋白置换到HEPES（pH7.4）缓冲溶液中，纯化产物经12%SDS-PAGE电泳进行检测，如图2.。

将实施例1制备的重组质粒PET-MPB70和PET-Ag85B分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm=0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL溶液（10mM Tris-HCl pH8.3,50mM NaCl and EDTA 5mM）洗涤一次，10mL的溶液1重悬菌体后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min，沉淀用40ml溶液2（20mM Tris-HCl pH 8.3,50mM NaCl，EDTA 5mM，和0.5% TritonX-100）洗涤一次，获得的沉淀用溶液1洗涤一次后，重悬于10ml的含有2M尿素的溶液1，室温搅拌2h；12000r/min，4℃离心30min，获得的沉淀重悬于含有8M尿素的溶液1，室温搅拌溶解2h，12000rpm，4℃离心30min，上清放于透析袋中，用梯度复性法进行复性，复性后的蛋白溶液经滤膜过滤，用脱盐层析柱（HiTrap 26/10 Desalting column，购自GE公司）进行脱盐，将重组蛋白置换到HEPES（pH7.4）缓冲溶液中，纯化产物经12% SDS-PAGE电泳进行检测，如图2.。重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的大小分别为42ku、40ku和54.5ku，与预期大小相一致。

2.2重组蛋白的内毒素去除及定量

实施例2.1中制备的重组蛋白由大肠杆菌表达，含有大量的内毒素，而超量内毒素注入机体会引起发热等副反应，为了去除重组蛋白中的内毒素，向重组蛋白溶液中加入1%的Triton X-114，4℃间断混匀30min，37℃水浴10min，室温20000g离心10min，取上清，如此重复2次，可去除重组蛋白中绝大部分的内毒素。收获的蛋白溶液经滤器无菌过滤，用蛋白定量试剂盒（BCA法）（购自SINOPCR公司）定量后，无菌分装并冻存于-80℃。

实施例3 重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的活性检测

3.1重组蛋白的细胞免疫活性鉴定

①用传统的PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验筛选牛结核阳性牛和健康牛各5头，无菌条件下采集肝素抗凝血5ml，室温（22±5℃）运送到实验室并在采血后8h内进行培养。②将抗凝血加入到48孔组织培养板，0.75ml/孔，分别无菌加入牛PPD、禽PPD、PBS（pH7.4）、空载体标签蛋白PET、重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70、Ag85B（重组蛋白以等摩尔量加入，其中PET的终浓度为10ug/ml）各50μl，震荡混匀后37℃ CO₂培养箱中孵育24h。③小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用（血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月）。按照牛IFN-γ检测试剂盒（购自北京测迪公司）说明书进行操作，记录各个样品的OD_450nm读值。

判定结果前必须检查阳性对照和阴性对照的OD_450nm值，当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，如重组蛋白刺激后的血浆样品OD_450nm值-阴性对照刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性，结果见表2.。

结果显示载体的标签蛋白PET刺激牛结核阳性牛或健康牛的全血后，IFN-γ的释放量均没有增加，重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B可以特异性的刺激牛分枝杆菌感染牛的外周淋巴细胞，使其产生较高水平的IFN-γ，但不同动物个体敏感的蛋白并不一样，这表明与牛分枝杆菌特异性蛋白（CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B）融合表达的载体标签蛋白PET对牛的外周血淋巴细胞没有刺激作用，而四种牛分枝杆菌特异性重组蛋白均具有良好的细胞免疫活性，且可以互为补充。

表2.重组蛋白的细胞免疫活性检测结果

实施例4替代PPD作为皮内变态反应刺激原筛选

4.1重组蛋白混合方式筛选

用皮内变态反应筛选结核阳性牛，2个月后按照以下分组进行皮内变态反应试验，用于筛选合适的刺激原，注射剂量为0.1ml，

1）随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射CFP-10/ESAT-6、CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B重组蛋白混合物（1:1:1，浓度为0.5mg/ml），另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图3，结果表明重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合作为刺激原的效果优于单个重组蛋白CFP-10/ESAT-6。

2）随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射不同组合方式的重组蛋白混合液（CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B比例为1:1:1或2:1:1，重组蛋白的总浓度均为0.5mg/ml），另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图4.，结果表明重组蛋白以2:1:1的比例组合效果更好。

4.2重组蛋白混合物的剂量筛选

随机筛选结核阳性牛10头，其中在5头牛颈部一侧注射0.1ml不同蛋白总浓度的重组蛋白混合液，一点的注射浓度为0.5mg/ml，另一点为0.2mg/ml，另一侧注射牛PPD；另外5头牛一侧注射蛋白总浓度分别为0.3mg/ml或0.1mg/ml的重组蛋白混合液，另一侧注射牛PPD，检测结果见图5.，结果表明重组蛋白混合物的终浓度为0.3mg/ml，即注射30μg时，就可以产生良好的刺激效果。

4.4重组蛋白作为皮内变态反应试验刺激原时的特异性检测

1）随机选取5头牛，在颈部上1/3处选取两点（间隔20cm以上），分别注射牛PPD和50μg的载体标签蛋白PET，于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，结果见图6，结果表明标签蛋白并不引起非特异性反应，与实验3.1中的结果相吻合。

2）选取PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验筛选的40头阴性健康牛，在第一次皮内变态反应结束2个月后，于颈部上1/3处选取两点（间隔20cm以上），分别注射牛PPD和终浓度为0.3mg/ml的重组蛋白混合溶液（CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B之间比例为2:1:1）各0.1ml，分别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，结果见图7，结果表明重组蛋白对牛分枝杆菌感染检测具有很强的特异性，并不引起非特异性反应。

4.5重组蛋白作为皮内变态反应试验刺激原进行临床试验

用牛PPD和重组蛋白混合液在临床进行皮内变态反应试验，于牛颈部上1/3处剃毛，两点之间间隔20cm以上，分别注射0.1ml的牛PPD和重组蛋白混合液（重组蛋白混合液的浓度为0.3mg/ml，CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B之间比例为2:1:1），在注射前和注射后72h用游标卡尺测量皮肤厚度，计算注射前后的皮厚差。皮内变态反应判定标准：牛PPD作为刺激原时，皮厚差＜2mm时为阴性，2mm≤皮厚差＜4mm时为可疑，皮厚差≥4mm时判定为阳性，疑似动物需要复检；重组蛋白作为刺激原时，皮厚差≥2mm时判定为阳性。

将PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验与重组蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B介导的皮内变态反应试验比较检测的特异性和敏感性，结果见表4.。

阳性牛：经IFN-γ释放试验、牛PPD皮内变态反应试验检测判定为双阳性的牛共30头，这30头的牛PPD皮内变态反应试验和重组蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验检测结果如图8（阳性牛）；

阴性牛：经IFN-γ释放试验、牛PPD皮内变态反应试验检测判定为双阴性的牛共40头，这40头牛PPD皮内变态反应试验和重组蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验检测结果如图8（阴性牛）。

实验结果表明：重组蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B作为刺激原进行皮内变态反应试验时与传统的检测方法（即牛PPD皮内变态反应和干扰素释放试验）的检测符合率可达97.1%，检测的灵敏度可以达到93.3%，特异性达到100%。这些试验数据表明CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B重组蛋白混合物作为皮内变态反应试验的刺激原具有较高的灵敏度和特异性，因此具有作为牛结核病临床检测方法的潜力。

表7.蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验对于PPD皮内变态反应试验的敏感性和特异性分析

蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验对于PPD皮内变态反应试验的灵敏度=A/(A+C)×100%=93.3%

蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验对于PPD皮内变态反应试验的特异性=D/(B+D)×100%=100%

蛋白混合物CFP10/ESAT6-MPB70-Ag85B为刺激原的皮内变态反应试验对于PPD皮内变态反应试验的检测符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%=97.1%。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 213

<212> PRT

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221> 融合多肽

<222> (1)..(213)

<400> 1

Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val

20 25 30

Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly

35 40 45

Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys

50 55 60

Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly

65 70 75 80

Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser

85 90 95

Gln Met Gly Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala

115 120 125

Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu

130 135 140

Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr

165 170 175

Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser

180 185 190

Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met

195 200 205

Phe Ala Lys Leu Gly

210

<210> 2

<211> 193

<212> PRT

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221> 多肽

<222> (1)..(193)

<400> 2

Met Lys Val Lys Asn Thr Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Val Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asp

20 25 30

Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly

35 40 45

Pro Ala Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala

50 55 60

Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln

65 70 75 80

Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser

100 105 110

Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu

115 120 125

Thr Tyr His Val Val Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly

130 135 140

Thr Arg Gln Thr Leu Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly

145 150 155 160

Asn Ser Leu Lys Val Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser

165 170 175

Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu Met Pro Pro

180 185 190

Ala

<210> 3

<211> 325

<212> PRT

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221> 多肽

<222> (1)..(325)

<400> 3

Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met

1 5 10 15

Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val

35 40 45

Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro

85 90 95

Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val

100 105 110

Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly

115 120 125

Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu

130 135 140

Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser

145 150 155 160

Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala

165 170 175

Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu

180 185 190

Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met

195 200 205

Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser

210 215 220

Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu

225 230 235 240

Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro

245 250 255

Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe

260 265 270

Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly

275 280 285

Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp

290 295 300

Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser

305 310 315 320

Ser Leu Gly Ala Gly

325

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(66)

<400> 4

ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcatgac agagcagcag 60

tggaat 66

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(29)

<400> 5

cccaagcttt gcgaacatcc cagtgacgt 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 6

cgcggatcca tggcagagat gaagaccgat 30

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> yiwnu

<222> (1)..(64)

<400> 7

gctgccgcca ccgccgcttc cgccaccgcc gcttccaccg ccaccgaagc ccatttgcga 60

ggac 64

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 8

cgcggatcca aggtaaagaa cacaattgcg 30

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(28)

<400> 9

cccaagcttg cgccggaggc attagcac 28

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 10

cgcggatcca tgacagacgt gagccgaaag 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(31)

<400> 11

cccaagcttt cagccggcgc ctaacgaact c 31

Claims

1.一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，所述重组蛋白混合物由三种重组蛋白组成，所述三种重组蛋白的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述三种重组蛋白的混合比例为1~2：1~2：1~2。

2.权利要求1所述的重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，其中所述三种重组蛋白的混合比例为1：1：1或2：2：1或1：1：2。

3.一种试剂盒，其中包括权利要求1或2所述的诊断试剂和ELISA检测所需的包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗牛IFN-γ单抗。

4.用于制备权利要求1或2所述诊断试剂的引物，其中包括4对引物，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:11所示。

5.一种制备权利要求1或2所述诊断试剂的方法，该方法包括：（a）PCR扩增获得重组蛋白编码基因，其中PCR扩增使用权利要求4所述的引物；（b）重组表达步骤（a）获得的编码基因得到所述重组蛋白；（c）将步骤（b）获得的重组蛋白混合得到所述诊断制剂。

6.权利要求5所述的制备方法，其中步骤（b）重组表达使用的宿主为大肠杆菌。

7.权利要求5或6所述的制备方法，其中步骤（c）中重组蛋白的混合比例为1~2：1~2：1~2。