CN112831539A - 一种需氧微生物的体外检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种需氧微生物的体外检测试剂盒，涉及生物化学检测技术领域，该试剂盒包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；其中，培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L‑精氨酸、维生素、枸橼酸钠、磷酸二氢钾、植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸。该试剂盒能够有效地中和抗生素，为微生物提供更有利的生长条件，进而提高需氧微生物的阳性检出率并缩短检出时间。

Description

一种需氧微生物的体外检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学检测技术领域，具体涉及一种需氧微生物的体外检测试剂盒。
背景技术
菌血症是指外界的细菌经由体表的入口或是感染的伤口进入血液系统，并在人体血液内 繁殖并随血流在全身播散。菌血症多是细菌由局部病灶入血，全身无中毒症状，但血液中可 查到细菌，主要发生在炎症的早期阶段。败血症是指致病菌或条件致病菌侵入血循环，并在 血中生长繁殖，产生毒素而发生的急性全身性感染。由于败血症绝大多数继发于各种感染， 又缺乏特异的临床表现，故易造成漏诊或误诊。常用血培养的方法来进行以上病症的诊断。 血培养是将新鲜离体的血液标本接种于营养培养基上，在一定温度、湿度等条件下，使对营 养要求较高的细菌生长繁殖并对其进行鉴别，从而确定病原菌的一种培养法。
目前为止，有关需氧微生物体外检测的方法和产品较少。中国专利CN104673662A公开 了一种培养瓶及其制备方法及应用，该培养瓶包括瓶体、瓶盖、胶塞、液体培养基、吸附树 脂、传感膜，该发明将仪器检测与人工目测合二为一，进行微生物培养时可在瓶外清晰观测 微生物生长情况，也可通过仪器实现连续检测，提高了检测灵敏度，缩短了阳性检出时间。 但该发明主要实现了荧光和化学传感膜技术相互结合，同时通过吸附树脂的加入降低抗生素 的负面影响并通过促生长因子的加入促进维生素的快速繁殖，上述方法均为目前本领域中较 为常规的手段，但该发明在培养基成分等方面并未做过多优化，因此有一定的局限性，即难 以达到更高阳性检出率以及更短检出时间。
中国专利CN103343157A公开了一种用于检测血液病原菌的细菌培养液，包括细菌生长 所需的营养物质、抗凝血剂和拮抗抗生素试剂，该培养液中细菌繁殖快，从而缩短血液检测 时间，另外，细菌代谢产物可以通过和培养液中碳酸氢盐反应转变成能被仪器识别的化学讯 号，使血液检测准确度高，因此在血液临床检验领域拥有广泛的应用前景。但该发明整体的 报阳时间仍然较长，几乎均在10h以上，最高已达到45.4h。
针对现有的需氧微生物体外检测存在的报阳时间长以及阳性率低等问题，亟需寻找一种 阳性检出率高且检出率短的需氧微生物的体外检测试剂盒，从而能够实现需氧微生物的迅速 检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种需氧微生物的体外检测试剂盒，该试剂盒 能够有效地中和抗生素，为微生物提供更有利的生长条件，进而提高需氧微生物的阳性检出 率并缩短检出时间。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种需氧微生物的体外检测试剂盒，包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、 瓶盖和感受器；
进一步地，所述培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L-精氨酸、维生素、枸 橼酸钠、磷酸二氢钾、植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸。
进一步地，所述培养液包括：1-10g/L胰蛋白胨、1-10g/L明胶蛋白胨、1-10g/L脑心浸 液、1-10g/L L-精氨酸、1-10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.1-0.15g/L维生素、0.2-0.5g/L枸橼酸 钠、0.2-0.5g/L磷酸二氢钾、0.06-0.08g/L植物甾醇、0.1-0.2g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0012- 0.0015g/L叶酸。
优选地，所述培养液包括：4.5g/L胰蛋白胨、6.3g/L明胶蛋白胨、5.5g/L脑心浸液、4.8g/L L-精氨酸、5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.12g/L维生素、0.3g/L枸橼酸钠、0.3g/L磷酸二 氢钾、0.06g/L植物甾醇、0.15g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0014g/L叶酸。
进一步地，所述维生素包括维生素B和/或维生素C。
进一步地，所述植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸的重量比为0.06-0.08:0.15-0.2:0.0014- 0.0015。优选为0.06:0.15:0.0014。
进一步地，所述植物甾醇和叶酸的重量比为0.06-0.08:0.0014-0.0015。优选为0.06:0.0014。
进一步地，所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的一种或多种。值得说明的 是，本发明中使用的植物甾醇均为水溶性植物甾醇。
进一步地，所述吸附树脂为阴离子交换树脂和大孔吸附树脂，二者可以以任意比例配合 使用。
进一步地，所述感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。
进一步地，所述培养液使用双蒸水进行配制。
本发明还提供了上述试剂盒在非诊断目的体外检测需氧微生物中的应用。
进一步地，所述需氧微生物包括肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌、化脓链球菌、 白色念珠菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏菌。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明中产品的液体培养基中加入多种营养成分，可以供多种微生物的生长培养，各 个原料之间通过相互配合，能够达到极佳的效果，研究发现通过添加植物甾醇、聚茴香脑磺 酸钠和叶酸能够有效地促进菌种活性，非但不会抑制菌群生长，还能够在一定程度上提高培 养阳性率，同时单纯将植物甾醇与叶酸配合使用时，也具有相近似的性质。培养瓶中充入无 菌气体，为微生物提供生长条件，从而达到不同营养需求的微生物的生长需要。加入树脂， 可以中和抗生素，减少抗生素对血培养结果的影响。
2.细菌在代谢过程中会释放出二氧化碳等产物，二氧化碳与培养瓶底部含有荧光染料的 感受器反应，使感受器内结合二氧化碳的荧光物质被激发出荧光，全自动血培养仪检测系统 每10min自动检测一次荧光水平，通过电脑数据系统处理得出培养结果，并以声、光等信号 报告。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种需氧微生物的体外检测试剂盒，包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受 器；
其中，培养液包括1g/L胰蛋白胨、1g/L明胶蛋白胨、1g/L脑心浸液、1g/L L-精氨酸、 1g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.05g/L维生素B、0.05g/L维生素C、0.2g/L枸橼酸钠、0.2g/L磷 酸二氢钾、0.06g/L谷甾醇、0.1g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0012g/L叶酸。上述培养液使用双蒸 水进行配制，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料，吸附树脂为体积比为1:1的阴离 子交换树脂和大孔吸附树脂。
实施例2
一种需氧微生物的体外检测试剂盒，包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受 器；
其中，培养液包括10g/L胰蛋白胨、10g/L明胶蛋白胨、10g/L脑心浸液、10g/L L-精氨 酸、10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.05g/L维生素B、0.1g/L维生素C、0.5g/L枸橼酸钠、0.5g/L 磷酸二氢钾、0.08g/L豆甾醇、0.2g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0015g/L叶酸。上述培养液使用双 蒸水进行配制，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料，吸附树脂为体积比为1:1的阴 离子交换树脂和大孔吸附树脂。
实施例3
一种需氧微生物的体外检测试剂盒，包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受 器；
其中，培养液包括4.5g/L胰蛋白胨、6.3g/L明胶蛋白胨、5.5g/L脑心浸液、4.8g/LL-精 氨酸、5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.02g/L维生素B、0.01维生素C、0.3g/L枸橼酸钠、0.3g/L 磷酸二氢钾、0.06g/L菜油甾醇、0.15g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0014g/L叶酸。上述培养液使 用双蒸水进行配制，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料，吸附树脂为体积比为1:1 的阴离子交换树脂和大孔吸附树脂。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，培养液包括0.8g/L胰蛋白胨、12g/L明胶蛋白胨、0.8g/L脑 心浸液、12g/L L-精氨酸、0.05g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.08g/L维生素B、0.1g/L维生素C、 0.1g/L枸橼酸钠、0.6g/L磷酸二氢钾、0.1g/L谷甾醇、0.08g/L聚茴香脑磺酸钠和0.001g/L叶 酸。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，不加入植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸的重量比为 0.04:0.25:0.001(三者的总重量与实施例1一致)。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，植物甾醇和叶酸的重量比为0.09:0.001(二者的总重量与实 施例1一致)。
试验1：本发明中试剂盒的普适性
样本要求：
1.采用正确医用技术收集的动脉血或其他无菌体液样本。
2.样本收集过程中需要特别注意无菌操作。
3.血培养瓶应该在2h之内送到实验室。不推荐将瓶子置于室温数小时，血培养瓶不应该在 接种后冷藏或冷冻；因为这样可能会杀死一些微生物，而且还可能会破碎冷冻装有液体的瓶 子，裂解-离心法收集的血培养标本也不应该放置超过8h；标本放置时间过长可能会降低阳 性率或延缓某些细菌的生长。
检验方法：
1.检查培养瓶有无污染，破损。
2.启下透明塑料盖，用酒精棉球或碘酒对橡胶盖进行消毒。
3.严格无菌操作，获取患者样本(建议成人采血5-10mL，婴幼儿采血1-3mL)，并在无菌 条件下将其接种入培养瓶将培养瓶运送到微生物室，多次倾斜培养瓶，立即放入全自动检测 仪器或培养箱中培养。
产品性能指标：
1.外观：培养瓶应无裂缝、无漏液、渗液；瓶内的液体无浑浊、无絮状沉淀、澄清透明。
2.无菌性：取5瓶培养瓶置35℃-37℃培养7天，无菌生长。
3.生长试验：
分别使用实施例1-3中的试剂盒接种菌悬液浓度为100cfu/mL-1000cfu/mL质控菌株(肺 炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌、化脓链球菌、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏菌)，35℃-37℃培养24h-72h。生长情况应符合如下表 1。
结果判读情况：
人工目测判读结果：培养瓶倾斜后直立于35℃-37℃培养箱内培养24h-72h，若有以下 现象：培养液出现溶血，颜色变暗或固相有菌落长出等，即为阳性，可进一步进行菌种鉴定 和药敏实验。每日观察，若没有上述现象，可继续培养，如一周内仍未出现上述现象进行镜 检、盲传确认，确认无菌后作阴性结果报告。
仪器检测判读结果：培养瓶通过扫描后放于仪器中，如果培养阳性仪器会自动报警，即 为阳性，可进一步进行菌种鉴定和药敏试验。5天内仪器没有报警，镜检、盲传确认无菌后 作阴性结果报告。
注意事项：
1.该培养瓶仅用于体外诊断。
2.该培养瓶为一次性使用产品，使用后的培养瓶不可回收再利用。
3.该培养瓶内已经添加了血液抗凝剂，无须另外添加。
4.在进行静脉穿刺和培养瓶接种时，要注意采取措施，以防患者样本的污染。
5.所用接种后的血培养瓶，样品采集针和抽血用具应视为具有传染性物质，必须按照当 地实验室操作步骤及规范进行处理。
6.培养瓶应在外包装标示的有效期内使用。
表1
Figure BDA0002919451920000061
Figure BDA0002919451920000071
由表1可知，在经由本发明中实施例1-3的试剂盒进行培养后，各类菌种的人工目测结 果以及仪器检测判读结果均为有菌生长，报阳。可见本发明中试剂盒对于上述各个菌种检测 的有效性、普适性。
试验2：本发明中试剂盒的准确性
随机挑选三种厌氧菌(肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌)，采用不同实例中的 试剂盒进行检测，每种各测试20组，统计阳性检出率(菌悬液浓度为100cfu/mL)，得到表2和表3。
表2
Figure BDA0002919451920000072
表3
Figure BDA0002919451920000073
本发明的试剂盒能够有效地缩短肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和粪产碱杆菌的检出时间， 提高阳性检出率，其中，实施例1-3中试剂盒阳性检出率达95％以上，最高可达100％。相 比较而言，各组对比例由于培养液中原料组成成分的选择以及配比情况未达到合适状态，最 终检出时间较长，阳性检出率也未达到期许值。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的 限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离 本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种需氧微生物的体外检测试剂盒，其特征在于：包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；
所述培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L-精氨酸、维生素、枸橼酸钠、磷酸二氢钾、植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸。
2.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述培养液包括：1-10g/L胰蛋白胨、1-10g/L明胶蛋白胨、1-10g/L脑心浸液、1-10g/L L-精氨酸、1-10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.1-0.15g/L维生素、0.2-0.5g/L枸橼酸钠、0.2-0.5g/L磷酸二氢钾、0.06-0.08g/L植物甾醇、0.1-0.2g/L聚茴香脑磺酸钠和0.0012-0.0015g/L叶酸。
3.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述维生素包括维生素B和/或维生素C。
4.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述植物甾醇、聚茴香脑磺酸钠和叶酸的重量比为为0.06-0.08:0.15-0.2:0.0014-0.0015。
5.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述吸附树脂为阴离子交换树脂和大孔吸附树脂。
7.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。
8.根据权利要求7所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述培养液使用双蒸水进行配制。
9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在非诊断目的体外检测需氧微生物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述需氧微生物包括肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌、化脓链球菌、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏菌。
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