CN107632155A - 一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 - Google Patents
一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107632155A CN107632155A CN201710795249.XA CN201710795249A CN107632155A CN 107632155 A CN107632155 A CN 107632155A CN 201710795249 A CN201710795249 A CN 201710795249A CN 107632155 A CN107632155 A CN 107632155A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tubercle bacillus
- detection
- bacillus specific
- blood cell
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种改进的血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法(T spot LW)，属于免疫学检测技术领域，通过增加检测中覆盖常见结核杆菌结构蛋白的种类而实现减少临床检测的假阴性，通过使用主要的结核杆菌特异性抗原多肽而不是整个蛋白质的重复多肽或整个蛋白质而实现减少临床检测的假阳性，再对部分检测参数进行优化，提高检测的特异性及检测灵敏度，降低出现假阴性和假阳性的概率。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种由常规T spot检测方法改进而成的血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法。
背景技术
结核病，特别是肺结核在目前依然是个常见病，而耐药性肺结核越来越成为严重的公共卫生问题。肺结核病的诊断主要依靠胸片，痰液细菌学及分子病原体学检测，临床抗结核药物试验性治疗疗效等几方面。T spot试验，即血液细胞结核特异性免疫性反应性检测，也是临床常用辅助诊断方法之一。常规T spot试验是采用两个结核杆菌相关蛋白的抗原重叠多肽刺激病人的外周血单个核细胞，外周血单个核细胞中可能含重要的结核杆菌特异性的淋巴细胞，再检测培养液中的细胞因子释放。如果病人有活动性结核病，血液中就有结核杆菌特异性的淋巴细胞，在测试过程中就会释放大量的细胞因子而呈阳性反应。常规Tspot采用的是覆盖整个蛋白质序列的抗原的重叠多肽，因此不是最有效的抗原多肽序列，同时还含有潜在非特异性抗原多肽，可能增加非特异性反应。同时常规T spot只包含两个抗原蛋白，因此不可避免地会有一些漏诊。常规T spot检测的局限性在于其特异性及检测灵敏度有一定限制，从而存在一定的检测假阴性及假阳性，假阴性由灵敏度不够造成，假阳性由特异性不够造成。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种改进的血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法(T spot LW)，其通过对细胞刺激物及部分检测参数进行优化，提高检测的特异性及检测灵敏度，降低出现假阴性和假阳性的概率，本发明主要通过以下详细技术方案达到目的。
一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，使用有限数目的主要的结核杆菌特异性的抗原多肽而不是一个或数个蛋白质或覆盖这些蛋白质全部序列的重叠多肽作为刺激物，再检测细胞因子的释放，从而确定血液细胞对结核杆菌的特异性免疫反应性。
该血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法包括以下详细步骤：
步骤S10样品处理：取当天采集的检测对象的抗凝外周血样品，按商用试剂盒方法分离外周血单个核细胞，使用培养液稀释细胞悬液并将细胞悬液分配在细胞培养板上的反应孔内，每孔200000-300000个细胞；
步骤S20设置分组：将细胞培养板上添加有细胞悬液的反应孔定为实验组，向细胞培养板上空的反应孔加入与细胞悬液相同的溶剂作为溶剂对照组；
步骤S30细胞刺激孵育：分别向对照组和实验组加入PHA及结核杆菌特异性的抗原多肽混合物，对实验组和对照组以36-38℃和二氧化碳浓度为4-6％的条件孵育12-72小时；
步骤S40显色：孵育结束后对实验组和对照组按照常规T spot法进行显色，并进行拍照；
步骤S50结果分析：统计实验组和对照组的斑点数量，当实验组的斑点数量多于对照组斑点数量3-6个，则判定结果为阳性，否则判断为阴性。
其中，所述的步骤S30中受刺激的细胞为外周血白细胞、单个核细胞或淋巴细胞。
优选地，所述的步骤S30中添加的结核杆菌特异性的抗原多肽混合物的浓度是5-40μg/ml。
优选地，，所述的结核杆菌特异性的抗原多肽对应的蛋白质的种类数量是3-11种，包括ESAT6和CFP10蛋白质。
优选地，，所述的结核杆菌特异性的抗原多肽的长度是8-40个氨基酸。
一种如上所述的血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法在检测血液细胞结核杆菌特异性的免疫反应性试剂盒或检测平台中的应用。
本发明具有的有益效果：T spot LW是针对常规T spot检测的缺陷，重新设计、验证而建立起来的新的血液细胞结核特异性免疫性反应性检测方法，能有效地减少临床检测的假阴性及假阳性发生率。前者主要通过增加检测中覆盖常见结核杆菌结构蛋白的种类而实现，后者主要通过使用主要的结核杆菌特异性抗原多肽而不是整个蛋白质的重复多肽或整个蛋白质而实现。
覆盖常见结核杆菌结构蛋白的种类可包括常规T spot使用的ESAT6及CFP10的针对结核杆菌特异性的主要抗原多肽，同时还包括其它1-8种相对常见菌种的结核杆菌特异性蛋白质(如Rv2645，Rv2654，Rv2031，Rv1038等)的主要的特异性的抗原多肽。
使用特异性的抗原多肽而不是整个蛋白质或是覆盖蛋白质全部序列的重复多肽可以提高特异性免疫反应性，减少非特异性的免疫反应性。一般一个结核相关蛋白主要特异性的抗原多肽只有1-2个。
附图说明
图1，本发明提供的T spot LW检测方法的结核杆菌结构蛋白及所使用的细胞刺激物的示意图。
图2，常规T spot检测方法的结核杆菌结构蛋白及所使用的细胞刺激物的示意图。
其中直线代表结核杆菌结构蛋白(TSP)，带箭头线段代表抗原多肽，圆圈代表结核杆菌特异性抗原位点，三角形代表潜在的非特异性抗原位点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
取96例临床样品作为试验对象，分别采用T spot和T spot LW方法进行血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性检测，从而辅助判断检测对象是否患有结核病，其具体包括以下检测步骤。
T spot LW检测组：
步骤S10样品处理：每个临床病例取当天采集的5ml EDTA抗凝外周血样品，按商用试剂盒方法分离外周血单个核细胞，使用AIM-V培养液稀释细胞悬液并将细胞悬液分配在96孔细胞培养板上的反应孔内，每孔250000个细胞。
步骤S20设置分组：将细胞培养板上添加有细胞悬液的反应孔定为实验组，向细胞培养板上空的反应孔加入与细胞悬液相同的溶剂作为溶剂对照组。
步骤S30细胞刺激孵育：分别向对照组和实验组加入PHA及结核杆菌特异性的抗原多肽混合物，每段多肽长度是8-40个氨基酸，混合物的多肽终浓度为24ug/ml，混合物所使用的溶剂是二甲亚砜，二甲亚砜的终浓度为2％，将实验组和对照组以37℃和二氧化碳浓度为5％的条件孵育12-72小时。
步骤S40显色：孵育结束后对实验组和对照组按照常规T spot法进行显色，并进行拍照。
步骤S50结果分析：统计实验组和对照组的斑点数量，当实验组的斑点数量多于对照组斑点数量3-6个，则判定结果为阳性，否则判断为阴性。
常规T spot检测组：
将每个临床病例取当天采集的5ml EDTA抗凝外周血样品，采用常规的T spot方法检测血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性，分析检测结果。
将上述的T spot LW检测组和常规T spot检测组中的检测结果进行对比，两种检测方法结果吻合率为87.5％,其中12例检测结果不吻合。
不吻合的12例中有比较完整临床资料的9例。其中，根据重要临床信息(胸片、痰液细菌学及分子病原体学检测)能作临床结核病诊断的3例，这3例病人样品常规T spot法检出1例，T spot LW检出2例，其中1例是治疗恢复期病人样品常规T spot法已经阴转，但Tspot LW仍然是阳性，显示T spot LW法检测灵敏度高于常规T spot法，因此漏诊率/假阴性率较低。
不吻合的12例中，临床怀疑结核病，但缺乏重要临床其它信息(胸片，痰液细菌学及分子病原体学检测)支持的4例，这4例常规T spot法均呈阳性，而T spot LW法均呈阴性。显示T spot LW法与临床重要特异性结核指标吻合率较高，特异性较好，假阳性率较常规Tspot法明显低。
不吻合的12例中，另外2例分枝杆菌检测阳性，常规T spot法及T spot LW法各检出1例。
上述实验结果可提示发明T spot LW法具有更高的特异性和检测灵敏度。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于使用有限数目的主要的结核杆菌特异性的抗原多肽而不是一个或数个蛋白质或覆盖这些蛋白质全部序列的重叠多肽作为刺激物，再检测细胞因子的释放，从而确定血液细胞对结核杆菌的特异性免疫反应性。
2.根据权利要求1所述的一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：
步骤S10样品处理：取当天采集的检测对象的抗凝外周血样品，按商用试剂盒方法分离外周血单个核细胞，使用培养液稀释细胞悬液并将细胞悬液分配在细胞培养板上的反应孔内，每孔200000-300000个细胞；
步骤S20设置分组：将细胞培养板上添加有细胞悬液的反应孔定为实验组，向细胞培养板上空的反应孔加入与细胞悬液相同的溶剂作为溶剂对照组；
步骤S30细胞刺激孵育：分别向对照组和实验组加入植物血凝素(PHA)及结核杆菌特异性的抗原多肽混合物，对实验组和对照组以36-38℃和二氧化碳浓度为4-6％的条件孵育12-72小时；
步骤S40显色：孵育结束后对实验组和对照组按照常规T spot法进行显色，并进行拍照；
步骤S50结果分析：统计实验组和对照组的斑点数量，当实验组的斑点数量多于对照组斑点数量3-6个，则判定结果为阳性，否则判断为阴性。
3.根据权利要求2所述的一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于，所述的步骤S30中受刺激的细胞为外周血白细胞、单个核细胞或淋巴细胞。
4.根据权利要求2所述的一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于，所述的步骤S30中添加的结核杆菌特异性的抗原多肽混合物的浓度是5-40μg/ml。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于，所述的结核杆菌特异性的抗原多肽对应的蛋白质的种类数量是3-11种，包括ESAT6和CFP10蛋白质。
6.根据权利要求5所述的一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法，其特征在于，所述的结核杆菌特异性的抗原多肽的长度是8-40个氨基酸。
7.一种如权利要求1-6任一所述的血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法在检测血液细胞结核杆菌特异性的免疫反应性试剂盒或检测平台中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710795249.XA CN107632155A (zh) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710795249.XA CN107632155A (zh) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107632155A true CN107632155A (zh) | 2018-01-26 |
Family
ID=61100214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710795249.XA Pending CN107632155A (zh) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107632155A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102183649A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-09-14 | 中国农业大学 | 牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒 |
| CN105541975A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-05-04 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | 一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的混合多肽 |
| CN105954521A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 |
| CN106501530A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-03-15 | 复旦大学附属华山医院 | 一种诊断结核杆菌感染的生物标志物及其相关试剂盒 |
| CN106546737A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-29 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | 一种体外检测活动性结核的方法 |
| CN106939035A (zh) * | 2016-01-04 | 2017-07-11 | 武汉大学 | 一种结核分枝杆菌t细胞抗原表位多肽及其应用 |
-
2017
- 2017-09-06 CN CN201710795249.XA patent/CN107632155A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102183649A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-09-14 | 中国农业大学 | 牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒 |
| CN105541975A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-05-04 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | 一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的混合多肽 |
| CN106939035A (zh) * | 2016-01-04 | 2017-07-11 | 武汉大学 | 一种结核分枝杆菌t细胞抗原表位多肽及其应用 |
| CN105954521A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 |
| CN106546737A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-29 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | 一种体外检测活动性结核的方法 |
| CN106501530A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-03-15 | 复旦大学附属华山医院 | 一种诊断结核杆菌感染的生物标志物及其相关试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Iannetta et al. | T-cell responses to SARS-CoV-2 in multiple sclerosis patients treated with ocrelizumab healed from COVID-19 with absent or low anti-spike antibody titers | |
| CN105954521B (zh) | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 | |
| Ioos et al. | Alternative sputum collection methods for diagnosis of childhood intrathoracic tuberculosis: a systematic literature review | |
| CN106537146A (zh) | 生物标志 | |
| Ardalan et al. | Anti-phospholipase A2 receptor antibody in idiopathic membranous nephropathy: A report from Iranian population | |
| CN112946261A (zh) | 一种基于三聚体s蛋白rbd-ace2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒 | |
| Tong et al. | Re-evaluating the sensitivity of the rabbit infectivity test for Treponema pallidum in modern era | |
| Hunter et al. | Effect of patient immunodeficiencies on the diagnostic performance of serological assays to detect Aspergillus-specific antibodies in chronic pulmonary aspergillosis | |
| HaileMariam et al. | Protein and microbial biomarkers in sputum discern acute and latent tuberculosis in investigation of pastoral Ethiopian cohort | |
| Shao et al. | Comparison of diagnostic accuracy of the GeneXpert Ultra and cell-free nucleic acid assay for tuberculous meningitis: a multicentre prospective study | |
| Inui et al. | Use of the QuantiFERON-TB Gold test in Japanese patients with sarcoidosis | |
| CN109991417B (zh) | 一种结核病的免疫标志物及应用 | |
| CN111443208A (zh) | 鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的组合物 | |
| JP6193976B2 (ja) | バイオマーカーとしてのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）・デヒドロゲナーゼおよび毒素 | |
| CN106191286A (zh) | 布鲁氏菌的检测方法、试剂盒及其应用 | |
| CN105241986B (zh) | 区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者的蛋白特征谱 | |
| Kang et al. | Dynamics of disease characteristics and viral RNA decay in patients with asymptomatic and mild infections during the Omicron wave in Shanghai, China: a retrospective cohort study | |
| CN112684183A (zh) | 一种多抗原蛋白组合应用于肺结核的鉴别与诊断 | |
| CN107632155A (zh) | 一种血液细胞对结核杆菌特异性免疫反应性的检测方法 | |
| CN115932278A (zh) | 一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法 | |
| CN105388291B (zh) | 一种快速诊断活动性结核病的gamma delta T细胞表面活化分子及试剂盒 | |
| WO2017173698A1 (zh) | 用于诊断结核分枝杆菌感染的分子标志物、引物组及应用 | |
| US20150010927A1 (en) | Detecting latent tuberculosis infections | |
| TW201100801A (en) | Serum biomarkers and the testing methods for diagnosing liver fibrosis | |
| Jiang et al. | Research progress on detection methods of the asymptomatic COVID-19 infected persons. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180126 |