CN115932278A - 一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法 - Google Patents

一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法 Download PDF

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肖蓉
何志义
王宏伟
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Abstract

本发明公开了一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，属于检测方法技术领域。该方法包括THP‑1细胞经PMA诱导分化、血清与γ干扰素混合孵育、混合液制备及裂解、转膜等步骤。本申请由于采用了通过检测STAT1通路的磷酸化表达代替了常规的酶联免疫吸附试验，由于蛋白质免疫法具有准确、高效、精准特点，因此，本申请的技术方案具有高效准确检测抗γ干扰素抗体阴阳性，及通过条带灰度值来对抗体含量进行定量，对患者的康复治疗有着重要作用。

Description

一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法
技术领域
本发明属于检测方法技术领域，具体涉及一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法。
背景技术
破坏IFN-γ信号的中和性抗IFN-γ自身抗体(简称AIGAs)已被确定为新的获得性免疫缺陷综合征，该综合征对非结核分枝杆菌(NTM)和其他细胞内病原体的易感性增加。目前发现越来越多的抗γ干扰素自身抗体综合征患者，这表明AIGAs可能是一种被低估的、尚未充分认识的疾病。
对AIGAs患者治疗的关键就是早期准确诊断。由于抗γ干扰素抗体阴性或者阳性患者引起的临床症状、影像学特征极为相似，但相关机制研究较少,关于临床用药指导也没有明确指南，所以对于AIGAs患者的抗γ干扰素抗体阴阳性有效鉴定在AIGAs的诊断、鉴别诊断、治疗及流行病学调查极为关键。
AIGAs的常用诊断方法包括酶联免疫吸附试验(简称ELISA)、流式细胞术分析等方法，上述方法都存在着诊断耗时较长或是需要昂贵的仪器等问题。此外，ELISA是临床上普遍采用的抗γ干扰素抗体阴阳性常用的方法，其具有操作简便、诊断速度快的特点，但还存在着没有明确的判定标准，以及检测结果特异性较差、假阳性率高等问题。流式细胞术分析是科研上常采用的AIGAs诊断初步鉴定的可靠方法，但该方法存在着操作复杂、结果易受检测者主观因素影响等问题。
对此，发明人发明了一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，以解决背景技术存在的技术问题。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1、THP-1细胞经PMA诱导分化混合，在培养箱中培养，得混合液A；患者血清与γ干扰素混合孵育，得混合液B；
S2、步骤S1的混合液A与混合液B一起混合，培养0.5-2h，得混合液C；
S3、步骤S2的混合液C在含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(目录号78440)的RIPA裂解缓冲液中裂解，得混合液D；
S4、步骤S3的混合液D在总蛋白(10μg/泳道)通过10％SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜，用5％BSA封闭1h；
S5、步骤S4的膜与以下一抗孵育：STAT1(1:1,000)、p-STAT1(1:1,000)和GAPDH(1:5,000)，在120转速下洗膜3次5min，70转速下洗膜3次10min,再与HRP偶联二抗(1:5,000)孵育；孵育1h后再次洗膜后使用ECL显影；
S6、将S5显影的印迹与HRP缀合的山羊抗人或抗兔IgG杂交，并使用ECL western印迹检测试剂盒(Fudebio-tech)开发，使用ImageJ软件定量蛋白质的相对信号强度。
进一步地，所述步骤S1中，培养条件为：温度37℃，培养箱中CO2的体积浓度5％，培养时间24h。
进一步地，所述步骤S1中，血浆经预处理除去纤维蛋白原，所述γ干扰素的使用浓度为20ng/mL。
进一步地，所述步骤S1中，孵育时间具体为：孵育温度为4℃的，孵育时间为24h；孵育温度为24-27℃的，孵育时间为1-2h；孵育温度为37℃的，孵育时间为0.5h。
进一步地，所述步骤S3中，蛋白酶抑制剂为(Cocktail HY-K0010),磷酸酶抑制剂为(Cocktail I HY-K0021和Cocktail II HY-K0022)。
进一步地，所述步骤S4中，电泳参数为先恒压80V,时间30min，跑出浓缩胶至下层胶；再将电压调至120V，时间40min。
进一步地，所述转移至PVDF膜的条件为，恒流350mA，时间70min。
进一步地，所述步骤S5孵育的条件为：与一抗在4℃下孵育24h，与二抗在25℃下孵育1h，二抗的孵育温度为室温即可。
进一步地，上述检测方法用于判断抗γ干扰素自身抗体的阴阳性，条带显影则为阴性，不显影则为阳性。
本方法的原理在于，正常情况下γ干扰素和γ干扰素受体结合，激活stat1通路，STAT1磷酸化；正常人没有γ干扰素抗体中和功能，激活stat1通路，STAT1磷酸化，如果患者γ干扰素抗体阳性，中和了γ干扰素，γ干扰素不能和受体结合，stat1通路不能被激活，STAT1不能磷酸化，则不显示条带。
本发明的优点是：通过检测STAT1通路磷酸化的表达来检测抗γ干扰素抗体阴阳性及抗体的中和活性功能，既能检测出抗γ干扰素抗体的阴阳性又能定量检测其含量，利用条带上的灰度值还能定量精确的对比到患者每次复查的好准程度；先进行血清孵育，再进行转膜操作，能更好地模拟人体环境，获得较高的检测结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的显影结果。
图2为实施例1的条带定量结果
图3为对比例2的显影结果。
图4为对比例3的显影结果。
具体实施方式
为便于更好地理解本发明，结合附图通过以下实例加以说明，这些实例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
实施例
一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1、THP-1细胞经PMA诱导分化混合，在培养箱中培养，得混合液A；患者血清与γ干扰素混合孵育，得混合液B；
S2、步骤S1的混合液A与混合液B一起混合，培养0.5-2h，得混合液C；
S3、步骤S2的混合液C在含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(目录号78440)的RIPA裂解缓冲液中裂解，得混合液D；
S4、步骤S3的混合液D在总蛋白(10μg/泳道)通过10％SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜，用5％BSA封闭1h；
S5、步骤S4的膜与以下一抗孵育：STAT1(1:1,000)、p-STAT1(1:1,000)和GAPDH(1:5,000)，在120转速下洗膜3次5min，70转速下洗膜3次10min,再与HRP偶联二抗(1:5,000)孵育；孵育1h后再次洗膜后使用ECL显影；
S6、将S5显影的印迹与HRP缀合的山羊抗人或抗兔IgG杂交，并使用ECL western印迹检测试剂盒(Fudebio-tech)开发，使用ImageJ软件定量蛋白质的相对信号强度。
步骤S1中，培养条件为：温度37℃，培养箱中CO2的体积浓度5％，培养时间24h。
步骤S1中，血浆经预处理除去纤维蛋白原，γ干扰素的使用浓度为20ng/mL。
步骤S1中，孵育时间具体为：孵育温度为4℃的，孵育时间为24h；孵育温度为24-27℃的，孵育时间为1-2h；孵育温度为37℃的，孵育时间为0.5h。
步骤S3中，蛋白酶抑制剂为(Cocktail HY-K0010),磷酸酶抑制剂为(Cocktail IHY-K0021和Cocktail II HY-K0022)。
步骤S4中，电泳参数为先恒压80V,时间30min，跑出浓缩胶至下层胶；再将电压调至120V，时间40min。
转移至PVDF膜的条件为，恒流350mA，时间70min。
步骤S5孵育的条件为：与一抗在4℃下孵育24h，与二抗在25℃下孵育1h。
上述检测方法用于判断抗γ干扰素自身抗体的阴阳性，条带显影则为阴性，不显影则为阳性。
试验
1.样品说明
空白组，编号为B，未加血清。
对照组，采集正常人的血浆，编号为N，血浆经处理得血清。
试验组，抗γ干扰素自身抗体阴性人员和阳性人员6人，采集相应的血浆，分别编号为P1、P2、P3、P4、P5、P6，血浆经处理得血清。
2.判断标准
印迹检测：显影为阳性，不显影为阴性。
ELISA检测：阳性OD>0.5，反之为阴性。
3.试验方法
实施例1
采用本发明的方法进行处理，血清10uL与γ干扰素混合孵育0.5h。
对比例1
采用ELISA对阴性和阳性人员进行检测，滴度1：2500。
对比例2
转膜后在膜上加血清20uL孵育15min。
对比例3
转膜后在膜上加血清10uL孵育1h。
4.结果说明
实施例1的检测结果参见表1和图1、图2，对比例1的检测结果参见表2，对比例2的检测结果参见图3，对比例3的检测结果参见图4。
表1实施例1的定量化结果
项目 GAP STAT1 pSTAT1 pSTAT1/GAPDH
B 30055.761 24088.468 12080.276 0.402
N 27216.518 25109.054 24714.953 0.908
P1 29534.225 26012.054 9087.225 0.308
P2 28965.175 26379.882 10116.296 0.349
P3 29105.347 23194.468 21257.296 0.730
P4 29969.468 26391.054 14256.539 0.476
P5 27323.397 21423.104 8692.518 0.318
P6 29710.104 23847.811 23945.296 0.806
表2ELISA的试验检测结果
项目 OD值 结果
B 0.001 -
N 0.0526 阴性
P1 2.2275 阳性
P2 2.423 阳性
P3 0.08 阴性
P4 1.9265 阳性
P5 2.721 阳性
P6 0.0665 阴性
条带显影的为阴性，未显影的为阳性。从表2的结果中可知，实施例1所使用本申请的方法与对比例1所使用的ELISA结果一致，均是P3和P6显影，即位阴性，P1、P2、P4、P5不显应，为阳性；表明使用本申请的方法检测抗γ干扰素自身抗体综合征具有较高的准确率，可以作为金标准，且使用成本相对ELISA的更低。
从图1、图3、图4的条带结果可知，实施例1与对比例2、对比例3的结果对比表明，试验步骤对检测结果有关键影响，特别是血清孵育再转膜，还是转膜再加血清孵育。本申请是血清孵育再转膜，结果准确性较高，而对比例2、对比例3是转膜再与血清孵育，导致不显影或显影有误，进而影响检测结果，导致误诊。因此，可知加血清孵育的步骤至关重要，本申请使用的方法具有更为准确的检测结果。
从图2可知，使用本发明的方法可以通过条带显影的强度进行抗γ干扰素自身抗体的含量定量。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、THP-1细胞经PMA诱导分化混合，在培养箱中培养，得混合液A；患者血清与γ干扰素混合孵育，得混合液B；
S2、步骤S1的混合液A与混合液B一起混合，培养0.5-2h，得混合液C；
S3、步骤S2的混合液C在含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(目录号78440)的RIPA裂解缓冲液中裂解，得混合液D；
S4、步骤S3的混合液D在总蛋白(10μg/泳道)通过10％SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜，用5％BSA封闭1h；
S5、步骤S4的膜与以下一抗孵育：STAT1(1:1,000)、p-STAT1(1:1,000)和GAPDH(1:5,000)，在120转速下洗膜3次5min，70转速下洗膜3次10min,再与HRP偶联二抗(1:5,000)孵育；孵育1h后再次洗膜后使用显影；
S6、将S5显影的印迹与HRP缀合的山羊抗人或抗兔IgG杂交，并使用印迹检测试剂盒开发，定量蛋白质显影的相对信号强度。
2.根据权利要求1所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，培养条件为：温度37℃，培养箱中CO2的体积浓度5％，培养时间24h。
3.根据权利要求2所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，血浆经预处理除去纤维蛋白原，所述γ干扰素的使用浓度为20ng/mL。
4.根据权利要求3所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，孵育时间具体为：孵育温度为4℃的，孵育时间为24h；孵育温度为24-27℃的，孵育时间为1-2h；孵育温度为37℃的，孵育时间为0.5h。
5.根据权利要求4所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，蛋白酶抑制剂为(Cocktail HY-K0010),磷酸酶抑制剂为(Cocktail I HY-K0021和Cocktail II HY-K0022)。
6.根据权利要求5所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，电泳参数为先恒压80V,时间30min，跑出浓缩胶至下层胶；再将电压调至120V，时间40min。
7.根据权利要求6所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述转移至PVDF膜的条件为，恒流350mA，时间70min。
8.根据权利要求7所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S5孵育的条件为：与一抗在4℃下孵育24h，与二抗在25℃下孵育1h。
9.如权利要求1-8所述的一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法的抗体含量评估，其特征在于，上述检测方法用于判断抗γ干扰素自身抗体的阴阳性，条带显影则为阴性，不显影则为阳性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117074687A (zh) * 2023-07-06 2023-11-17 广州医科大学附属第一医院 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用

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