CN102707052B

CN102707052B - 含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂

Info

Publication number: CN102707052B
Application number: CN201210147678.3A
Authority: CN
Inventors: 朱鸿飞; 贾红; 鑫婷; 侯绍华; 袁维峰; 郭晓宇
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: CN102707052A

Abstract

本发明属于免疫检测领域。本发明提供了牛分枝杆菌感染检测的试剂及方法。所述检测试剂包括作为特异性刺激原的重组蛋白混合物，该蛋白混合物能够刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ。本发明的检测试剂克服了现有技术的缺陷，具有较强的灵敏度和特异性，并且生物安全好、成本低廉、可标准化生产，因而能有效用于牛结核病的临床检测。

Description

含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的新型试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的一种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内约有5000万头牛感染了结核病，每年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织（WHO）指出：“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5.83%和5.43%。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10.18%以上，甚至更高。

牛结核菌素皮内变态反应试验（GB/T 18646）为世界动物卫生组织（OIE）规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使PPD检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且PPD生产工艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间PPD质量的稳定。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测（如ELISA）从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PPD作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。

为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性靶（The early secreted antigenic target6ku protein ESAT-6）、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白65（Heat shock protein 65，HSP-65）、抗原85B（antigen 85B,Ag-85B）、10kDa的培养滤液抗原（10kDa culture filtrateantigen,CFP-10）等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合（又称“鸡尾酒法”）作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测，通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。

因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。

本发明人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了PPD的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PPD进行皮内变态反应实验和IFN-γ释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的新型试剂及方法。

本发明的发明原理为：由于在皮内变态反应和γ-IFN释放试验中使用传统的PPD作为刺激原时，存在着成分复杂，特异性差的缺点，而现有用来替代PPD作为刺激原的重组牛结核杆菌蛋白的敏感性不理想。本发明选择重组表达了牛分枝杆菌的三种特异性蛋白质CFP-10、ESAT-6和TB10.4，CFP-10和ESAT-6属于同一个基因家族，具有相同的操纵子，两基因方向一致，共用一个启动子，协同表达，CFP-10的C端与ESAT-6相连，形成紧密的异二聚体结构，这种结构与细菌致病性和毒力有关，TB10.4蛋白是ESAT-6家族蛋白之一，其基因仅存在于结核杆菌复合体中，能诱导机体产生较强的Th1型免疫应应，该蛋白可以被结核患者和BCG免疫个体强烈识别(70％)，并且识别的个体会产生高水平的IFN-γ，因此该蛋白作为检测抗原使用会大大提高检测的敏感性。本发明尝试用这些重组蛋白或其混合物替代PPD作为刺激原，检测牛分枝杆菌感染。

本发明提供了一种用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，该试剂包括两种或三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，该重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN-γ。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂包括选自CFP-10、ESAT-6和TB10.4中的两种或三种牛分枝杆菌蛋白的混合物。

在本发明的优选实施方案中，所述试剂包括重组表达的牛分枝杆菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4的混合物。

三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4的混合比例为1~2∶1~2∶1~2，包括但不限于1∶1∶1、2∶2∶1和1∶1∶2，其中优选为1∶1∶1。

在本发明的一个具体实施方案中，所述三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4的编码基因分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

本发明对所述三种重组蛋白及其混合物进行了皮内变态反应和IFN-γ释放试验，实验结果证明：（1）本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于PPD作为刺激原的皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验；（2）本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于单一重组蛋白；（3）重组蛋白混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于相同蛋白的串联共表达产物。

在各种不同成分不同比例的重组蛋白混合物中，由CFP-10、ESAT-6和TB10.4三种成分等比例混合的混合物作为刺激原进行IFN-γ释放试验时，能特异性的检测牛分枝杆菌感染牛，且敏感度最高，最小刺激量可达10μg/ml。

另一方面，本发明提供了用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

另一方面，本发明提供了所述引物在在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。

另一方面，本发明提供了一种制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，该方法包括：（a）PCR扩增获得CFP-10、ESAT-6和TB10.4的编码基因；（b）重组表达步骤（a）获得的编码基因得到3种重组蛋白；（c）将步骤（b）获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。

在一个实施方案中，PCR扩增所用3对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

在一个实施方案中，PCR扩增的CFP-10、ESAT-6和TB10.4编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

在一个实施方案中，其中步骤（b）中的重组表达的具体操作为：将含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的重组质粒PET分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ 200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD600nm=0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL PBS（pH7.4）洗涤两次，10ml PBS（pH7.4）重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清。蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱按操作手册在蛋白纯化仪进行纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS（pH7.4）缓冲溶液中。

在一个实施方案中，其中步骤（c）中的混合比例混合比例为1~2∶1~2∶1~2，包括但不限于1∶1∶1、2∶2∶1和1∶1∶2，其中优选为1∶1∶1。

另一方面，本发明提供了一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括下述步骤：

a)在牛的颈部上1/3处剃毛，并用游标卡尺测量该部位的皮肤厚度；b)在剃毛部位用1ml注射器皮内注射0.1ml终浓度为0.5mg/ml的本发明所述的重组蛋白混合物；c)注射72h后，游标卡尺测量注射部位的皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。

该方法的判断标准为：当皮厚差小于2mm时判定为阴性，皮厚差≥2mm时判定为牛分枝杆菌感染阳性。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括：a)采集10ml肝素锂抗凝血，以0.75ml/孔的剂量将其分装于48孔细胞培养板，一孔加入终浓度为1μg的本发明所述的重组蛋白混合物，另一孔加入等摩尔量的PET（pET32a(+)空载体的标签蛋白）蛋白。b)37℃培养24h，收集上层血浆作为待检样品。c)用ELISA方法检测血浆样品中牛IFN-γ的释放水平。其中步骤c)中所述的用ELISA检测待检血浆样品中牛IFN-γ释放水平的具体操作为：①用ELISA包被缓冲液将IFN-γ单抗稀释至蛋白质含量为20μg/ml，每孔酶标板加入100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（PBST）洗板3次，每次3min，②每孔酶标板先加入50μl样品稀释液，再加入50μl待检样品（同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔）至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37℃孵育1h，③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min，④各反应孔中加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37℃孵育1h，⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min，⑥各反应孔中加入100μl新鲜配制的底物溶液，37℃，避光孵育30min（从加入底物至第一个孔中时开始计时），⑦各反应孔中加入50μl终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD_450nm值，以620-650nm作为参照波长。

该方法的判断标准为：当待检血浆样品OD_450nm值-PET对照的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

附图说明：

图1.牛分枝杆菌特异性蛋白PCR扩增产物电泳结果。泳道M：DL2000plus分子量Markwer；泳道1：CFP-10基因产物；泳道2：ESAT-6PCR扩增产物；泳道3：TB10.4PCR扩增产物。

图2.重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。泳道1：pET-32a(+)空载体标签蛋白（PET）纯化产物对照；泳道2：CFP-10重组蛋白纯化产物；泳道3：ESA-6重组蛋白纯化产物；泳道4：TB10.4重组蛋白纯化产物。

图3.重组蛋白的B细胞活性检测结果，每个圆点表示同一份样本的两个重复检测结果的平均值。

图4.CFP-10和ESAT-6分别作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差。

图5.CFP-10与ESAT-6等比例混合或串联作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，AB代表CFP-10与ESAT-6等比例混合，CD代表CFP-10与ESAT-6串联表达的融合蛋白CFP10/ESAT-6。

图6.重组蛋白TB10.4作为CFP-10和ESAT-6的补充抗原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，AB代表CFP-10与ESAT-6等比例混合，ABT代表CFP-10、ESAT-6及TB10.4三者等比例混合。

图7.三种重组蛋白以不同混合方式作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABT代表CFP-10、ESAT-6和TB10.4等比例混合，CDT代表串联表达CFP-10/ESAT-6与TB10.4以2:1的比例混合。

图8.重组蛋白ABT混合物的剂量筛选结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差。

图9.重组蛋白的混合比例筛选。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABT1代表重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以1∶1∶1混合，ABT2代表重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以1∶1∶2混合。

图10.载体标签蛋白PET作为皮内变态反应试验刺激原检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，PET代表载体标签蛋白。

图11.重组蛋白ABT混合物作为皮内变态反应试验刺激原检测牛结核阴性牛结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABT代表CFP-10、ESAT-6和TB10.4等比例混合作为刺激原，蛋白终浓度为0.5mg/ml。

图12.重组蛋白ABT混合物作为皮内变态反应试验刺激原临床检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，左图代表检测的72头结核病阳性牛数据，右侧图为131头结核病阴性牛数据。

本发明的优点

本发明的检测牛分枝杆菌感染的新型检测试剂具有特异性高、生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉、可标准化生产等优点，本发明的含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂及检测方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以PPD为刺激原的皮内变态反应试验及IFN-γ释放试验的不足，具有较强的的特异性和敏感性，因此可用于牛结核病的临床检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1重组质粒PET-ESAT-6、PET-CFP-10和PET-TB10.4的构建

1.1牛分枝杆菌基因组DNA的提取

用M.bovis ValleeⅢ菌株（中国兽医药品监察所提供）培养物，参照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒（购自北京博大泰克基因技术有限责任公司）产品说明书所述方法进行。

1.2引物的设计

根据GenBank中M.bovis AF2122/97基因组DNA（登录号为BX248333）的CFP-10、ESAT-6和TB10.4基因序列设计特异性引物，上游引物携带Bam H I酶切位点，下游引物携带Hind Ⅲ酶切位点，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物的核苷酸序列见表1（下划线处为保护性碱基及酶切位点）。

表1PCR引物名称、序列及扩增产物的大小

1.3重组质粒的构建及鉴定

以1.1中提取的牛分枝杆菌基因组DNA为模板，用表1中的引物对分别扩增CFP-10、ESAT-6和TB10.4基因，具体反应体系如下：

上述三个基因的扩增反应条件相同，均为：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃再延伸10min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图1，其中牛分枝杆菌CFP-10、ESAT-6和TB10.4基因产物分别约为303bp、288bp和291bp，与预期大小一致。

用琼脂糖胶回收试剂盒（购自OMEGA,USA）分别回收纯化上述PCR产物，然后将CFP-10、ESAT-6和TB10.4分别用Bam H I和Hind Ⅲ双酶切后，定向克隆到pET32a(+)载体中，获得的重组质粒经双酶切和测序鉴定正确后，分别命名为PET-CFP-10、PET-ESAT-6和PET-TB10.4。

实施例2重组蛋白CFP-10、ESAT-6及TB10.4的表达及纯化

2.1重组蛋白的诱导表达、纯化

将实施例1制备的重组质粒PET-CFP-10、PET-ESAT-6和PET-TB10.4分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ 200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm=0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL PBS（pH7.4）洗涤两次，10ml PBS（pH7.4）重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清。蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱（His Trap FFCrude colunm，购自GE公司）按操作手册在蛋白纯化仪（AKTA purifier，购自GE公司）上进行纯化，并用脱盐层析柱（HiTrap 26/10Desalting column，购自GE公司）进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS（pH7.4）缓冲溶液中，纯化产物经12%SDS-PAGE电泳进行检测，如图2.。SDS-PAGE电泳结果(见图2)显示三个重组蛋白的分子量均约为30Ku，与预期大小一致。

2.2重组蛋白的内毒素去除及定量

由于2.1中制备的重组蛋白由大肠杆菌表达，为防止可能含有的内毒素注入机体后会引起发热等副反应，需去除重组蛋白中内毒素。具体操作为：向重组蛋白溶液中加入1%的TritonX-114，4℃间断混匀30min，37℃水浴10min，室温20000g离心10min，取上清，如此重复2次，可去除重组蛋白中绝大部分的内毒素。收获的蛋白溶液经滤器无菌过滤，用蛋白定量试剂盒（BCA法）（购自SINOPCR公司）定量后，无菌分装并冻存于-80℃。

实施例3重组蛋白CFP-10、ESAT-6及TB10.4的活性检测

3.1重组蛋白的细胞免疫活性鉴定

①用传统的牛PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验筛选牛结核阳性牛和健康牛各5头，无菌条件下每头牛各采集肝素抗凝血10ml，8h内室温（22±5℃）运送到实验室。②将抗凝血加入到48孔组织培养板，0.75ml/孔，分别无菌加入牛PPD、禽PPD、PBS（pH7.4）、空载体标签蛋白PET、重组蛋白CFP10、ESAT-6、TB10.4（PET与重组蛋白等摩尔量加入，CFP-10、ESAT-6和TB10.4的终浓度均为10ug/ml）50μl/孔，震荡混匀后37℃CO₂培养箱中孵育24h。③小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用（血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月）。按照牛IFN-γ检测试剂盒（购自北京测迪公司）说明书进行操作，记录各个样品的OD_450nm读值，结果见表2。

表2.重组蛋白的细胞免疫活性检测结果

判定标准：当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，如重组蛋白刺激后的血浆样品OD_450nm值-阴性对照刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

表2结果显示，载体的标签蛋白PET刺激牛结核阳性牛或健康牛的全血后，IFN-γ的释放量均没有增加，这表明与牛分枝杆菌特异性蛋白（CFP10、ESAT-6、TB10.4）融合表达的载体标签蛋白PET对牛的外周血淋巴细胞没有刺激作用，不产生非特异性反应，从而排除了标签蛋白对试验结果的影响。重组蛋白CFP10、ESAT-6、TB10.4刺激健康牛的全血时，IFN-γ的释放量没有增加，而刺激牛分枝杆菌感染牛的外周淋巴细胞时，IFN-γ的释放量显著增加，这表明三种牛分枝杆菌特异性重组蛋白均具有良好的细胞免疫活性，可以特异性的检测牛分枝杆菌感染，但不同牛分枝杆菌感染动物个体对各个蛋白的反应性并不相同，例如1号牛对CFP-10和ESAT-6的反应性好，而2号牛对CFP-10和TB10.4的反应活性好，然而CFP-10、ESAT-6、TB10.4三者可以互为补充，从而提高检测的敏感度。

3.2重组蛋白的体液免疫活性鉴定

将重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和PET分别以1ug/ml的浓度包被ELISA反应板，检测240份健康牛的血清，获得各个蛋白的cutoff值（阴性样本的平均值加上2倍的标准误），PET、CFP-10、ESAT-6和TB10.4的cutoff值分别为0.096、0.139、0.145、和0.15；再用相同操作方法检测289份经PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验鉴定为牛结核病阳性牛的血清样品，检测结果见图3。

结果表明：载体标签蛋白PET与牛结核病牛阳性血清及阴性血清均未发生反应，而三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4均与牛结核病牛阳性血清发生特异性反应，具有良好的B细胞免疫活性，并且均不与健康牛的血清发生反应，表明重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4均具有良好的特异性。但是这三种重组蛋白对各个牛分枝杆菌感染牛的反应性不同，其中的单个蛋白均不能检测出所有阳性样本，与3.1的结论相吻合。

虽然本发明实验证实三种重组蛋白均具有良好的细胞免疫和体液免疫活性，但是由于单一重组蛋白不能够检测出所有阳性样本，因此本发明人考虑将所述重组蛋白联合应用。

下面本发明人将通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验，比较三种重组蛋白不同混合配比方式的实验效果。

实施例4最佳反应条件的建立

4.1皮内变态反应筛选重组蛋白最佳工作方式

用皮内变态反应筛选牛结核病阳性牛，2个月后按照以下分组进行皮内变态反应试验，用于筛选合适的刺激原。以下实验中A为重组蛋白CFP-10，B为重组蛋白ESAT-6，T为重组蛋白TB10.4，PET为载体标签蛋白，CD为本发明人用原核表达系统表达和纯化的CFP-10/ESAT6重组串联蛋白，注射用重组蛋白的总浓度均为0.5mg/ml，注射剂量为0.1ml，ABT的组合比例为1∶1∶1。

4.1.1单个重组蛋白皮内变态反应实验

从上述结核阳性牛中随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射CFP-10和ESAT-6，另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图4.。

结果表明，CFP-10在作为皮内变态反应试验刺激原时，比ESAT-6引起的迟发型过敏反应（DTH）强，但这两个重组蛋白分别单独作用时的效果均显著小于PPD引起的反应。

4.1.2重组蛋白混合物与重组共表达产物间的比较

从上述结核阳性牛中随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射CFP-10与ESAT-6混合液（比例为1∶1）和串联表达的CFP-10/ESAT-6重组蛋白，另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图5.，结果表明CFP-10与ESAT-6等比例混合的作用效果要优于二者串联表达产物，但均略差于PPD的刺激效果。

4.1.3重组蛋白混合成分之间比较

从上述结核阳性牛中随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射CFP-10与ESAT-6混合液（比例为1:1）和三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6及TB10.4的混合物（比例为1∶1∶1），另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图6.。

结果表明CFP-10、ESAT-6与TB10.4三种重组蛋白的混合效果要好于两种重组蛋白（CFP-10与ESAT-6）混合的作用效果。

4.1.4重组蛋白混合方式的比较

从上述结核阳性牛中随机选择5头牛，在颈部上1/3处进行剃毛，在颈部一侧分别注射ABT混合液（CFP-10、ESAT-6与TB10.4等比例混合）和CDT混合液（串联表达的CFP-10/ESAT-6与TB10.4以2∶1比例混合），另一侧注射牛PPD，分别在注射前、注射后72h测量皮肤厚度，计算皮厚差。实验结果见图7。

结果表明，三种重组蛋白不同比例混合都有很好的作用效果，其中等比例混合的作用效果更佳。

4.1.5重组蛋白作用剂量筛选

随机筛选结核阳性牛10头，其中在5头牛颈部一侧注射不同蛋白总浓度的ABT混合液，一点的注射浓度为0.5mg/ml，另一点为0.2mg/ml的ABT混合液，另一侧注射牛PPD；另外5头牛一侧注射蛋白总浓度分别为0.3mg/ml或0.1mg/ml的ABT混合液，另一侧注射牛PPD，检测结果见图8.，结果表明重组蛋白ABT混合物的终浓度为0.5mg/ml时，产生的刺激效果最好。

4.1.6重组蛋白混合比例的筛选

将CFP10、ESAT-6及TB10.4三种重组蛋白以不同比例混合，ABT1代表重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以1∶1∶1混合，ABT2代表重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以1∶1∶2混合。随机选择结核阳性牛5头，一侧分别注射以ABT1混合液和ABT2混合液，另一侧注射牛PPD，结果见图9。

结果表明，三种重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以1∶1∶1混合（ABT1）和以1∶1∶2（ABT2）比例混合都有很好的刺激效果，1∶1∶1比例的组合方式效果更好。

4.2IFN-γ释放试验筛选重组蛋白最佳工作方式

4.2.1重组蛋白为刺激原的IFN-γ释放试验时蛋白比例筛选

从以上牛结核病阳性牛中筛选3头牛采集肝素锂抗凝血10ml，8h内室温（22±5℃）运送到实验室，将抗凝血加入到48孔组织培养板，0.75ml/孔，空载体标签蛋白PET、重组蛋白CFP10、ESAT-6、TB10.4的混合液ABT（重组蛋白ABT混合液和PET以等摩尔量加入，并且重组蛋白ABT之间的比例梯度设为：1∶1∶1，2∶2∶1和1∶1∶2）各50μl，震荡混匀后37℃ CO₂培养箱中孵育24h。③小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用（血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月），按照Bovigam IFN-γ检测试剂盒（购自北京测迪公司）说明书进行操作，记录各个样品的OD_450nm读值，结果详见表3。

表3.重组蛋白ABT比例优化实验结果

判断标准为：检查阳性对照和阴性对照的OD_450nm值，当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，不同混合比例的重组蛋白ABT作为刺激原时，判断标准为重组蛋白ABT刺激后的血浆样品OD_450nm值-等摩尔量的PET刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。表3中的结果表明三种重组蛋白CFP10、ESAT-6、TB10.4以1∶1∶1混合时，刺激效果最佳。

4.2.2重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激源的剂量筛选

用牛PPD皮内变态反应试验筛选3头牛结核病阳性牛和3头健康牛，分别采集肝素锂抗凝血10ml，8h内室温（22±5℃）运送到实验室，将抗凝血加入到48孔组织培养板，0.75ml/孔，各孔分别无菌加入空载体标签蛋白PET、重组蛋白ESAT-6、CFP-10、TB10.4的混合液ABT（重组蛋白ABT混合液和PET以等摩尔量加入，并且重组蛋白的浓度梯度设为：100、50、20、10、5和2μg/ml）各50μl，震荡混匀后37℃ CO₂培养箱中孵育24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用（血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月），按照牛IFN-γ检测试剂盒（购自北京测迪公司）说明书进行操作，记录各个样品的OD_450nm读值。

判定结果前检查阳性对照和阴性对照的OD值，当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，不同浓度的重组蛋白作为刺激原时，判断标准为重组蛋白ABT刺激后的血浆样品OD_450nm值-等摩尔量的PET刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。结果如表4。

表4.不同浓度重组蛋白ABT作为刺激原的IFN-γ释放试验的检测结果

实验结果表明：重组蛋白混合物ABT作为刺激原进行IFN-γ释放试验时，可以检测牛分枝杆菌感染牛，且非常敏感，最小刺激量可达10μg/ml。

实施例5特异性和敏感性实验

5.1皮内变态反应特异性实验

随机选取5头牛，在颈部上1/3处选取两点（间隔20cm以上），分别注射牛PPD和50ug的载体标签蛋白PET，于注射前和注射72h后测量皮肤厚度，结果见图10，结果显示标签蛋白对各种牛均不产生反应，表明该标签蛋白并不引起非特异性反应。

选取PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验筛选的131头阴性健康牛，在第一次皮内变态反应试验结束2个月后，于颈部上1/3处选取两点（间隔20cm以上），分别注射牛PPD和终浓度为0.5mg/ml的本发明所述重组蛋白混合溶液各0.1ml，分别于注射前和注射72h后测量皮肤厚度，结果见图11，结果表明本发明所述重组蛋白混合液在健康牛并不引起非特异性反应。

5.2IFN-γ释放实验的特异性和敏感性

为了验证本发明所述重组蛋白作为IFN-γ释放实验检测刺激原的特异性和敏感性，从连续五年牛结核病检测阴性牛场筛选12头1~2月龄的犊牛，在实验前分别用牛PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放实验进行检测，检测结果显示筛选的12头牛均为阴性健康牛。

将这12头牛随机分为四组，四组实验动物分别颈静脉注射人工感染M.bovis 6800110⁴CFU（我国分离自结核病牛的强毒株，用于制造和检验牛型结核菌素）、M.bovis BCG10⁴CFU（弱毒株，对牛、小动物和人均没有致病性，用于制造弱毒疫苗）、M.avium P18 10⁴CFU（分离自结核病鸡的强毒株，用于制造和检验禽型结核菌素）、和等体积的PBS（pH7.4）；以上菌株均由中国兽医药品监察所提供。

在感染后1个月时采集肝素锂抗凝血10ml，8h内室温（22±5℃）运送到实验室，首先将抗凝血加入到48孔组织培养板，0.75ml/孔，各孔分别无菌加入牛PPD、禽PPD、PBS（pH7.4）、空载体标签蛋白PET、重组蛋白ESAT-6、CFP-10、TB10.4的混合液ABT（重组蛋白ABT混合液和PET以等摩尔量加入，重组蛋白的浓度设为20μg/ml）各50μl，震荡混匀后37℃ CO₂培养箱中孵育24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用（血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月），按照牛IFN-γ检测试剂盒（购自北京测迪公司）说明书进行操作，记录各个样品的OD_450nm读值，结果见表5。

判定标准：当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，如牛PPD刺激后的血浆样品OD_450nm值-PBS对照刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，同时，牛PPD刺激后的血浆样品OD_450nm值-禽对照刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性；重组蛋白作为刺激原时，判断标准为重组蛋白ABT刺激后的血浆样品OD_450nm值-等摩尔量的PET刺激原刺激后的血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

表5.不同刺激源的IFN-γ释放试验的检测结果

实验结果表明：PPD作为刺激原时无法区分BCG和牛分枝杆菌感染，但是重组蛋白混合物ABT作为刺激原进行IFN-γ释放试验时，可以特异性的检测牛分枝杆菌感染牛，并能够鉴别牛分枝杆菌感染和BCG以及禽分枝杆菌感染。

实施例6使用本发明的检测试剂进行临床检测

6.1重组蛋白作为皮内变态反应试验刺激原进行临床试验

用牛PPD和ABT重组蛋白混合液在临床进行皮内变态反应试验，于牛颈部上1/3处剃毛，两点之间间隔20cm以上，分别注射0.1ml的牛PPD和ABT（重组蛋白的浓度为0.5mg/ml，CFP-10、ESAT-6和TB10.4之间比例为1∶1∶1），在注射前和注射后72h用游标卡尺测量皮肤厚度，计算注射前后的皮厚差。皮内变态反应判定标准：牛PPD作为刺激原时，皮厚差＜2mm时为阴性，2mm≤皮厚差＜4mm时为可疑，皮厚差≥4mm时判定为阳性，疑似动物需要复检；重组蛋白ABT作为刺激原时，皮厚差≥2mm时判定为阳性。

为了统计数据的方便，将PPD皮内变态反应试验中皮厚差≥2mm的个体均按阳性动物计算，与IFN-γ释放试验和ABT重组蛋白皮内变态反应试验比较检测的特异性和敏感性，结果见表6。

表6.

ABT为刺激原的皮内变态反应试验相对于皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验的灵敏度=A/(A+C)×100%=83.3%%

ABT为刺激原的皮内变态反应试验相对于皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验的特异性=D/(B+D)×100%=99.2%

ABT为刺激原的皮内变态反应试验与皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验检测符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%=93.1%

阳性牛：经IFN-γ释放试验、牛PPD皮内变态反应试验检测判定为双阳性的牛共72头，这72头的牛PPD皮内变态反应试验和重组蛋白ABT为刺激原的皮内变态反应试验检测结果如图12（阳性牛）；

阴性牛：经IFN-γ释放试验、牛PPD皮内变态反应试验检测判定为双阴性的牛共131头，这131头牛PPD皮内变态反应试验和重组蛋白ABT为刺激原的皮内变态反应试验检测结果如图12（阴性牛）。

实验结果表明：ABT重组蛋白混合物作为刺激原进行皮内变态反应试验时，与传统的牛PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验的检测符合率可达93.1%，检测的灵敏度可以达到83.3%，特异性达到99.2%。这些试验数据表明CFP-10、ESAT-6和TB10.4重组蛋白混合物作为皮内变态反应试验的刺激原具有较高的灵敏度和特异性，可以作于牛结核病临床检测。

6.2ABT为刺激原的IFN-γ释放试验的临床试验

分别用PPD皮内变态反应试验、以PPD为刺激原的的IFN-γ释放试验和本发明建立的以重组蛋白ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对324头牛结核疑似牛同时进行检测，皮内变态反应判定标准：牛PPD作为刺激原时，皮厚差＜2mm时为阴性，皮厚差≥2mm时判定为阳性，疑似动物需要复检；重组蛋白ABT作为刺激原时，皮厚差≥2mm时判定为阳性。本发明建立的ABT作为刺激原的IFN-γ释放试验与PPD为刺激原的IFN-γ释放试验和PPD皮内变态反应试验比较检测的特异性和敏感性，结果见表7及表8。

表7.ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对于PPD皮内变态反应试验的敏感性和特异性分析

ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对于PPD皮内变态反应试验的检测灵敏度=A/(A+C)×100%=99.3%

ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对于PPD皮内变态反应试验的检测特异性=D/(B+D)×100%=72.8%

ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对于PPD皮内变态反应试验的检测符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%=85.19%

表8.ABT为刺激原的IFN-γ释放试验对于以PPD作为刺激原的IFN-γ释放试验的敏感性和特异性分析

ABT作为刺激原的IFN-γ释放试验的检测灵敏度=A/(A+C)*100%=100%%

ABT作为刺激原的IFN-γ释放试验的检测特异性=D/(B+D)*100%=57.8%

ABT作为刺激原的IFN-γ释放试验与PPD皮内变态反应试验的检测符合率=(A+D)/(A+B+C+D)*100%=77.47%

实验数据表明，本发明的检测特异性非常高，与传统的PPD皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验相比均可达到99%以上，敏感性能够达到72%以上，符合率可到77%以上。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 303

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(303)

<400> 1

atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60

atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120

ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180

gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240

gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300

tga 303

<210> 2

<211> 288

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(288)

<400> 2

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288

<210> 3

<211> 291

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(291)

<400> 3

atgtcgcaaa tcatgtacaa ctaccccgcg atgttgggtc acgccgggga tatggccgga 60

tatgccggca cgctgcagag cttgggtgcc gagatcgccg tggagcaggc cgcgttgcag 120

agtgcgtggc agggcgatac cgggatcacg tatcaggcgt ggcaggcaca gtggaaccag 180

gccatggaag atttggtgcg ggcctatcat gcgatgtcca gcacccatga agccaacacc 240

atggcgatga tggcccgcga cacggccgaa gccgccaaat ggggcggcta g 291

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 4

cgcggatcca tggcagagat gaagaccgat 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(31)

<400> 5

cccaagcttt cagaagccca tttgcgagga c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 6

cgcggatcca tgacagagca gcagtggaat 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(29)

<400> 7

cccaagcttt gcgaacatcc cagtgacgt 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(30)

<400> 8

cgcggatcca tgtcgcaaat catgtacaac 30

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(26)

<400> 9

cccaagcttc tagccgcccc atttgg 26

Claims

1.一种用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，该试剂包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，其中所述的三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白为CFP-10、ESAT-6和TB10.4，混合比例为1～2：1～2：1～2，所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，该试剂去除了内毒素。

2.权利要求1所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合比例为1：1：1或2：2：1或1：1：2。

3.一种制备权利要求1所述牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，该方法包括：

(a)PCR扩增获得3种编码基因；

(b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋白；

(c)将步骤(b)获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂；

其中步骤(a)使用3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其中步骤(a)中的3种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

4.权利要求3所述的制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，其中步骤(b)中的重组表达的具体操作为：将含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的重组质粒PET分别转化至E.coli BL21感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h，6000r/min离心10min收集菌体，用40mL pH7.4的PBS洗涤两次，10ml pH7.4的PBS重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清，蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到pH7.4的PBS缓冲溶液中。