CN102703572A - 检测结核杆菌药敏性的方法及培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测结核杆菌药敏性的方法和培养基，所述培养基为酸性，pH值≥4.5。将结核杆菌与药物、以及本发明所述培养基混合后进行培养，3~20天即可观察，观察方法可以是通过肉眼直接观察沉淀。利用本发明所述方法和培养基，建立的微量MIC检测判断MTB菌药敏性的方法，不需要昂贵的仪器设备，仅需肉眼判读，结果准确，既可以获得较为详细的菌株耐药数据，又可以提供简单明了的药敏判断结果，作为一种准确、快速、低成本、易于操作药敏检测方法，在临床、以及企业中药物筛选和研发过程中具有良好的推广应用前景。

Description

检测结核杆菌药敏性的方法及培养基

技术领域

本发明涉及一种检测结核杆菌药敏性的方法和培养基，尤其涉及一种可以不加入显色剂即可观察结核杆菌药敏性的方法和培养基。

背景技术

结核杆菌（MTB）是高致死率的传染病，自上世纪80年代以来，全球结核病疫情出现了急剧恶化，其中重要原因之一是结核杆菌耐药性，耐药性已成为治疗和控制结核病的巨大障碍，因此，检测结核杆菌药物敏感性对于控制疫情、治疗疾病、药物筛选和研发等均极为重要。

WHO推荐的比例法稳定性较好，但是需要4周时间，无法为临床提供及时的用药参考；BACTEC 3D方法可在一周内报告结果，但是该方法采用放射性元素，价格昂贵。

张文宏等（《微生物与感染》，2008，3(4)：p204）报道了试验三磷酸腺苷发光法快速检测结核分枝杆菌药敏性，5~7天后检测敏感菌释放的ATP，从而判定MTB对药物的敏感性；彭丽等（《中国防痨杂质》，2005，27(1)：p18）报道了以分支杆菌噬菌体为基础的噬菌体生物扩增法，利用噬菌体生长快、只能活在分支杆菌中增殖的特性，可大大缩短检测时间；此外还报道耐药性基因测定，如PCR-单链构象多态性分析、DNA测序、DNA芯片检测等；虽然上述方法应用前景较好，但是上述对操作条件和操作人员技能要求较高，不利于工业上使用。

2000年，Caviedes等人建立了一种新的MTB耐药性检测技术——显微镜观察药物敏感度检测技术（MODS），通过倒置显微镜对MTB特征性索状结果进行观察，来确定MTB的生长，从而进行药敏判断，胡忠义、崔振玲等（《中华预防医学杂志》2011，45(1)：p21）进行了MTB痰涂阳标本直接药敏实验，证明MODS技术直接检测痰涂阳标本中MTB对药物的敏感度具有快速、准确、廉价的优点，可作为痰涂阳标本直接药敏检测方法。

在MODS方法中，将MTB与药物一起与培养基混合，然后进行培养，所用培养基主要为固体培养基和液体培养基、以及在此基础上的固液双相培养基、半流体培养基等，其中液体培养基能够使MTB广发接触营养成分，因此MTB生长较快，但是液体培养基不利于肉眼观察，一般需要加入显色剂染色，以判断结核杆菌是否生长，而显色剂往往会给MTB带来毒性，因此影响药敏性的判断。

发明内容

针对目前液体培养基、以及检测结核杆菌药敏性方法不便于直接肉眼观察的问题，本发明提供了一种新的检测结核杆菌药敏性的方法和培养基。

本发明第一个方面是提供一种检测结核杆菌药敏性的培养基，包括液体培养基、促生长组分，所述培养基为酸性，pH值≥4.5。

所述培养基pH值优选为4.5~6.5，更优选为5~6。

其中，所述液体培养基可以是单独的液体培养基，也可以是来自含有液体培养基的固液双相培养基、或包括所述液体培养基的混合物。

所述液体培养基如米氏培养基、苏通培养基、以及其它可用液体培养基、或上述培养基的改良，可以是其中的任意一种或多种的混合，并优选为米氏培养基7H9、7H10、7H11、或上述任意培养基的改良、或其中任意几种的组合，更优选为米氏培养基7H9、7H10、或上述任意培养基的改良、或其混合物；最有选为米氏培养基7H9、7H10、或其混合物。

所述促生长组分指的是促进结核杆菌生长的营养组分，如牛血清蛋白、小牛血清、酵母提取物、葡萄糖（右旋糖）、氯化钠、硫酸镁、氯化锰、油酸、过氧化氢酶（Catalase）等，可以是其中的任意一种或几种的混合物。

根据本发明所述培养基的一种实施例，所述液体培养基包括米氏培养基，以及用于调节pH值的酸，此外，还可以包括蛋白胨、酵母提取物、琼脂、甘油、乳化剂中的任意一种或几种的混合物；所述酸可以是有机酸或无机酸，并优选为无机酸，如磷酸、盐酸、磷酸氢盐、磷酸二氢盐等，可以是其中的任意一种或几种的混合物，所述盐优选为钾盐、钠盐、或其混合物。

所述蛋白胨可以是来自于动物或植物，如牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨等，具体例子包括酪蛋白胨、骨蛋白胨、胰蛋白胨等。

所述乳化剂可以是脂肪酸环氧乙烯酯、多元醇脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯与环氧乙烷缩合物等，如吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-21、吐温-80、吐温-81、吐温-85等，可以是一种或多种的混合物。

根据所述培养基的另一种优选实施例，所述培养基还包括抗生素，以抑制其它菌的生长，可以是单一抗生素或多种抗生素的混合物，如多粘菌素B、两性菌素B、萘啶酸、甲氧苄嘧啶、氨苄西林等。

本发明的第二个方面是提供一种检测结核杆菌药敏性的方法，步骤包括：

步骤1，将待测菌用上述内容中任意一种培养基配成菌液；

步骤2，将所述菌液与药物混合，进行培养；

步骤3，3~20天后观察沉淀，根据出现的沉淀量判断待测菌对药物的敏感度。

其中，步骤2中，药物在与菌液的混合物中浓度优选为1~5000μg/ml，更优选为10~3500μg/ml，更优选为12.5~3200μg/ml，更优选为100~500μg/ml，更优选为150~500μg/ml，如200μg/ml、400μg/ml等。

其中，所述药物指的是抗结核杆菌药物，如氧氟沙星、左氧氟沙星、利福平、利福布丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、异烟肼等，或者上述化合物的衍生物；优选为吡嗪酰胺。

其中，菌液中待测菌浓度优选为10²~10⁹CFU/ml，更优选为10³~10⁶CFU/ml，更优选为10⁴~10⁵CFU/ml，如2×10⁴CFU/ml、5×10⁴CFU/ml、6×10⁴CFU/ml。

其中，观察沉淀时间优选为5~20天后，更优选为7~14天后，更优选为7~10或10~14天后。

当菌量较大时，活菌生长会产生沉淀，死菌沉淀与活菌沉淀可能出现混淆，因此，上述方法中，培养基中还可以加入显色剂，如MTT、刃天青、XTT等，此时，活菌产生的沉淀带有其它颜色，而死菌沉淀为白色，但是显色剂并不是必须的。

因此，本发明上述的检测结核杆菌药敏性的培养基中，还可以包括显色剂，如MTT、刃天青、XTT等，但是显色剂并不是必须的。

根据本发明上述检测结核杆菌药敏性方法的一种优选实施方式，将菌液和药物置于培养板中进行培养。

根据本发明所述检测结核杆菌药敏性方法的进一步优选实施方式，所述培养板的培养孔为U型孔，即培养孔底部为球面。

本发明提供的检测结核杆菌药敏性的方法和培养基，可以在不使用显色剂的情况下，通过倒置显微镜或放大镜、或肉眼直接对沉淀进行观察，不需要特殊设备读取结果，只需肉眼观察孔底菌量和颜色变化即可判断结核分枝杆菌的药物敏感性。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测结核杆菌药敏性的方法和培养基，所述培养基为酸性，在不加入显色剂的情况下，即可通过肉眼直接观察。

以检测MTB对吡嗪酰胺药敏性为例，下面通过具体实施例，对本发明进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明内容，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。

菌株来源

MTB标准株（H37Rv，保藏号ATCC27294）和牛分枝杆菌（M.bovis，保藏号ATCC19210）购自美国国家菌种保藏中心。

60株已知结果的MTB临床分离株来自上海市肺科医院菌株库，已知PZA药敏结果，且药敏结果经罗氏绝对浓度法和Bactec MIGIT药敏检测（Bactec MIGIT药敏检测为WHO推荐的方法）结果一致的MTB菌株，60株菌株中30株为对吡嗪酰胺（PZA）敏感的MTB菌株，30株为对PZA耐药的MTB菌株。

280株未知药敏结果的MTB临床分离株，来源于上海市肺科医院结核科2011 年1月~12月住院患者的痰标本培养物，经菌种鉴定为MTB。

培养基组分

液体培养基：

米氏培养基7H9        4.7-5.9g

酪蛋白胨              1.25g

甘油                  2-5ml

吐温80               0.1-1ml

磷酸二氢钾调节pH值至5~6。

促生长成分

小牛血清              50.0g

右旋糖                20.0g

NaCl                  8.5g

过氧化氢霉            0.03g

油酸                  0.05-0.1g

在培养过程中，为了抑制空气中其它菌的污染，还可以加入抗生素成分，但是抗生素不是必须的。

抗生素

多粘菌素B             50U/ml

两性霉素B             5μg/ml

萘啶酸                 5-20μg/ml

甲氧苄嘧啶             2-5μg/ml

氨苄西林               10-25μg/ml

上述培养基仅为举例，所述液体培养基也可以是其它米氏培养基如7H10、7H11等，也可以是苏通培养基、或其它常用培养基。

实施例1

检测药敏性的方法

将50株已知菌株分别于液体培养基中培养2周，重悬、磨菌，取悬浊液用液体培养基配成菌液，每种菌株分三组，每一组菌株浓度为1×10⁵、4×10⁴、2×10⁴、1×10⁴和5×10³CFU/ml。

含吡嗪酰胺的96孔U型孔培养板中，每孔加入100μl菌液，各个培养孔中吡嗪酰胺浓度分别从12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml、800mg/ml、1600mg/ml梯度增加至3200mg/ml。

每种菌株第一组不加显色剂，第二组加入刃天青、第三组加入MTT。

37℃条件下培养，3天后即可通过倒置放大镜观察。其中：

1）直接肉眼观察（BMM）

出现肉眼可见的白色菌体沉淀为阳性，无肉眼可见菌体沉淀为阴性。MIC₉₀定义为孔底可见白色菌体沉淀小于10%对照孔的最低药物浓度。

2）刃天青（REMA）

颜色从蓝色变成粉色即预示细菌生长。MIC₉₀被定义为阻止颜色变化的最低药物浓度。

3）MTT（REMA）

颜色变成紫色，加入SDS-DMF溶液变黄色，即预示细菌生长。MIC₉₀被定义为阻止颜色变化的最低药物浓度。

观察结果

每次实验均以H37Rv为敏感株质控，以M.bovis为耐药株质控，同一菌株的MIC值重复检测3次；MIC值结果先以肉眼观察结果记录为BMM法结果；再以REMA法和MTT法对MIC结果进行确认。以Bactec MGIT药敏结果为标准，表1和表2中给出了本发明上述三种观察方法的MIC检测结果和Medcalc软件初步确定的敏感性和特异性结果。

表1，50株已知结果的MTB菌株的MIC检测结果

其中：S表示对药物敏感、R表示耐药；a表示最低药物浓度孔仍未见菌生长，b表示若最高药物浓度孔仍有菌生长。

从表1和表2中可以看出，采用本发明所述方法和培养基，对已知药敏结果的50株MTB临床分离株微量药敏检测，与Bactec MGIT药敏结果进行ROC曲线分析结果显示，3种观察方法曲线下面积均＞0.999，药物判断界值具均具有95%以上的特异性，其中在REMA和MTT的特异性达100%，说明利用合适的观察方式，本发明所述方法和培养基可以有效的判断出MTB敏感株，3种观察方法的药物判断界值的敏感性均可以达到95%以上，说明利用微量MIC值也可以有效判断出95%以上的MTB耐药株。

表2，Medcalc分析结果

其中：R表示耐药；S表示敏感。

实施例2

将150株MTB临床分离株，用Bactec MGIT进行药敏检测，其中，敏感株105株，耐药45株。然后使用实施例1所述方法进行检测，7~14天后进行观察。表3给出了BMM、REMA和MTT与Bactec MGIT药敏检测结果。

从表3中可以看出，105株敏感株中有103株的3种方法的MIC检测值≤100μg/ml，1株的3种方法检测值为400μg/ml，1株的BMM和MTT检测值为100μg/ml，REMA检测值为200μg/ml。45株耐药株中有38株的3种方法MIC检测值≥400μg/ml，4株的3种方法MIC检测值为≤100μg/ml，2株的3种微量MIC检测值为200μg/ml，1株的BMM检测值为400μg/ml，REMA和MTT检测值为200μg/ml。不加显色剂与加入显色剂时的检测方法相比，基本没有差异，甚至敏感度、准确度和特异度比加入显色剂时稍有提高，与Bactec MGIT药敏检测结果基本相符。

报告时间比较

150株未知药敏结果的MTB临床菌株，本发明方法微量药敏检测中，7d 时68株生长，10d时76株生长，14d时6株生长；肉眼直接观察的BMM法平均（8.80±1.82）d；而添加显色剂的REMA法和MTT法平均（9.80±1.82）d。BACTEC MGIT出现阳性最早5d，最晚18d，5-7d有20株，8-10d有86株，11-14d有40株，15-18d有4株，平均（9.57±2.31）d。

配对t检验，BMM与BACTEC MGIT法检测时间差异有统计学意义（t=4.88，P〈0.05）；REMA法和MTT法与BACTEC MGIT法检测时间差异无统计学意义（t=1.477，P>0.05）。这说明本发明直接肉眼观察所需时间更短。

表3，BMM、REMA和MTT与Bactec MGIT药敏检测结果对比

上述结果表明，利用本发明所述方法和培养基，建立的微量MIC检测判断MTB菌药敏性的方法，不需要昂贵的仪器设备，仅需肉眼判读，结果准确，既可以获得较为详细的菌株耐药数据，又可以提供简单明了的药敏判断结果。本发明检测判断MTB药物敏感性方法，作为一种准确、快速、低成本、易于操作药敏检测方法，具有良好的推广应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种检测结核杆菌药敏性的培养基，其特征在于，包括液体培养基、促生长成分，所述培养基为酸性，pH值≥4.5。

2.根据权利要求1所述的检测结核杆菌药敏性的培养基，其特征在于，所述培养基pH值为5~6。

3.根据权利要求1所述的检测结核杆菌药敏性的培养基，其特征在于，还包括抑制其它菌生长的抗生素。

4.根据权利要求1所述的检测结核杆菌药敏性的培养基，其特征在于，还包括显色剂。

5.根据权利要求1所述的检测结核杆菌药敏性的培养基，其特征在于，所述液体培养基为米氏培养基7H9、7H10、7H11、及各种可用于结核分枝杆菌培养的培养基、或其中任意几种的组合。

6.一种检测结合杆菌药敏性的方法，其特征在于，步骤包括：

步骤1，将待测菌用权利要求1所述培养基配成菌液；

步骤2，将所述菌液与药物混合，进行培养；

步骤3，5~20天后，根据出现的沉淀量判断待测菌对药物的敏感度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养温度为35~37℃。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中药物在与菌液的混合物中浓度为10~3500ug/ml。

9.根据权利要求6或8所述的方法，其特征在于，在所述菌液中，待测菌浓度为10³~10⁶CFU/ml。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养在培养板中进行，所述培养板的培养孔为U型孔。