CN102183649A - 牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒，其包括：包被牛γ干扰素单克隆抗体的酶标板；酶标记牛γ干扰素单克隆抗体；含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液。捕获抗体和检测抗体分别针对γ-干扰素不同的抗原表面。本发明用牛分枝杆菌重组蛋白MPB83，MPB70和结核分枝杆菌重组蛋白ESAT6和CFP10，建立的牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA检测方法比较稳定，其特异性为96％，敏感性为88.6％，大大提高γ-干扰素ELISA检测牛结核病方法的特异性和敏感性。

Description

牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地，涉及牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10四种重组蛋白克隆、表达和纯化，四种蛋白作为诊断抗原多重组合最佳浓度的确定，牛IFN-γ重组蛋白表达，其单克隆抗体制备及应用。

背景技术

结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skin test，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。

国内有关牛γ-干扰素单克隆抗体制备及牛结核病夹心ELISA检测方法的建立有研究报道，四川农业大学的徐贤坤博士采用rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白来孵育刺激全血IFN-γ释放，建立了水牛结核病夹心ELISA检测方法。华中农业大学对抗牛IFN-γ单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立进行研究；扬州大学建立了牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法，并且利用抗牛γ干扰素特异性的抗体，建立了竞争抑制ELISA方法和胶体金试纸条检测牛γ干扰素。其申请的试剂盒专利是通过全血培养、牛分枝杆菌抗原PPD作为刺激物，利用牛γ干扰素特异性抗体检测全血培养中释放出的γ干扰素，从而对牛结核病进行诊断。从这些报道或专利可以看出，基本的原理是一样的，都采用牛γ干扰素特异性抗体检测全血培养中释放出的γ干扰素，对牛结核病进行诊断。但四川农业大学采用rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白这种方法，结核分枝杆菌可以分泌CFP10/ESAT6，牛分枝杆菌缺失这些蛋白的基因，临床无法检测牛分枝杆菌感染，灵敏性有待提高。扬州大学建立的牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法，采用牛分枝杆菌抗原PPD作为刺激物，临床诊断中难以与禽分支杆菌等环境分支杆菌感染区分开，特异性差。

发明内容

针对上述不足，本发明旨在提供一种牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒及其检测方法，其检测的特异性和敏感性好，而且操作方便。

本发明第一个目的在于牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒，其包括：

(1)包被牛γ干扰素单克隆抗体的酶标板；

(2)酶标记牛γ干扰素单克隆抗体；

(3)含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10四种重组蛋白的蛋白液；

其中，包被在酶标板的牛γ干扰素单克隆抗体与酶标记牛γ干扰素单克隆抗体分别针对牛γ干扰素不同的抗原表位。

本发明从牛淋巴细胞中克隆出了牛γ干扰素的cDNA，构建到原核表达载体中，体外表达并纯化出牛γ干扰素重组蛋白。以牛γ干扰素重组蛋白为免疫抗原制备牛γ干扰素单克隆抗体，筛选出9株单克隆抗体能识别牛IFN-γ重组蛋白的2个不同表位，进一步筛选出分别识别2个不同表位的单克隆抗体代表株，所述的2个不同表位的单克隆抗体代表株上清效价较高。

在本发明实施例中，所述含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液的浓度优选为3μg/ml，其中，MPB83、MPB70、ESAT6和CFP10的质量比优选为1∶1∶1∶1。

根据本发明，所述的酶标记牛γ干扰素单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

本发明提供的试剂盒还可进一步包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。

本发明另一个目的在于提供应用所述的试剂盒进行牛γ干扰素ELISA检测的方法，其包括如下步骤：

1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFP10蛋白液刺激所采集的待测牛的血液，37℃培养16～24h，收集上清；

2)包被：将单克隆抗体用包被液稀释为1.0μg/mL，100μL/孔，4℃放置过夜，取出后用PBST洗涤3次，3min/次；

3)封闭：用5％小牛血清封闭，100μL/孔，于37℃放置1h；封闭后，用PBST洗涤3次，3min/次；

4)加样：将步骤1)制备的检测样品与阴阳性对照分别按1∶2稀释，100μL/孔，37℃反应60min；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；

5)加酶标记单抗：将识别的抗原表位与步骤2)中包被的单克隆抗体所识别的抗原表位不同的酶标单克隆抗体用稀释液稀释成2.5μg/mL，100μL/孔，37℃反应45min；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；

6)显色：加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃反应15min；

7)终止：底物反应完后，加入终止液，每孔加入50μL 2M的硫酸终止；

8)测值：于酶标仪上读数，测定各孔OD450nm值，并判定结果。

本发明的优点主要体现在以下几个方面：

1)使用牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10作为牛血液淋巴细胞的刺激原，确定了刺激的最佳浓度，提高γ-干扰素ELISA检测牛结核病方法的特异性和敏感性。MPB83，MPB70是牛分枝杆菌培养早期分泌物中的重要蛋白，在体内引发细胞免疫，具有较强免疫原性和免疫保护性。ESAT6和CFP10的编码基因都位于1号缺失区域(RD1)，是结核分枝杆菌特异性抗原，因此，与PPD相比，以RD1抗原结合牛分支杆菌特异性抗原作为检测抗原，IFN-γ试验具有更高的特异性。而且以多种抗原组合作为检测抗原，可以克服使用单一抗原以提高检测特异性的同时，会牺牲一部分检测的灵敏度这个缺陷，达到更高的精确度，从而成为一种强有力的结核病的诊断工具。

2)建立了用ELISA方法检测牛血液淋巴细胞释放γ-干扰素含量的方法。确定了牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA方法中最佳包被抗体的包被量、包被时间和包被方法，最佳酶标抗体的作用时间。

3)由试验中所用的牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10建立的牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA检测方法比较稳定，其特异性为96％，敏感性为88.6％。

附图说明

图1为CFP-10、ESAT-6、MPB70和MPB83基因的PCR扩增，其中A CFP-10基因的PCR扩增，B为ESAT-6基因的PCR扩增，C为MPB70基因的PCR扩增，D为MPB83基因的PCR扩增，其中1为各自的PCR产物，M为DNA Marker DL2000。

图2为重组质粒pET30a-CFP-10的酶切鉴定，其中1～2为重组质粒pET30a-CFP-10的双酶切鉴定；M为DNAMarker DL2000。

图3为重组质粒pET30a-MPB83的酶切鉴定，其中1～2为重组质粒pET30a-MPB83的双酶切鉴定；M为DNAMarker DL2000。

图4为重组表达质粒pET30a-MPB70的双酶切鉴定，其中1～2为重组质粒pET30a-MPB70的双酶切鉴定；M为DNA MarkerDL2000。

图5为重组质粒pET30a-ESAT6的酶切鉴定，其中1～2为重组质粒pET30a-ESAT6的双酶切鉴定；M为DNAMarker DL2000。

图6为重组蛋白CFP10的SDS-PAGE分析，其中，1-4.pET30a-CFP10/BL21(DE3)诱导后4小时菌体蛋白；5-6.pET30a-CFP10/BL21(DE3)诱导前0小时菌体蛋白；7.pET-30a/BL21的菌体蛋白；M：低分子量蛋白Marker。

图7为重组蛋白MPB83的SDS-PAGE分析，其中，1：pET-30a/BL21的菌体蛋白；2：pET-30a/BL21(DE3)诱导后4小时；M：低分子量蛋白Marker；3：pET30a-MPB83/BL21(DE3)诱导前0小时菌体蛋白；4：pET30a-MPB83/BL21(DE3)诱导后4小时菌体蛋白。

图8为重组蛋白MPB70的SDS-PAGE分析，其中，1、2、3：PET30a-MPB70/BL21(DE3)诱导后4h菌体蛋白；4：PET30a-MPB70/BL21(DE3)诱导前0h菌体蛋白；M：低分子量蛋白Marker。

图9为重组蛋白ESAT6的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白Marker；1和2为pET30a-ESAT6/BL21(DE3)诱导4小时菌体蛋白；3：pET30a-ESAT6/BL21(DE3)诱导2小时菌体蛋白；4：pET30a-ESAT6/BL21(DE3)诱导0小时菌体蛋白；5：pET30a/BL21(DE3)诱导2小时菌体蛋白。

图10为重组蛋白CFP10纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白预染Marker；1为纯化的重组蛋白。

图11为重组蛋白MPB70纯化后SDS-PAGE分析，其中M为低分子质量蛋白预染Marker；1为包含体裂解后上清；2纯化的重组蛋白。

图12为重组蛋白MPB83纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白Marker；1～3为纯化的重组蛋白。

图13为重组蛋白ESAT6纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白Marker；1～2为纯化的重组蛋白。

图14为牛IFN-γ基因的PCR扩增，其中，M：DNA MarkerDL2000；1、2.PCR产物。

图15为牛pET 30-IFN-γPCR鉴定结果，其中，M：DNA MarkerDL2000；1、2、3、4、5：PCR产物。

图16为牛IFN-γ重组蛋白表达结果，其中，1：空白对照；M：低分子蛋白Marker；2：37℃诱导表达；3：18℃诱导表达。

图17为牛IFN-γ重组蛋白纯化结果，其中，1：纯化结果；M：低分子蛋白Marker；2：空白组；3：纯化前诱导表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1基因工程菌的构建

根据已发表的牛分枝杆菌MPB83、MPB70；结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因序列设计特异性引物。引物序列如SEQ ID No.1～8所示：

表1扩增MPB83、MPB70、ESAT6、CFP10基因的引物序列

提取牛分枝杆菌标准株AF2122/97和结核杆菌H37Rv(由本实验室保存)的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用合成的特异性引物序列，进行PCR扩增，反应体系总体积为50μl，反应体系如下所示：

10×PCR缓冲液     5μl

10mM dNTPs        1.0μl

10uM引物1         2.5μl

10uM引物2         2.5μl

Ex-Taq酶          1μl

双蒸水            36μl

DNA模板           2μl

总体积            50μl

反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

从牛分枝杆菌标准株AF2122/97的DNA中扩增MPB83、MPB70，从结核杆菌H37Rv的DNA中扩增ESAT 6、CFP 10基因，扩增产物分别如图1A～D所示。胶回收后，与pGEM-T easy载体连接，转化DH5α感受态细胞；再用OMEGA的质粒提取试剂盒分别纯化重组质粒和测序，测序正确的阳性质粒经双酶切(所用的内切酶分别为：MPB83：KpnI/SacI；MPB70：BamH I/EcoR I；ESAT6：BamH I/XholI；CFP10：EcoR I/BamH I)后，与经过双酶切的pET30a(+)连接过夜，转化到BL21(DE3)菌株，用上述PCR引物做菌落PCR，快速筛选克隆，所得克隆再经双酶切鉴定(图2～5)及DNA测序鉴定，经上述筛选获得Esherichia coli PET30/MPB83；Esherichia coliPET30/MPB70；Esherichia coli PET30/ESAT6；Esherichia coli PET30/CFP10。

实施例2重组蛋白的表达及纯化

2.1重组蛋白的诱导表达

挑取含阳性重组表达质粒的重组菌单菌落接种于5ml LB液体培养基中(含卡那霉素50μg/ml)，37℃活化过夜。按1％比例将活化菌液接种到含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中，37℃ 225rpm振荡培养至对数生长期(OD600＝0.6～0.8)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于恒温摇床上37℃振荡培养4h收菌。分别于诱导前和诱导后不同时间取出1ml细菌培养物，7000rpm离心5min收集菌体，弃去上清后加入2xSDS上样缓冲液，98℃变性10min，用15％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析(图6～9)。

2.2重组蛋白的纯化

超声波破碎后的重组菌体，经过SDS-PAGE检查，发现目的蛋白主要以包涵体的形式存在。通过亲和纯化His标签蛋白来纯化目的蛋白，经过电洗脱回收，用软件Alpha Imager 2200对纯化蛋白进行薄层扫描分析表明，蛋白的纯度可达85％以上(图10～13)，表明纯化后的目的蛋白纯度较高。

实施例3牛IFN-γ基因的克隆与原核表达

3.1牛淋巴细胞的分离与培养

1)采健康牛的血液15ml并加入抗凝剂肝素钠。

2)用等体积PBS稀释血液或血浆。

3)取30ml淋巴细胞分离液加入离心管管底，并升温到室温。

4)用巴斯德玻璃吸管吸取30ml稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，勿打乱液层界面。

5)水平转子离心2000rpm/min离心20min，室温约20℃。

6)离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白膜，含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核粒细胞)。用吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一离心管中。

7)加10ml生理盐水稀释分离的淋巴细胞，250g离心10min，弃上清。重复洗涤1-2次，除去血小板和抗凝物质。用含有ConA(20μg/ml)的1640培养液(15％FCS)将淋巴细胞重悬后加入2个15ml细胞瓶中放入细胞培养箱培养过夜。

3.2mRNA的分离与cDNA的合成

1)收集所有分离的淋巴细胞，1000x离心10min加入Trizol 1ml，室温放置5min，使其充分裂解。

2)12,000rpm离心5min，弃沉淀。

3)加入氯仿200μl，振荡混匀后室温放置15min。

4)4℃12,000g离心15min。

5)吸取上层水相，至另一离心管中。

6)加入异丙0.5ml醇混匀，室温放置5-10min。

7)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8)加入75％乙醇1ml，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

9)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

10)室温晾干5～10min。

11)用10μl H₂O溶解RNA样品，55～60℃，5～10min。

12)按体系加入试剂：dNTP 0.5μl，M-MLV0.5μl，M-MLV缓冲液2μl，Oligo dT 0.5μl，RNA酶抑制剂2.5μl，H₂O 5μl，步骤(11)中所获得的mRNA样品1.25μl。37℃水浴2h。

3.3牛IFN-γ基因的克隆

根据牛IFN-γ的CDs基因序列设计一对引物，截取CDS31-451bp区域的碱基序列并添加酶切位点。引物序列如下所示。

上游引物：5′-CGGAATTCCTGCTCTGTGGGCTTTTG-3，其5′端带有酶切点EcoR I；

下游引物：5′-CCCAAGCTTGTCTGAGGTTAGATTTTGGTGA-3′，其5′端带有酶切点Hind III。

PCR反应体系：

模板cDNA          4μl

2xPCR Taq Mix     12.5μl

灭菌水            7.5μl

上游引物          0.5μl

下游引物          0.5μl

加完上述成分后，作瞬时离心混匀，然后按照如下条件进行PCR扩增：

1、94℃预变性     5min

2、94℃变性       40s

3、60℃复性       40s

4、72℃延伸       40s

5、回到步骤2      35个循环

6、72℃延伸       10min

7、4℃保温        10min

反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳(图14)，用OMEGA的GELEXTRACTION KIT回收450bp左右DNA片段后，与pGEM-T easy载体连接，转化DH5α感受态细胞；再用OMEGA的质粒提取试剂盒纯化重组质粒，用EcoR I/Hind III双酶切鉴定，并测序，测序正确的阳性质粒经EcoR I/Hind III双酶切后，与用经过EcoR I/Hind III双酶切的pET30a(+)连接过夜，转化到BL21(DE3)菌株，用上述PCR引物做菌落PCR，快速筛选克隆，所得克隆再经菌落PCR(图15)及DNA测序鉴定。经上述筛选获得E.coli PET30/bovine IFN-γ。

3.4牛IFN-γ蛋白诱导表达

1)挑选生长良好的阳性菌落，接种至含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养液中，37℃快速震荡培养2h至OD600约0.8时。

2)加入终浓度为1mmol/L IPTG，37℃继续快速震荡培养6h，收集菌液，进行SDS-PAGE分析。结果如图16所示，与阴性对照(1)比较，分别在37℃(2)和18℃(3)诱导表达后，均在30KD-40KD之间出现了蛋白条带，表明所构建的IFN-γ-pet30表达载体可诱导表达IFN-γ。

3.5牛IFN-γ重组蛋白的纯化

1)挑选生长良好的阳性菌落，接种至含有100mg/L卡那霉素LB的液体培养液中，37℃快速震荡培养2h至OD600约0.8时。

2)加入终浓度为1mmol/L IPTG，37℃继续快速震荡培养6h，收集菌液，4000g离心30min，弃上清。

3)将沉淀在-80℃和室温冻融3次。

4)用结合缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O 3.5814g；NaH₂PO₄·2H₂O1.56g；NaCl 14.61g；30mM咪唑；6M尿素；至1L双蒸水中)重悬细胞，冰浴超声裂解菌体，超声条件为超声5s，间隔5s，超声次数120次，功率200w。

5)10000g离心30min，将上清用0.45um的滤器过滤。用高效液相色谱仪和带组氨酸标签的镍柱纯化蛋白。通入上述的结合缓冲液10ml平衡柱子，加入刚才处理好的样品，通入结合缓冲液2ml冲洗，再用洗脱缓冲液(Na2HPO4·12H2O 3.5814g；NaH2PO4·2H2O1.56g；NaCl 14.61g；500mM咪唑；6M尿素；至1L双蒸水中)冲洗镍柱。

6)收集UV800出现波峰时的洗脱缓冲液，内含高浓度重组蛋白牛IFN-γ。纯化后的重组蛋白牛IFN-γ的SDS-PAGE的电泳图如图17所示。

实施例4牛IFN-γ单克隆抗体制备

4.1免疫与间接ELISA方法建立

牛IFN-γ重组蛋白作为免疫抗原免疫6周龄BALB/c小鼠(如表2)

表2小鼠免疫程序

分别在二免和三免后10天小鼠尾部采血，室温静置1h，再4℃放2h，3000rpm离心10min，收集血清，4℃保存。用间接ELISA法测定血清效价并建立单抗筛选方法，方法如下。

(1)包被抗原：用牛IFN-γ重组蛋白包被酶标微孔板，每孔100μl，4℃过夜，然后弃去孔内液体。PBST洗3次，每次3min，拍干(简称洗涤拍干，下同)。

(2)封闭：用封闭液向微孔中每孔加100μl，置于湿盒，在37℃温箱中孵育30min。然后洗涤拍干。

(3)加待测血清样品：将血清样品稀释后顺序加入，每孔100μl。每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。置于湿盒，在37℃温箱中孵育1h。然后洗涤拍干。

(4)加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：先用稀释液将酶标羊抗鼠IgG稀释，每孔加入100μl。置于湿盒，在37℃温箱中孵育1h。然后洗涤拍干。

(5)加底物液：各孔加新鲜配置的底物使用液100μl，置于湿盒，在37℃温箱孵育10-15min之后终止反应：每孔加终止液50μl。

(6)判定结果：阴性对照孔应无色或接近无色，阳性对照孔应明确显色。450nm波长测定OD值，

以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性，这样可以得出血清的效价。

4.2细胞融合

(1)收集全部SP2/0细胞，1000rpm离心6分钟，去上清，反复用无血清培养基洗2次，最后悬浮于10ml无血清培养基中，取0.1ml至0.9ml无血清培养基中，混匀，细胞计数。

(2)取全部脾细胞，将三免后效价较高的免疫Balb/c小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按5∶1的比例充分混匀，1000rpm离心5分钟，弃上清。

(3)轻弹离心管管底，使沉淀细胞疏松，吸取1ml DMEM液加入1g灭菌的PEG 2000(预先要加热融化)中，并用7.5％NaHCO₃调PH值至7.5～7.8，混匀。一手匀速转动离心管，另一手吸取1ml上述调好的PE G2000液，沿转动的离心管壁缓缓加入，控制在60s加完。然后将悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管(时间也控制在30s左右)。融合时间共约2分钟。

(4)缓慢小心地加入25ml预温的20％完全培养基以终止PEG2000的作用，2分钟完成，第一分钟加入1ml DMEM液，第二分钟缓缓加入4ml DMEM液，然后在3min内缓慢加入剩余的20％完全培养基。

(5)将融合细胞8000rpm离心7min，弃上清，加入20ml 1％HAT培养液轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均匀，将悬浮细胞液加入有饲养细胞的96孔板中，每孔100ul，置37℃，含5％CO2培养箱中培养过夜。

(6)融合后，每天在倒置显微镜下注意观察杂交瘤细胞的生长情况，7～10天用HAT培养基半量换液。

(7)2周后换HT选择培养基，3周后可换完全培养基。

4.3杂交瘤细胞的筛选

采用间接非竞争性ELISA方法检测。

(1)包被抗原：用包被液将包被用牛IFN-γ重组蛋白稀释至1μg/mL，向微孔中每孔加100μl，4℃过夜，然后弃去孔内的液体。

(2)封闭：用封闭液向微孔中每孔加100ul，37℃湿盒孵育30min，然后用洗涤缓冲液(PBST)洗3次，每次90s(简称洗涤，下同)，拍干。

(3)加待测培养上清液：将上清液顺序加入，每孔100μl，每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。37℃湿盒在温箱中孵育1h，然后洗涤5次、拍干。

(4)加酶标第二抗体：先用稀释液将酶标羊抗鼠IgG作倍比稀释，每孔加入100μl，置37℃湿盒温箱中孵育1h；然后洗涤5次、拍干。

(5)加底物液：各孔加新鲜配置的底物使用液100μl，37℃在温箱中孵育10-15min。

(6)终止反应：每孔加终止液50ul。

(7)判定结果：阴性对照孔(适当稀释SP2/0上清和阴性血清)应无色或接近无色。

阳性对照孔(免疫小鼠血清)应明确显色。测定OD值，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。

4.4杂交瘤细胞的克隆

杂交瘤的克隆化的方法为有限稀释法，即将细胞悬液连续稀释，至一定浓度时就有可能得到含单个细胞的悬液，将其接种到培养板中，就可由此单个细胞繁殖形成同源性的细胞克隆。采用有限稀释法克隆，具体方法如下：

(1)制备饲养细胞。可于克隆化前一天制备，也可于克隆化当天制备。

(2)将待克隆化的杂交瘤细胞用加样器或弯头吸管反复吹打均匀后取少许细胞悬浮至另一无菌青霉素小瓶中，作10倍稀释。

(3)取上述无菌小瓶中的细胞准确计数。

(4)根据细胞计数结果，对细胞悬液做适当稀释。因计数误差，为保险起见，可稀释成不同梯度，如每孔5个，1个，0.5个细胞梯度，这样总会有一个梯度其细胞真实浓度在1个/孔附近。具体方法如下：

取250个活细胞悬浮于4.6ml培养液中，此时平均每0.1ml溶液中含5个细胞，接种96孔培养板，每孔0.1ml，共36孔。这样就用去3.6ml。余下1.0ml，再加入4ml培养液，共5ml(此时平均每0.1溶液中含1个细胞)，接种此细胞液至其次的36孔，每孔0.1ml，最后剩余细胞悬液1.4ml，再补加培养液1.4ml(此时平均每0.1ml溶液中含细胞0.5个)，接种最后的24孔，每孔0.1ml.这样共以三种不同的细胞浓度进行克隆化，第一组36孔，平均每孔5个细胞，第二组36孔。平均每孔1个细胞，第三组24孔，平均每孔0.5个细胞。

(5)将培养板置5％CO₂，37℃温箱中培养。一般5d左右(在此之前不换液)即可在倒置显微镜下观察细胞克隆生长，注意记录各孔细胞生长情况并确定单克隆细胞株。

(6)适时进行换液及检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔进行再次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，直至所有细胞孔的培养上清液均为阳性，克隆方算成功。

4.5单克隆抗体的大量制备

采用动物体内诱生单克隆抗体的方法。取健康Balb/c雌性小鼠10只，每只腹腔注射液体石蜡1ml，1～2周后备用。将培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心10min收集细胞，弃上清液。用不完全培养基将细胞悬浮，混匀，并将细胞数调至106个/ml，每只预处理的小鼠腹腔注射1ml阳性克隆杂交瘤细胞；7～9d后收集腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，纯化后小管分装，-20℃冻存。

实施例5牛IFN-γ夹心ELISA方法建立

5.1单克隆抗体的鉴定及特性分析

单克隆抗体饱和稀释度的测定

牛IFN-γ重组蛋白以5μg/mL浓度包被ELISA板，将各株单克隆抗体依次稀释为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，进行间接ELISA，以各株OD450nm值明显降低处的稀释度确定为单抗饱和稀释度。最终确定1B5、3D8、3A6、2F8、2F2、4D1、4F7、4D4、2E10的饱和稀释度分别为1∶1600、1∶800、1∶3200、1∶3200、1∶3200、1∶800、1∶3200、1∶1600、、1∶1600。

单克隆抗体抗原识别位点分析

采用测相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位，按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值：AI＝(A1.2-A1)/A2×100％(A1.2：表示2株单抗叠加后的OD值；A1：表示第1株单抗自身叠加的OD值；A2：表示第2株单抗自身叠加的OD值)。当两两抗体叠加之后的AI值大于30％认为两株单抗识别不同位点。经过计算在9株单克隆抗体能识别牛IFN-γ重组蛋白的2个不同表位，识别2个不同表位的单抗代表株分别命名为1B5和2F2。

腹水效价测定

单克隆抗体腹水从1∶200开始作稀释，按间接ELISA测定其效价，腹水的效价测定结果分别见表3。

表3腹水效价测定

单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定

按照mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(Sigma-Aldrich，INC.，Saint Louis，USA)试剂盒说明书进行MAbs亚类鉴定，鉴定结果是1B5为IgG2b亚类和2F2为IgG1亚类。

5.2辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体的制备

HRP酶标记物的鉴定

HRP酶标记物HRP-1B5鉴定结果如表4所示，克分子比为1.08，标记率为0.371，达到了预期的结果。

表4HRP酶标记单抗HRP-1B5的鉴定

标记抗体与牛IFN-γ重组蛋白的反应性

对不同稀释度的酶标记抗体进行直接ELISA法检测。用牛IFN-γ重组蛋白包被酶标板，将酶标抗体从1∶50开始稀释，倍比稀释后，100μl/孔，TMB显色，终止后测OD₄₅₀值。OD₄₅₀值大于阴性OD₄₅₀的2.1倍即为阳性，从下表中可见酶标抗体HRP-1B5的效价为1∶400。

表5标记抗体与牛IFN-γ重组蛋白的反应性

5.3包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度

采用棋盘滴定法，将2F2抗体进行倍比稀释至10ug/ml、1.0ug/ml、0.1ug/ml包被酶标板，分别以强阳性抗原液、弱阳性抗原液及阴性抗原液为样品，用抗体稀释液将酶标抗体1B5倍比稀释至25ug/ml、2.5ug/ml、0.25ug/ml进行双抗体夹心ELISA的测定，结果如下：

表6包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度确定

选择P/N值较大且强阳性OD450值大于1.0的孔，所对应的包被抗体和酶标抗体的浓度为最佳工作条件，依据表的结果确定包被抗体2F2的包被浓度为1.0μg/ml，酶标抗体的工作浓度为2.5μg/ml。

5.4封闭液的选择

以最佳抗体的工作浓度，以已经优化的条件进行ELISA检测，测定各孔的OD₄₅₀，结果如下表：

表7牛IFN-γELISA检测方法中封闭液的选择

依据表7的结果，比较各封闭液的P/N值，以P/N值最大的一组为最佳封闭液，结果确定5％小牛血清为最佳封闭液。

5.5样品作用时间的确定

以最佳抗体的工作浓度和最佳封闭液，以已经优化的条件进行ELISA检测，测定各孔的OD₄₅₀，结果如下表：

表8牛IFN-γELISA检测方法中作用时间的确定

依据表8的结果，比较各封闭液的P/N值，以P/N值最大的一组为最佳封闭液，结果确定60min是最佳工作时间。

5.6酶标记单克隆抗体作用时间的确定

以已经优化的条件进行ELISA检测，酶标记单克隆抗体的反应时间分别为30min、45min、60min，测定相应的OD₄₅₀，结果如下：

表9牛IFN-γELISA检测方法中酶标抗体作用时间的确定

依据表9结果，比较各封闭液的P/N值，以P/N值最大的一组为酶标单克隆抗体的作用时间，结果确定45min为酶标单克隆抗体的作用时间。

5.7显色时间的确定

以已经优化的条件进行ELISA检测，底物显色时间分别为5min、10min、15min、20min，测定相应的OD₄₅₀，结果如下：

表10牛IFN-γELISA检测方法中显色时间的确定

依据表10的结果，比较各显色时间的P/N值，以P/N值最大的一组为底物显色时间，结果确定15min为底物显色时间。

5.8双抗体夹心ELISA检测IFN-γ抗原反应程序的确定

包被：将2F2株单克隆抗体IgG用包被液稀释为1.0μg/mL，100μL/孔，4℃放置过夜，取出后用PBST洗涤3次，3min/次；

封闭：用5％小牛血清封闭，100μL/孔，于37℃放置1h；封闭后洗涤同上；

加样：检测样品与阴阳性对照分别按1∶2稀释，100μL/孔，37℃反应60min；反应完毕后洗涤同上；

加酶标记单抗：将1B5酶标抗体用稀释液进行1∶100稀释，100μL/孔，37℃反应45min；反应完毕后洗涤同上；

显色：加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃反应15min；

终止：底物反应完后，加入终止液，每孔加入50μL 2M的硫酸终止；

测值：于酶标仪上读数，测定各孔OD450nm值，并判定结果。

实施例6牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA诊断方法建立

6.1MPB83，MPB70，ESAT6和CFP10蛋白最佳组合浓度研究

采集单次皮内试验阳性牛20天的新鲜抗凝血，将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加八孔1.5mL分装的抗凝血，用一次性自动移液器或吸管在无菌条件下进行操作。无菌加入100μL PBS(阴性抗原对照)，3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、21μg/ml MPB70、MPB83、ESAT6和CFP10重组蛋白按1∶1∶1∶1的混合物至相应的孔。将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时后，用可调移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。

如表11显示，随着蛋白浓度的不断降低，OD₄₅₀值不断地升高，在3ug/ml处达到最大值，并且与阴性对照相比，呈现明显的特异性。所以选择最佳蛋白工作浓度为3μg/ml。

表11结核病抗原特异性IFN-γELISA检测方法中多重组合重组蛋白浓度的确定

注：其中，1、2、3、4、5、6、7、8、9号为结核杆菌感染阳性牛，10号为结核杆菌感染阴性牛

6.2最佳阴阳性临界值的确定

20份结核阳性血液和20份结核阴性血液，使用重组牛分枝杆菌MPB83，MPB70蛋白，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10蛋白的最佳刺激浓度刺激所采集的血液，PBS作为对照，37℃培养16-24h后，收集上清。用已优化过的IFN-γ双抗夹心ELISA方法检测所收集的血液上清，获得各血液样品的经上述重组蛋白刺激后的OD₄₅₀(B-Pr OD)和经PBS刺激的OD₄₅₀(PBS OD)。分别参考了欧洲和新西兰的国家标准，其中阴阳性临界值0.1旨在提高检测的特异性，用于PPD皮试后的辅助检测；而阴阳性临界值0.04旨在注重检测的敏感性，用于大规模消灭该病病原时的检测。本实验同时测试了这两种阴阳性临界值，获得表12的结果。结果表明，两者在特异性和敏感性上的差异(如下表)，结果判定最佳阴阳性临界值为0.1。

表12牛结核病抗原特异性IFN-γELISA检测方法最佳阴阳性临界值的确定

判定标准如下：

阳性＝牛分枝杆菌和结核分枝杆菌特异性抗原的OD-阴性抗原的OD≥0.1

阴性＝牛分枝杆菌和结核分枝杆菌特异性抗原的OD-阴性抗原的OD＜0.1

6.3特异性试验

6.3.1交叉反应试验

取5份副结核病牛血样，根据本法做ELISA试验检测其结果。用患有牛副结核病的病牛血样经蛋白刺激后，做ELISA试验结果显示：患副结核病的病牛牛血样不呈现阳性反应。

6.3.2符合性试验

取已知牛结核阴性牛血样50份，根据本法做牛结核病特异性IFN-γELISA试验，检测结果有2份可疑，特异性为96.0％。

6.4敏感性试验

选取70头份牛结核病PPD反应阳性血样，做牛IFN-γELISA试验，有62份样品呈现阳性结果，敏感性为88.6％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒，其包括：

1)包被牛γ干扰素单克隆抗体的酶标板；

2)酶标记牛γ干扰素单克隆抗体；

3)含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液；

其中，包被在酶标板的牛γ干扰素单克隆抗体与酶标记牛γ干扰素单克隆抗体分别针对牛γ干扰素不同的抗原表位。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液的浓度为3μg/ml。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液中MPB83、MPB70、ESAT6和CFP10的质量比为1∶1∶1∶1。

5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记牛γ干扰素单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

6.权利要求1～5任一项所述的试剂盒在牛γ干扰素检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFP10蛋白液刺激所采集的待测牛的血液，37℃培养16～24h，收集上清；

2)包被：将单克隆抗体用包被液稀释为1.0μg/mL，100μL/孔，4℃放置过夜，取出后用PBST洗涤3次，3min/次；

3)封闭：用5％小牛血清封闭，100μL/孔，于37℃放置1h；封闭后，用PBST洗涤3次，3min/次；

4)加样：将步骤1)制备的检测样品与阴阳性对照分别按1∶2稀释，100μL/孔，37℃反应60min；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；

5)加酶标记单抗：将识别的抗原表位与步骤2)中包被的单克隆抗体所识别的抗原表位不同的酶标单克隆抗体用稀释液稀释成2.5μg/mL，100μL/孔，37℃反应45min；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；

6)显色：加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃反应15min；

7)终止：底物反应完后，加入终止液，每孔加入50μL 2M的硫酸终止；

8)测值：于酶标仪上读数，测定各孔OD450nm值，并判定结果。

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