CN1888076A - 牛结核杆菌菌体快速鉴定方法及药敏试验试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种牛结核杆菌菌体快速鉴定方法及药敏试验试剂盒，试剂盒包括样品处理液、增菌液、分枝杆菌噬菌体、中止液和菌落培养皿。牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法包括用样品处理液处理待检样品、用增菌液增菌、使分枝杆菌菌体感染噬菌体、用中止液灭活噬菌体以中止感染、将待测液滴于菌落培养皿上温育及根据菌落培养皿上噬菌斑的形成情况判定结果等步骤。本发明的试剂盒和鉴定方法特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰，可用于各种待检样品中活的牛结核杆菌菌体快速鉴定及其对药物的敏感性试验。非常适合饲养奶牛畜牧场、生产牛奶的企业以及各级兽医基层单位应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种牛结核杆菌菌体快速鉴定方法及药敏试验试剂盒。
背景技术
牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛结核杆菌是牛结核病的致病菌。牛结核杆菌的细菌学检查是确诊牛结核病的重要依据。
目前，牛结核杆菌的传统检查方法是采用抗酸杆菌涂片和牛结核杆菌培养。抗酸杆菌涂片检查敏感性低、特异性差，无法确定细菌死活。牛结核杆菌的培养通常是将待检标本接种至改良罗氏培养基，37℃培养20-60天，待细菌生长后再依据生物学特征及生化反应多项指标综合判断。这种牛结核杆菌的培养方法耗费时间长，而且操作烦琐，无法满足快速确诊牛结核病的需要。
发明内容
本发明的目的，在于解决上述现有技术存在的问题，提供一种牛结核杆菌菌体快速鉴定方法及药敏试验试剂盒，以满足快速确诊牛结核病的需要。
本发明的目的是这样实现的：牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂盒，包括样品处理液、增菌液、分枝杆菌噬菌体、中止液和菌落培养皿。
所述的样品处理液为2-4％的氢氧化钠溶液；所述的增菌液由米氏7H9培养基5-7重量份、氯化钙1-2重量份、氨苄青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和过氧化氢酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的纯水中制备而成；所述的中止液为5-8％的硫酸亚铁氨溶液；所述的菌落培养皿由1.5-3％的熔化琼脂6-8体积份、增菌液6-8体积份和指示菌1-2体积份混匀凝聚于无菌平皿中形成。
所述的指示菌为耻垢分枝杆菌或草分枝杆菌。
牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法，采用牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂，按以下步骤进行：
a、取10-50毫升待检样品置于样品管中，加入等量的样品处理液，室温作用20-30分钟，然后离心分离；
b、弃去样品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下温育24小时；
c、向样品管中加入0.1-0.2毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
d、向样品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室温作用10分钟；
e、取步骤d所得液体10-20微升，滴于菌落培养皿上，在35-38℃下培养15-20小时，观察结果，如在滴样区域出现全透亮或半透亮圈，表明待检样品中存在活的牛结核杆菌菌体，反之则不存在。
上述步骤a中所述的待检样品包括牛的鼻汁、乳汁、粪便、痰液、穿刺液。
本发明的方法原理是通过制备感受态细菌的方式，将待检菌株置于易感状态，并被分枝杆菌噬菌体感染，噬菌体在感染菌中增殖，并将感染菌裂解，释放出的噬菌体立即感染菌落培养皿中的指示菌并使其裂解，在菌落培养皿上出现肉眼可见的透亮圈。如待检样品中不含活的牛结核杆菌，则噬菌体未能进入感染细胞而被随后加入的中止液所灭活，因此不会造成指示菌被噬菌体感染，菌落培养皿不会出现透明圈。由于处于感受态的牛结核杆菌极易被相应的噬菌体感染，而且噬菌体在感染菌体内繁殖迅速，加上菌落培养皿中的指示菌生长快速，所以，本发明的试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰，可用于各种待检样品中活的牛结核杆菌菌体快速鉴定及其对药物的敏感性试验。非常适合饲养奶牛畜牧场、生产牛奶的企业以及各级兽医基层单位应用。又因噬菌体只能感染活加药管菌，而且感染结果是将菌体裂解，因此，本发明的试剂和方法既可检测待检标本中是否存在活的牛结核杆菌菌体，又可保护实验人员免受感染。
具体实施方式
实施例1
一、试剂配制：
样品处理液：取3克固体氢氧化钠溶于纯水并稀释至100毫升，配制成氢氧化钠溶液；
增菌液：取米氏7H9培养基6克、氯化钙2克、氨苄青霉素28克、二性霉素B30克、牛血清白蛋白150克、葡萄糖12克、油酸2克和过氧化氢酶0.1克溶于1000毫升纯水中，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
中止液：取固体硫酸亚铁氨7克，溶于纯水并稀释至100毫升，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
菌落培养皿：取浓度为2％的熔化琼脂7毫升，加入到市售的一次性无菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液7毫升和1毫升快速生长的耻垢分枝杆菌，混匀，凝聚成型。
二、牛结核杆菌菌体的快速鉴定
a、取50毫升牛的穿刺液置于样品管中，加入等量的氢氧化钠溶液，室温作用25分钟，然后在每分钟8000转下离心8分钟；
b、弃去样品管中的上清液，于沉淀中加入1毫升增菌液，37℃下温育24小时；
c、向样品管中加入0.1毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
d、向样品管中加入中止液0.1毫升，室温下作用10分钟；
e、取步骤d所得液体10微升，滴于菌落培养皿上，在37℃下培养18小时，观察结果，如在滴样区域出现全透亮或半透亮圈，表明待检样品中存在活的牛结核杆菌菌体，反之则不存在。
三、牛结核杆菌菌体的药敏试验
a、将待检菌株以标准比浊法制备成浓度为1毫克/毫升的悬液；
b、取步骤a所得悬液1毫升稀释至1000毫升，制备成浓度为1微克/毫升的悬液；
c、取两试验管1和2作为加药管，各加入1毫克/毫升悬液0.5毫升；
d、取两试验管3和4作为对照管，各加入1微克/毫升悬液0.5毫升；
e、在试验管1和3中各加入0.1毫升试验药物，在试验管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下温育30小时；
f、向各加药管和对照管中各加入0.1毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
g、向各加药管和对照管中各加入0.1毫升中止液，室温作用5分钟；
h、取步骤g中所得各加药管和对照管中的溶液各15微升，分别滴于菌落培养皿上，在37℃下温育18小时，观察结果。如对照管样品在滴样区域出现全透亮或半透亮圈、加药管无透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为耐药株；如对照管和加药管样品在滴样区域均出现全透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为敏感株。
实施例2
一、试剂配制：
样品处理液：取2克固体氢氧化钠溶于纯水并稀释至100毫升，配制成氢氧化钠溶液；
增菌液：取米氏7H9培养基5克、氯化钙2克、氨苄青霉素25克、二性霉素B50克、牛血清白蛋白100克、葡萄糖15克、油酸1克和过氧化氢酶0.2克溶于1000毫升纯水中，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
中止液：取固体硫酸亚铁氨5克，溶于纯水并稀释至100毫升，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
菌落培养皿：取浓度为1.5％的熔化琼脂6毫升，加入到市售的一次性无菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液6毫升和1.5毫升快速生长的草分枝杆菌，混匀，凝聚成型。
二、牛结核杆菌菌体的快速鉴定
a、取25毫升牛的乳汁置于样品管中，加入等量的氢氧化钠溶液，室温作用20分钟，然后在每分钟8000转下离心5分钟；
b、弃去样品管中的上清液，于沉淀中加入1.5毫升增菌液，37℃下温育24小时；
c、向样品管中加入0.15毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
d、向样品管中加入中止液0.15毫升，室温下作用10分钟；
e、取步骤d所得液体15微升，滴于菌落培养皿上，在37℃下培养15小时，观察结果，如在滴样区域出现全透亮或半透亮圈，表明待检样品中存在活的牛结核杆菌菌体，反之则不存在。
三、牛结核杆菌菌体的药敏试验
a、将待检菌株以标准比浊法制备成浓度为1毫克/毫升的悬液；
b、取步骤a所得悬液1毫升稀释至1000毫升，制备成浓度为1微克/毫升的悬液；
c、取两试验管1和2作为加药管，各加入1毫克/毫升悬液0.5毫升；
d、取两试验管3和4作为对照管，各加入1微克/毫升悬液0.5毫升；
e、在试验管1和3中各加入0.1毫升试验药物，在试验管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下温育24小时；
f、向各加药管和对照管中各加入0.1毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
g、向各加药管和对照管中各加入0.15毫升中止液，室温作用5分钟；
h、取步骤g中所得各加药管和对照管中的溶液各10微升，分别滴于菌落培养皿上，在37℃下温育15小时，观察结果。如对照管样品在滴样区域出现全透亮或半透亮圈、加药管无透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为耐药株；如对照管和加药管样品在滴样区域均出现全透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为敏感株。
实施例3
一、试剂配制：
样品处理液：取4克固体氢氧化钠溶于纯水并稀释至100毫升，配制成氢氧化钠溶液；
增菌液：取米氏7H9培养基7克、氯化钙1.5克、氨苄青霉素50克、二性霉素B25克、牛血清白蛋白200克、葡萄糖10克、油酸1.5克和过氧化氢酶0.2克溶于1000毫升纯水中，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
中止液：取固体硫酸亚铁氨8克，溶于纯水并稀释至100毫升，溶解完全后用无菌滤膜过滤备用；
菌落培养皿：取浓度为3％的熔化琼脂8毫升，加入到市售的一次性无菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液8毫升和1.5毫升快速生长的耻垢分枝杆菌，混匀，凝聚成型。
二、牛结核杆菌菌体的快速鉴定
a、取10毫升牛的鼻汁置于样品管中，加入等量的氢氧化钠溶液，室温作用25分钟，然后在每分钟8000转下离心10分钟；
b、弃去样品管中的上清液，于沉淀中加入2毫升增菌液，37℃下温育24小时；
c、向样品管中加入0.2毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
d、向样品管中加入中止液0.2毫升，室温下作用10分钟；
e、取步骤d所得液体20微升，滴于菌落培养皿上，在37℃下培养20小时，观察结果，如在滴样区域出现全透亮或半透亮圈，表明待检样品中存在活的牛结核杆菌菌体，反之则不存在。
三、牛结核杆菌菌体的药敏试验
a、将待检菌株以标准比浊法制备成浓度为1毫克/毫升的悬液；
b、取步骤a所得悬液1毫升稀释至1000毫升，制备成浓度为1微克/毫升的悬液；
c、取两试验管1和2作为加药管，各加入1毫克/毫升悬液0.5毫升；
d、取两试验管3和4作为对照管，各加入1微克/毫升悬液0.5毫升；
e、在试验管1和3中各加入0.1毫升试验药物，在试验管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下温育30小时；
f、向各加药管和对照管中各加入0.1毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
g、向各加药管和对照管中各加入0.2毫升中止液，室温作用10分钟；
h、取步骤g中所得各加药管和对照管中的溶液各20微升，分别滴于菌落培养皿上，在37℃下温育20小时，观察结果。如对照管样品在滴样区域出现全透亮或半透亮圈、加药管无透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为耐药株；如对照管和加药管样品在滴样区域均出现全透亮或半透亮圈，表明待检菌株对试验药物为敏感株。
Claims (7)
1、一种牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂盒，其特征在于：包括样品处理液、增菌液、分枝杆菌噬菌体、中止液和菌落培养皿。
2、如权利要求1所述的牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂盒，其特征在于：所述的样品处理液为2-4％的氢氧化钠溶液；所述的增菌液由米氏7H9培养基5-7重量份、氯化钙1-2重量份、氨苄青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和过氧化氢酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的纯水中制备而成；所述的中止液为5-8％的硫酸亚铁氨溶液；所述的菌落培养皿由1.5-3％的熔化琼脂6-8体积份、增菌液6-8体积份和指示菌1-2体积份混匀凝聚于无菌平皿中形成。
3、如权利要求2所述的牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂盒，其特征在于：所述的指示菌为耻垢分枝杆菌或草分枝杆菌。
4、一种牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法，其特征在于：采用牛结核杆菌菌体快速鉴定及药敏试验试剂盒，按以下步骤进行：
a、取10-50毫升待检样品置于样品管中，加入等量的样品处理液，室温作用20-30分钟，然后离心分离；
b、弃去样品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下温育24小时；
c、向样品管中加入0.1-0.2毫升分枝杆菌噬菌体，37℃下温育60分钟；
d、向样品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室温作用10分钟；
e、取步骤d所得液体10-20微升，滴于菌落培养皿上，在35-38℃下培养15-20小时，观察结果，如在滴样区域出现全透亮或半透亮圈，表明待检样品中存在活的牛结核杆菌菌体，反之则不存在。
5、如权利要求4所述的牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法，其特征在于：步骤a中所述的待检样品包括牛的鼻汁、乳汁、粪便、痰液、穿刺液。
6、如权利要求4所述的牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法，其特征在于：步骤a中所述的样品处理液为2-4％的氢氧化钠溶液；步骤b中所述的增菌液由米氏7H9培养基5-7重量份、氯化钙1-2重量份、氨苄青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和过氧化氢酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的纯水中制备而成；步骤d中所述的中止液为5-8％的硫酸亚铁氨溶液；步骤e中所述的菌落培养皿由1.5-3％的熔化琼脂6-8体积份、增菌液6-8体积份和指示菌1-2体积份混匀凝聚于无菌平皿中形成。
7、如权利要求6所述的牛结核杆菌菌体的快速鉴定方法，其特征在于：所述的指示菌为耻垢分枝杆菌或草分枝杆菌。
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