TWI458978B

TWI458978B - 判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法

Info

Publication number: TWI458978B
Application number: TW100148886A
Authority: TW
Inventors: Chengchung Chou; Chiawei Kuo; Chiwei Tseng; Yihan Huang; Poren Hsueh; Panchyr Yang
Original assignee: Chengchung Chou
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2014-11-01
Also published as: TW201326815A

Description

判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法

本發明是有關於判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法。

結核病(tuberculosis；TB)之致病原為結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )，俗稱結核桿菌，主要是經由飛沫而傳染，感染的部位以肺部最常見。然而並非所有受感染者皆會發病，已受到結核菌感染而未發病的情況稱為潛伏性結核感染(latent TB infection；LTBI)，此類患者無任何症狀產生，亦不具傳染性。部份潛伏性結核感染者在自身免疫力降低時，將出現具感染性的開放性結核病(active TB disease；ATBD)。

目前常用的結核菌感染檢測方式有細菌培養、抗酸性染色(acid fast stain；AFS)、結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test；TST)和T細胞干擾素釋放試驗(T-cell interferon gamma release assays；IGRAs)等，其中T細胞干擾素釋放試驗又包括QuantiFERON Gold試驗和T-SPOT.TB試驗。

然而，上述方式在應用上皆有極大的限制。細菌培養需花費3週至8週才可得到檢測結果，而抗酸性染色雖可快速檢測，但其敏感度及特異性都不高。至於結核菌素皮膚試驗，其易受卡介苗接種與非結核分支桿菌(nontuberculous mycobacteria；NTM)感染而影響專一性，且可能造成過敏等不良反應，而T細胞干擾素釋放試驗則需經過細胞培養，其成本與技術要求層面較高，造成推廣不易。

現今結核病檢驗試劑的研究發展中，著重以血清篩檢方式進行結核菌檢測。然而，結核菌誘導出的抗體在患者個體之間存在異質性(heterogeneity)，導致傳統血清篩檢法的靈敏度不佳。

因此，本發明之一態樣是在提供一種判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法，包含自人類個體獲得血液樣本，再利用結核菌抗原蛋白質晶片偵測血液樣本中之多個結核菌抗體之至少一者的存在並獲得對應之一訊號值，且每一結核菌抗體之訊號值係分別對應於一係數值，其中此結核菌抗原蛋白質晶片包含多個結核菌抗原，且此些結核菌抗原包含Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875。

接著，利用線性判別分析(linear discriminant analysis；LDA)與訊號值所對應之係數值，計算出感染分數，再根據此感染分數與一預設閾值進行比較，藉此確認該人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染。

依據本發明之一實施方式，上述血液樣本為血清樣本。

依據本實施方式之一實施例，上述比較感染分數與預設閾值之步驟中，更至少包含下列步驟：根據血液樣本偵測Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875之感染分數與預設閾值進行比較，以獲得一第一結果，藉此確認此人類個體為健康或開放性結核菌感染。

根據血液樣本偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv2031之感染分數與預設閾值進行比較，以獲得一第二結果，藉此確認人類個體為健康或潛伏性結核菌感染。

根據血液樣本偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv3129之感染分數與預設閾值進行比較，以獲得一第三結果，藉此確認人類個體為開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染。

而後，當第一結果、第二結果及第三結果之任二者相同時，確認該人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染。

本發明之另一態樣是在提供一種判別開放性或潛伏性結核菌感染之套組，其包含結核菌抗原蛋白質晶片，此結核菌抗原蛋白質晶片包含多個結核菌抗原，此些結核菌抗原包含Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875。

依據本發明之一實施方式，上述判別開放性或潛伏性結核菌感染之套組更包含二級抗體，以與人類免疫球蛋白G專一性結合。

應用本發明之判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法，其係利用多種抗原組合之結核菌抗原蛋白質晶片，以血清篩檢方式進行結核菌檢測，將結果利用線性判別方法分析，可快速、簡便且準確確認此人類個體為健康或結核菌感染狀態。

本發明之判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法係利用多種抗原組合，以血清篩檢方式進行結核菌檢測，將結果利用線性判別方法分析，可區別潛伏性肺結核、開放性肺結核的病患以及健康人。

請參照第1圖，其為依照本發明一實施例之判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法100的步驟流程圖。首先，自一人類個體獲得一血液樣本，如步驟110所示。

接著，利用結核菌抗原蛋白質晶片偵測血液樣本中之多個結核菌抗體並獲得對應之訊號值，如步驟120所示。此結核菌抗原蛋白質晶片上包含Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875之結核菌抗原，若血液樣本中存在可與上述結核菌抗原結合之抗體，則抗體與抗原結合即可偵測出一訊號值。且每一結核菌之訊號值分別對應於由線性判別分析計算而得之係數值。上述訊號值之偵測方法可利用酵素聯結免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)或蛋白質陣列(protein array)分析進行，此為本領域之通常知識，故不另加贅述。

之後，利用線性判別分析法分析所得之訊號值，以計算出一感染分數，如步驟130所示。此係將訊號值代入由線性判別分析法所得之公式，並利用訊號值所對應之係數值計算出一感染分數。而後，根據此感染分數與一預設閾值進行比較，藉此確認此人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染，如步驟140所示。

在上述比較感染分數與預設閾值之步驟140中，更至少包含下列步驟，請參考第2圖，其為依照本發明一實施例之步驟140的步驟流程圖。

步驟141為偵測Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875，以確認人類個體為健康或開放性結核菌感染，其係根據血液樣本偵測上述9個結核菌抗原之感染分數與預設閾值進行比較，藉以確認感染狀態。

步驟142為偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv2031，以確認人類個體為健康或潛伏性結核菌感染，其係根據血液樣本偵測上述4個結核菌抗原之感染分數與預設閾值進行比較，藉以確認感染狀態。

步驟143為偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv3129，以確認人類個體為開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染，其係根據血液樣本偵測上述4個結核菌抗原之感染分數與預設閾值進行比較，藉以確認感染狀態。

進行完步驟141至步驟143後，當上述感染狀態結果之任二者相同時，確認此人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染，如步驟144所示。

以下利用數個實施方式以說明本發明之蛋白質晶片可提供未來檢測開放性或潛伏性結核病之應用基礎。

實施例一：結核菌抗原蛋白質晶片之製備與分析 1、結核菌抗原蛋白質晶片之製備

根據Leyten EM、Lin MY和Franken KL等人發表的論文「Human T-cell responses to 25 novel antigens encoded by genes of the dormancy regulon of Mycobacterium tuberculosis. Microbes Infect. 8:2052-60(2006)」指出，有25個與結核菌休眠調節子[dormancy(DosR) regulon]有關的抗原可能具有潛力可用以鑑定潛伏性結核菌感染，其為Rv0079、Rv0569、Rv0572、Rv1733、Rv1738、Rv1813、Rv1996、Rv2007、Rv2029、Rv2030、Rv2031、Rv2032、Rv2623、Rv2624、Rv2626、Rv2627、Rv2628、Rv3126、Rv3127、Rv3129、Rv3130、Rv3131、Rv3132、Rv3133及Rv3134。惟此論文並未具體指出或啟示如何應用上述抗原判斷健康或結核菌感染狀態。此外，目前T細胞干擾素釋放試驗所使用的另二種結核菌專一性抗原Rv3874和Rv3875，可以排除卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin；BCG)以及大部份的非結核分支桿菌之干擾，提高檢測的特異性。因此，首先將上述27個抗原進行重組蛋白的表達純化，但發現其中Rv1733和Rv1813二個抗原蛋白無法表達出來，所以最後使用剩餘的25個重組蛋白抗原製備結核菌抗原蛋白質晶片。

本實施例將上述欲打點的25個結核菌重組蛋白抗原以磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline；PBS)調整為濃度0.2 mg/ml至1 mg/ml之蛋白質溶液，另以濃度1 mg/ml之人類凝血酶(thrombin)作為陰性控制組，0.75mg/ml之鼠抗人類免疫球蛋白G1(mouse anti-human immunoglobin G1；mouse anti-human IgG1)單株抗體作為陽性控制組，1 mg/ml之人類免疫球蛋白G作為內在控制組，以及磷酸鹽緩衝液作為空白組。上述樣品溶液皆含有10%之甘油(glycerol)與0.1%之溴酚藍(bromophenol blue)染劑，並分別裝入96孔盤中備用。

接著，利用微陣列晶片自動打點機，將所有樣品溶液分別以二重複的方式點於硝化纖維膜(nitrocellulose membrane，Bio-Red)上，製備成結核菌抗原蛋白晶質片。請參照第3(A)圖，其為依照本發明一實施例之結核菌抗原蛋白質晶片之配置示意圖，其打點配置係為8×8矩陣排列，點的直徑大小約為100 μm，點與點間距離約為700 μm。NC陰性控制組，PC表示陽性控制組，IgG表示人類免疫球蛋白G，而Blank表示空白組。之後，將打點好的結核菌抗原蛋白晶片置於4℃中保存。

惟本發明經後續實施例二之統計分析後，其結果顯示以上述25種抗原中的Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133和Rv3875之9種抗原進行判別分析，靈敏度與特異性均可提升，因此在此詳述此9種抗原的純化方式，其他抗原的純化方式則不另加描述。

結核菌抗原以重組蛋白的方式進行表達，其中Rv2031、Rv2626和Rv3133可利用組胺酸標記(histidine tag；His-tag)載體在大腸桿菌中表達，且為可溶性蛋白；Rv2628、Rv3131、Rv1996和Rv2030可利用His-tag載體在大腸桿菌中表達，為不可溶性蛋白；而Rv0569和Rv3875可利用谷胱甘肽S轉移酶標記(glutathione-S-transferase；GST-tag)載體在大腸桿菌中表達。

Rv2031的表現質體係將序列辨識編號1的序列構築入pET-15b載體，Rv2626和Rv3133的表現質體則是將序列辨識編號2和序列辨識編號3的序列分別構築入pET-28a載體。Rv2628和Rv3131的表現質體係將編號4和序列辨識編號5的序列分別構築入pET-28a載體，Rv1996和Rv2030的表現質體係將序列辨識編號6和序列辨識編號7的序列分別構築入pET-15b載體。Rv0569和Rv3875是將序列辨識編號8和序列辨識編號9的序列分別構築入pGEX4T-3載體。上述表現質體的構築方式為本技術領域的通常知識，故在此不另加贅述。

組胺酸標記之可溶性重組蛋白的純化方法係將基因轉殖之大腸桿菌大量培養至1升菌液後，加入1000X之異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)，在37℃培養3小時，以誘導重組蛋白表達。之後，將菌液以8000 rpm離心，倒除上清液，再加入500 μl懸浮緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ 、0.15 M NaCl、10 mM Imidazole、0.5% Triton X-100，pH=8.0)使菌體懸浮，然後再加入100 mg/ml之溶菌酶(lysozyme)、10 mM之苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride；PMSF)與1X之大腸桿菌蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)，進行法式高壓破菌法(French press)破菌。接著，以13000 rpm離心30分鐘，取上清液與組胺酸選擇鎳親合凝膠珠(His Select Nickel Affinity Gel beads，Sigma)在4℃震盪器中混合2小時，再以1000 g離心3分鐘後去除上清液。接著，加入500 μl清洗緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ 、0.15M NaCl、10/15/20mM Imidazole、0.5% Triton X-100，pH=8.0)均勻清洗，再以1000 g離心3分鐘，重複清洗步驟3次。然後，加入500 μl沖提緩衝液(50mM NaH₂ PO₄ 、0.15M NaCl、250mM Imidazole、0.5% Triton X-100，pH=8.0)洗提重組蛋白，重複洗提步驟3次，最後將蛋白質裝於微量離心管，以13000 rpm離心5分鐘，並取其上清液進行冷凍乾燥，再以含15%甘油之磷酸鹽緩衝液回溶，保存於-20℃。

組胺酸標記之不可溶性重組蛋白的純化方法係將基因轉殖之大腸桿菌大量培養至1升菌液後，加入1000X之異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在37℃培養3小時，以誘導重組蛋白表達。之後，將菌液以8000 rpm離心，倒除上清液，再加入500 μl懸浮緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ 、0.15 M NaCl、10 mM Imidazole、0.5% Triton X-100、6 M Urea，pH=8.0)使重組蛋白變性而溶解，然後再加入100 mg/ml之溶菌酶、10 mM之苯甲基磺醯氟與1X之大腸桿菌蛋白酶抑制劑，進行超音波破菌。接著，以13000 rpm離心30分鐘，取上清液與組胺酸選擇鎳親合凝膠珠在4℃震盪器中混合2小時，再以1000 g離心3分鐘後去除上清液；接著加入500 μl清洗緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ 、0.15M NaCl、10/15/20mM Imidazole、0.5% Triton X-100、6M Urea，pH=8.0)均勻清洗，再以1000 g離心3分鐘，重複清洗步驟3次。然後，加入500 μl沖提緩衝液(50m M NaH₂ PO₄ 、0.15M NaCl、250mM Imidazole、0.5% Triton X-100、6M Urea，pH=8.0)洗提重組蛋白，重複洗提步驟3次。將洗提出的蛋白質濃度調整為0.1至0.4 μg/μl，裝在透析袋中，利用含不同濃度尿素的透析緩衝液(20 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA、25 mM Arginine、25 mM glutamic acid、1mM benzamidine、5% Glycerol、4M/3M/2M/1M/0.5M/0M Urea，pH=8.0)進行6次透析，每經2至3小時即更換至較低尿素濃度的透析緩衝液，使蛋白質慢慢復性(renature)，最後將蛋白質裝於微量離心管，以13000 rpm離心5分鐘，並取其上清液進行冷凍乾燥，再以含15%甘油之磷酸鹽緩衝液回溶，保存於-20℃。

谷胱甘肽S轉移酶標記之重組蛋白的純化方法係將基因轉殖之大腸桿菌大量培養至500 ml菌液，接著加入500 μ之1000X的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在37℃培養3小時或於15℃培養16至18小時，以誘導重組蛋白表達。之後，將菌液以4000 rpm離心，倒除上清液，加入20 ml之谷胱甘肽S轉移酶再懸浮緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH=8.0、0.2 mM EDTA、4 mM benzamine、10 mM DTT、0.3 M NaCl)使菌體懸浮，然後再加入100 mg/ml之溶菌酶、10mM之苯甲基磺醯氟與1X之大腸桿菌蛋白酶抑制劑進行法式壓破菌。接著，以13000 rpm離心30分鐘，再進行破菌。此外，在破菌的同時，利用1 ml之磷酸鹽緩衝液清洗谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠(Glutathione sepharose 4B beads，Amersham Biosciences)，以1000 g離心3分鐘，倒除上清液，重複清洗三次。接著，將破菌後的上清液與清洗後的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠在4℃的震盪器中混合2小時，再以1000 g離心3分鐘。然後，依序加入15 ml不同氯化鈉濃度的清洗緩衝液(2.7 mM KCl、10 mM Na₂ HPO₄ 、2 mM KH₂ PO₄ 、137 mM/337 mM/637 mM NaCl、0.3% Triton X-100，pH=8.0)均勻清洗，以1000 g離心3分鐘，共清洗3次，並收集清洗後之谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠。利用Bradford蛋白質定量分析測得谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠上蛋白質的濃度，加入等量的凝血酶(例如：1 mg的重組蛋白加入1 mg凝血酶)，於23℃中作用16小時，讓谷胱甘肽S轉移酶標記自重組蛋白中切除，再以1000 g離心5分鐘，收集其上清液加入甘油至15%並測其濃度，保存於-20℃。

2、臨床血清樣本來源：

本實施例之血清樣本是與臺灣大學附設醫院薛博仁醫師合作，分別搜集臨床上確診為開放性結核菌感染病患以及潛伏性結核菌感染病患二種不同組別的血液樣本。此外，亦於國立中正大學搜集一般健康民眾之血清樣本，作為本實施例之健康人組。三個組別的詳細定義如下：

(1)　開放性結核菌感染病患組：痰液檢體經抗酸性染色檢測為陽性，且經結核菌培養鑑定後確診為感染結核分枝桿菌。

(2)　潛伏性結核菌感染病患組：痰液檢體經抗酸性染色檢測為陰性，且經結核菌培養鑑定為陰性，但以T-SPOT試驗進行淋巴球干擾素γ測試結果為陽性。

(3)　健康人組：一般健康民眾，無結核病或其他免疫抑制疾病(例如糖尿病等)之病史或服用其他免疫抑制藥物者。

上述之血液樣本以2000 rpm，4℃離心5分鐘後取其血清，並置於-20℃保存。

3、結核菌抗原蛋白質晶片雜交與呈色反應

先將結核菌抗原蛋白質晶片於室溫下以TBST(20mM Tris、250mM NaCl、0.1% Tween 20)緩衝液潤濕，清洗晶片上的溴酚藍染劑，再將結核菌抗原蛋白質晶片泡在阻隔緩衝液(blocking buffer於2%牛血清白蛋白的TBST)中阻隔1小時。阻隔結束後，取3 μl血清樣本，以阻隔緩衝液稀釋至300 μl(稀釋倍率1:100)，再將阻隔後的結核菌抗原蛋白質晶片轉浸泡在稀釋的血清混合液中，於室溫下搖晃1小時進行雜交反應。雜交完畢後以TBST緩衝液清洗三次。接著取12 μl標記上奈米金的二級抗體以阻隔緩衝液稀釋至300 μl(稀釋倍率1:25)，再將轉印膜浸泡在該溶液中，於室溫下搖晃1小時進行雜交反應，雜交完畢後以TBST緩衝液清洗三次，最後以二次水清洗一次。接著將此蛋白質晶片以銀增強試劑套組(Silver enhancement kit，Sigma)進行訊號放大之呈色反應約10分鐘至12分鐘，之後再加入二次水終止反應，最後以2.5%之硫代硫酸鈉(Sodium Thiosilfate)溶液浸泡2分鐘至3分鐘固定並風乾晶片。請參照第3(B)圖，其為依照本發明一實施例之結核菌抗原蛋白質晶片之呈色圖，每一結核菌抗原蛋白質晶片的陰性控制組與空白組皆無呈色，而陽性控制組與內在控制組皆有呈色。

在此說明的是，二級抗體上可標記其他標記物(例如：辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase；HRP))，再進行後續雜交反應，並根據二級抗體的標記物以不同反應試劑進行呈色反應。標記有標記物之二級抗體和呈色試劑可經購買而得，亦可自行將標記物標記於二級抗體上，其為本領域之通常知識且非本發明之技術特點，故在此不另加贅述。

4、影像處理與分析

利用USB照相顯微鏡取得結核菌抗原蛋白質晶片的數位影像後，再以Adobe Photoshop軟體將影像轉成16 bit灰階負片效果的圖像，最後以Genepix 6.0軟體分析每一點呈色強度。不同晶片上的每一點呈色強度必須經由內在控制組進行背景訊號標準化(Normalization)才能進行比較。標準化計算方式如下：標準化呈色強度=各蛋白質抗原平均呈色強度/內在控制組平均呈色強度。

5、結核菌抗原蛋白晶片的分析結果

每個晶片以Genepix 6.0軟體分析每一點呈色強度，再以內在控制組進行標準化後，便可進行不同晶片中25種結核菌抗原濃度的比較。

請參照第4(A)至4(B)圖，其為依據本發明一實施例所篩選之生物標誌。第4(A)圖為開放性結核菌感染病患(TB；25人)與健康人(H；34人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片比較分析結果，顯示抗原Rv3131(p =0.016)、Rv3875(p =0.025)、Rv1996(p =0.024)、Rv2627(p =0.012)、Rv2628(p =0.002)、Rv3126(p =0.030)、Rv2032(p =0.013)、Rv0079(p =0.048)具統計顯著差異。第4(B)圖為潛伏性結核菌感染病患(LTB；20人)與健康人(H；34人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片比較分析結果，顯示抗原Rv3875(p =0.027)、Rv2627(p =0.017)、Rv2628(p =0.002)、Rv2030(p =0.048)、Rv2032(p =0.0001)具統計顯著差異。

總觀上述檢測結果，雖然有許多在不同結核菌感染狀態具統計顯著差異的結核菌抗原，然而由於個體差異，結核菌抗原蛋白質晶片的訊號值會隨不同血液樣品而變動，因此單獨各別使用結核菌抗原的訊號值並不能達到有效區分結核菌感染狀態的結果。因此，後續繼續發展有效的多變量統計方法，以篩選出可正確判別不同結核菌感染狀態的抗原生物標誌。

實施例二：抗原生物標誌之分析試驗

本發明先以線性判別分析(linear discriminant analysis；LDA)、主成分分析(principal component analysis；PCA)、部分最小平方法(partial least square；PLS)、演化樹分析(decision tree)和類神經網路(neural network)等多變量統計方法，分析結核菌抗原蛋白質晶片所得到的檢測數據，從中篩選出可正確區別結核菌不同感染狀態的檢測生物標誌組。

分析結果顯示利用線性判別分析，可有效區別潛伏性結核菌感染病患、開放性結核菌感染病患以及健康人，因此，本發明利用線性判別分析以判別結核菌不同感染的狀態。線性判別分析是統計學上的一種分析方法，用於在已知的分類組別之下遇到有新的樣本時，選定一個判別標準，以判定將新樣本放置於哪一個分類組別之中。

此外，各組別分析靈敏度與特異性的公式為：靈敏度=開放性結核菌感染病患組(或潛伏性結核菌感染病患組)中分析為陽性者人數/開放性結核菌感染病患組(或潛伏性結核菌感染病患組)總人數。就特異性而言，目前缺乏檢測潛伏性結核菌感染病患的標準，因此在討論特異性時，常以幾乎沒有機會接觸到結核患者人群來做為標準。本發明係以健康人組進行特異性測試，其公式為：特異性=健康人組中檢測為陰性者人數/健康人組總人數。

依據本發明之一實施例，首先分析比較健康人(34人)、開放性結核菌感染病患(25人)與潛伏性結核菌感染病患(20人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片結果，以晶片上25種抗原的訊號強度作為自變數，進行線性判別分析，可得到以此25個自變數的線性組合作為判別標準，將0設為預設閾值，以>0或<0為標準決定測試樣本的屬性，用以區別這三組總共79個訓練(training)樣本，區分總正確率為92.4%(73/79)，開放性結核菌感染病患組的靈敏度為84%，潛伏性結核菌感染病患組的靈敏度為100%，特異性為94.1%。

接著，利用留一交叉驗證(leave-one-out cross validation)方法以估計線性判別分析預測的正確率，亦即每次從上述79個樣本中取出一個作為測試(testing)樣本，剩餘的78個樣本則作為訓練樣本以計算出線性判別分析線性組合的判別公式，再以此標準決定測試樣本的屬性。如此依序重覆進行，最後總共可得到79個測試樣本的預測準確度為84.8%(67/79)，雖然潛伏性結核菌感染病患組的靈敏度為100%，但開放性結核菌感染病患組的靈敏度僅為76%，特異性僅達82.4%。

根據上述以25種抗原蛋白質進行線性判別分析的結果，預測準確度僅為84.8%，因此繼續進行多次線性判別分析，以取得可有效區別不同結核菌感染的抗原生物標誌。

實施例三、判別開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染之分析試驗

以下描述經多次分析試驗後，本發明可利用其中9種抗原判別開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染之應用基礎與其應用方式。

(一).　以9種抗原蛋白質判別健康人與開放性結核菌感染病患：

依據本發明之一實施例，分析比較健康人(34人)與開放性結核菌感染病患(25人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片結果，以晶片上Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133和Rv3875之9種抗原的訊號強度作為自變數，進行線性判別分析，可得到以此9個自變數的線性組合為判別標準，其如式(I)所示，a 代表係數值，而X 代表自變數，其中係數值如表一所示。以計算結果f(x)作為感染分數，將0設為預設閾值，以感染分數大於0或小於0為標準決定測試樣本的屬性，感染分數大於0為健康者，其小於0為開放性結核菌感染病患。

表一、以9種抗原蛋白質判別健康人與開放性結核菌感染病患之線性判別分析係數值

利用留一交叉驗證方法估計線性判別分析預測的正確率，亦即每次從上述59個樣本中取出1個作為測試樣本，剩餘的58個樣本則作為訓練樣本以計算出線性判別分析線性組合的判別公式，再以此標準決定測試樣本的屬性。經多次測試分析，得到健康人的預測準確度為97%，開放性結核菌感染病患的預測準確度為96%。

(二).　以4種抗原蛋白質判別健康人與潛伏性結核菌感染病患：

依據本發明之一實施例，分析比較健康人(34人)與潛伏性結核菌感染病患(20人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片結果，以晶片上Rv3875、Rv2628、Rv2030和Rv2031之4種抗原的訊號強度作為自變數，進行線性判別分析，可得到以此4個自變數的線性組合為判別標準，其如式(II)所示，a 代表係數值，而X 代表自變數，其中係數值如表二所示。以計算結果f(x)作為感染分數，將0設為預設閾值，以感染分數大於0或小於0為標準決定測試樣本的屬性，感染分數大於0為健康者，其小於0為潛伏性結核菌感染病患。

表二、以4種抗原蛋白質判別健康人與潛伏性結核菌感染病患之線性判別分析係數值

利用留一交叉驗證方法估計線性判別分析預測的正確率，亦即每次從上述54個樣本中取出1個作為測試樣本，剩餘的53個樣本則作為訓練樣本以計算出線性判別分析線性組合的判別公式，再以此標準決定測試樣本的屬性。經多次測試分析，得到健康人的預測準確度為100%，潛伏性結核菌感染病患的預測準確度為100%。

(三).　以4種抗原蛋白質判別開放性結核菌感染病患與潛伏性結核菌感染病患：

依據本發明之一實施例，分析比較健康人(25人)與潛伏性結核菌感染病患(20人)血清的結核菌抗原蛋白質晶片結果，以晶片上Rv3875、Rv2628、Rv2030和Rv3129之4種抗原的訊號強度作為自變數，進行線性判別分析，可得到以此4個自變數的線性組合為判別標準，其如式(II)所示，a 代表係數值，而X 代表自變數，其中係數值如表三所示。以計算結果f(x)作為感染分數，將0設為預設閾值，以感染分數大於0或小於0為標準決定測試樣本的屬性，感染分數大於0為開放性結核菌感染病患，其小於0為潛伏性結核菌感染病患。

表三、以4種抗原蛋白質判別開放性結核菌感染病患與潛伏性結核菌感染病患之線性判別分析係數值

利用留一交叉驗證方法估計線性判別分析預測的正確率，亦即每次從上述45個樣本中取出1個作為測試樣本，剩餘的44個樣本則作為訓練樣本以計算出線性判別分析線性組合的判別公式，再以此標準決定測試樣本的屬性。經多次測試分析，得到開放性結核菌感染病患的預測準確度為100%，潛伏性結核菌感染病患的預測準確度為100%。

(四).　判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法：

根據本發明之上述(一)至(三)的試驗，可將其應用於判別開放性或潛伏性結核菌感染。

在一例示中，某一潛伏性結核菌感染病患之血清樣本的抗原Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133和Rv3875之9種抗原的訊號強度分別為0.05、0.05、0.48、0.19、0.08、0.05、0.12、0.24及0.19。以此9種訊號強度作為自變數，將自變數和表一的係數值帶入式(I)，得到感染分數為-25.54，其小於0，得到第一結果為開放性結核菌感染病患。

同時，以Rv3875、Rv2628、Rv2030和Rv2031之4種抗原的訊號強度作為自變數，將自變數和表二的係數值帶入式(II)，得到感染分數為-9.90，其小於0，得到第二結果為潛伏性結核菌感染病患。

並以Rv3875、Rv2628、Rv2030和Rv3129之4種抗原的訊號強度作為自變數，將自變數和表三的係數值帶入式(II)，得到感染分數為-4.97，其小於0，得到第三結果為潛伏性結核菌感染病患。

三個結果中，第二結果及第三結果相同，確認此人類個體為潛伏性結核菌感染。

由本發明上述實施方式可知，應用本發明的判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法，其優點在於僅需1 ml血液即可檢測，且不需細胞培養，僅需4個小時的單次檢測即可判別人類個體為開放性結合感染或潛伏性結核感染，可於未來應用臨床檢測。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

＜110＞周正中

＜120＞判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法

＜160＞9

＜210＞1

＜211＞435

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv2031之去氧核醣核酸序列

＜400＞1

＜210＞2

＜211＞432

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv2626之去氧核醣核酸序列

＜400＞2

＜210＞3

＜211＞654

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv3133之去氧核醣核酸序列

＜400＞3

＜210＞4

＜211＞363

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv2628之去氧核醣核酸序列

＜400＞4

＜210＞5

＜211＞999

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv3131之去氧核醣核酸序列

＜400＞5

＜210＞6

＜211＞954

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv1996之去氧核醣核酸序列

＜400＞6

＜210＞7

＜211＞2046

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv2030之去氧核醣核酸序列

＜400＞7

＜210＞8

＜211＞267

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv0569之去氧核醣核酸序列

＜400＞8

＜210＞9

＜211＞288

＜212＞DNA

＜213＞

＜220＞

＜223＞Rv3875之去氧核醣核酸序列

＜400＞9

100．．．方法

110．．．自一人類個體獲得一血液樣本

120．．．利用結核菌抗原蛋白質晶片偵測血液樣本中之多個結核菌抗體並獲得對應之訊號值

130．．．利用線性判別分析法分析所得之訊號值，以計算出一感染分數

140．．．根據此感染分數與一預設閾值進行比較，藉此確認此人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染

141．．．偵測Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875，以確認此人類個體為健康或開放性結核菌感染

142．．．偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv2031，以確認此人類個體為健康或潛伏性結核菌感染

143．．．偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv3129，以確認此人類個體為開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染

144．．．當上述結果之任二者相同時，確認此人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖為依照本發明一實施例之判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法100的步驟流程圖。

第2圖為依照本發明一實施例之步驟140的步驟流程圖。

第3(A)圖為依照本發明一實施例之結核菌抗原蛋白質晶片之配置示意圖。

第3(B)圖為依照本發明一實施例之結核菌抗原蛋白質晶片之呈色圖。

第4(A)圖為開放性結核菌感染病患與健康人血清的結核菌抗原蛋白質晶片比較分析結果。

第4(B)圖為潛伏性結核菌病患與健康人血清的結核菌抗原蛋白質晶片比較分析結果。

100．．．方法

110．．．自一人類個體獲得一血液樣本

Claims

一種判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法，包含：自複數個人類個體獲得複數個血液樣本，利用一結核菌抗原蛋白質晶片偵測該些血液樣本中之複數個結核菌抗體並獲得對應之複數個訊號值，將該些訊號值利用費雪線性判別分析(fisher linear discriminant analysis)計算出對應之複數個係數值；自一人類個體獲得一血液樣本；利用一結核菌抗原蛋白質晶片偵測該血液樣本中之複數個結核菌抗體之至少一者的存在並獲得對應之一訊號值，且每一該些結核菌抗體之該訊號值係分別對應於其中一該係數值，其中該結核菌抗原蛋白質晶片包含複數個結核菌抗原，且該些結核菌抗原包含Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875；將該訊號值利用費雪線性判別分析與計算出一感染分數；以及根據該感染分數與一預設閾值進行比較，其中該預設閾值為0：根據該血液樣本偵測Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875之該感染分數與該預設閾值進行比較，大於該預設閾值時該人類個體為健康，小於該預設閾值時該人類個體為開放性結核菌感染，以獲得一第一結果；根據該血液樣本偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv2031之該感染分數與該預設閾值進行比較，大於該預設閾值時該人類個體為健康，小於該預設閾值時該人類個體為潛伏性結核菌感染，以獲得一第二結果；根據該血液樣本偵測Rv3875、Rv2628、Rv2030及Rv3129之該感染分數與該預設閾值進行比較，大於該預設閾值時該人類個體為開放性結核菌感染，小於該預設閾值時該人類個體為潛伏性結核菌感染，以獲得一第三結果；當該第一結果、該第二結果及該第三結果之任二者相同時，確認該人類個體為健康、開放性結核菌感染或潛伏性結核菌感染。
如請求項1所述之判別開放性或潛伏性結核菌感染之方法，其中該血液樣本為血清樣本。
一種判別開放性或潛伏性結核菌感染之套組，包含一結核菌抗原蛋白質晶片，其中該結核菌抗原蛋白質晶片包含複數個結核菌抗原，且該些結核菌抗原包含Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2031、Rv2626、Rv2628、Rv3131、Rv3133及Rv3875。
如請求項3所述之判別開放性或潛伏性結核菌感染之套組，更包含二級抗體，以與人類免疫球蛋白G專一性結合。