CN114645072B - 一种液态b群链球菌选择性显色培养基及其制备方法 - Google Patents

一种液态b群链球菌选择性显色培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及培养基技术领域，尤其是一种液态B群链球菌选择性显色培养基及其制备方法，以1L计包含以下组分：䏡蛋白胨8.0～30g、直链玉米淀粉6.0～30g、麦芽三糖0.1～1.0g、3‑N吗啉丙磺酸MOPS7.0～20g、磷酸氢二钠十二水合物14～40g、琼脂糖0.1～2.0g、葡萄糖1.0～6.0g、丙酮酸钠0.5～2.5g、硫酸镁0.1～1.0g、硫酸庆大霉素5.0～80mg、萘啶酮酸10～100mg、结晶紫0.1～3.0mg、奥硝唑5.0～50mg。该培养基能有效防止淀粉显色剂在溶液状态下的复性，优化的抗生素组合可以有效阻止杂菌生长，使得培养基在液态下可长期保存。

Description

一种液态B群链球菌选择性显色培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及培养基技术领域，尤其是一种液态B群链球菌选择性显色培养基及其制备方法。
背景技术
Ｂ族链球菌（group B streptococcus，GBS）是一种革兰氏阳性球菌，常定植于人下生殖道及胃肠道，也可定植于婴幼儿上呼吸道。20世纪60年代首次发现其可导致严重的新生儿感染，随后进行了大量的研究，发现B族链球菌是围生产期女性泌尿生殖道感染的常见病原菌，在围产期感染中是第一位的致病菌，可以导致孕产妇泌尿系统感染、羊膜绒毛膜炎、产褥感染、败血症和早产等，同时B族链球菌可引起新生儿重症肺炎、败血症和脑膜炎，严重时可导致围产儿死亡。1996年美国疾病控制和预防中心（centers for diseasecontrol and prevention，CDC）联合其他专业机构，制定了“围产期B族链球菌疾病预防指南”，于2002年进行了一次较大的修改，并在2010年11月更新了指南。经过10年多的实践，新生儿GBS感染率下降了约80%。新生儿的GBS感染临床进展迅速，具有发病快、病死率高的特点，是新生儿的主要死亡原因，已引起世界范围内广大学者的深切关注。细菌培养是检测GBS的标准方法，但此菌营养要求较高，传统的培养鉴定耗时较长（至少２天）且阳性率较低。如何在感染早期快速、准确、灵敏地检测Ｂ族链球菌已成为现阶段的研究热点。
目前临床常用的B族链球菌检测方法除了传统的培养鉴定法外，主要有固体培养基（平皿）显色培养、液体培养基显色培养、荧光PCR法等。固体显色培养法对人员技术要求高、人为误差大；PCR法成本高、所需设备昂贵；而液体显色培养无需特殊设备，方法简便、结果直观、灵敏度和特异性均能满足临床要求。
目前已批准上市的B群链球菌液体显色培养基中，由于不能解决溶液状态下淀粉复性以及杂菌污染的问题，导致液态培养基无法长期保存，因此多采用培养基冻干粉加稀释液的形式。这种试剂盒稳定性好，灵敏度高，特异性强，结果便于观察，完全满足临床对于该类产品的要求。但是，这类产品在复溶阶段操作繁琐，使用前准备耗时较长，不太适合大批量标本的检测。
发明内容
本发明的目的是：克服现有技术中的不足，提供一种液态B群链球菌选择性显色培养基。
为实现上述目的，本发明中采用的技术方案如下：
一种液态B群链球菌选择性显色培养基，基础培养基：䏡蛋白胨、直链玉米淀粉、麦芽三糖、琼脂糖、3-N吗啉丙磺酸MOPS、磷酸氢二钠十二水合物、纯化水；
补充液：葡萄糖、丙酮酸钠、无水硫酸镁、硫酸庆大霉素、萘啶酮酸、结晶紫、奥硝唑、纯化水；
无菌灭活马血清。
进一步的，基础培养基以940mL计包含以下组分：䏡蛋白胨8.0～30g、3-N吗啉丙磺酸(MOPS) 7.0～20g、磷酸氢二钠十二水合物14～40g、直链玉米淀粉6.0～30g、麦芽三糖0.1～1.0g、琼脂糖0.1～2.0g。
其中，䏡蛋白胨为B群链球菌生长主要营养成分之一，MOPS和磷酸氢二钠十二作为缓冲体系，维持最适PH。琼脂糖通过物理作用、麦芽三糖通过化学作用共同防止作为显色组分的淀粉链的复性。
进一步的，补充液以100mL计包含以下组分：葡萄糖10～60g、丙酮酸钠5.0～25g、硫酸镁1.0～10g、硫酸庆大霉素50～800mg、萘啶酮酸100～1000mg、结晶紫1.0～30mg、奥硝唑50～500mg。
其中，葡萄糖、丙酮酸钠、硫酸镁作为B群链球菌生长的补充营养成分，硫酸庆大霉素和萘啶酮酸抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性杂菌的生长，奥硝唑抑制厌氧菌的生长，结晶紫抑制霉菌和革兰氏阳性杂菌生长。
本发明的另一个目的是：克服现有技术中的不足，提供一种液态B群链球菌选择性显色培养基的制备方法。
一种液态B群链球菌选择性显色培养基的制备方法，包括基础培养基的制备、补充液的制备、全培养基的制备。
进一步的，所述基础培养基的制备包括以下步骤：
溶液A的制备：称取䏡蛋白胨8.0～30g、3-N吗啉丙磺酸(MOPS) 7.0～20g、磷酸氢二钠十二水合物14～40g溶于400ml水，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.0～7.6，121℃/15min灭菌，冷却至室温得到溶液A，备用；
溶液B的制备：直链玉米淀粉6.0～30g、琼脂糖0.1～2.0g加入700ml水，用恒温磁力搅拌器50～90℃，800～1200转/分加热搅拌进行溶解，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.0～7.6，121℃/15min灭菌，冷却至室温后，加入经0.22um超滤除菌的5%麦芽三糖溶液2.0～20ml充分混匀，室温静置过夜，待淀粉链上的活性羟基封闭，得到溶液B，备用；
老化复性：上述溶液B于2～8℃放置24h，37℃放置24h，2～8℃再次放置24h，使得含未封闭的活性羟基淀粉链复性沉淀，得到老化后的溶液B，备用；
取老化后的溶液B上清液540ml，加入溶液A 400ml配制成基础培养基。
进一步的，所述补充液的制备包括以下步骤：称取葡萄糖10～60g、丙酮酸钠5.0～25g、硫酸镁1.0～10g、硫酸庆大霉素50～800mg、萘啶酮酸100～1000mg、结晶紫1.0～30mg、奥硝唑50～500mg，再加入工艺用纯化水100ml充分混匀，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调pH至7.0～7.6，用0.22um滤膜超滤除菌备用。
进一步的，全培养基的制备包括以下步骤：基础培养基940ml加入补充液10ml和无菌灭活马血清50ml。
采用本发明中的技术方案的有益效果是：
通过琼脂糖这种胶体介质降低了溶液中淀粉链的布朗运动，同时麦芽三糖封闭了淀粉链上的活性羟基，使得该培养基能有效防止淀粉显色剂在溶液状态下的复性。另外优化的抗生素组合可以有效阻止杂菌生长，使得培养基在液态下可长期保存。该培养基为开盖即用型，打开管盖插入采样拭子即可，无需繁杂的复溶准备，操作极为简便。需要说明的是到目前为止市面上还没有该类型的液态培养基，同类产品在液态下保存时间小于2周，不得不采用冻干的方式做成产品，不仅增加生产成本，而且用户绕不开繁琐的复溶步骤。我们添加麦芽三糖和琼脂糖、优化抗生素组合以及设计相关制作工艺就是为了在液态下延长保存时间至6个月，用户无须复溶。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。如没有特别强调温度，通常指在室温下进行反应，本发明中的室温是指10～30℃。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径买到。
1、基础培养基的配制（B群链球菌生长所需基本营养成分及显色组分）
表1 基础培养基配方
Figure 194836DEST_PATH_IMAGE001
2、补充液的配制（B群链球菌所需其他营养成分及用以抑制杂菌生长的抗生素组合）
表2 补充液配方
Figure 157982DEST_PATH_IMAGE002
3 全培养基的配制（B群链球菌生长所需全部营养成分、显色组分、抑制杂菌生长的抗生素组合等）
表3 全培养基配方
Figure 875402DEST_PATH_IMAGE003
4、实施例1：
4.1按表1中实施例1的配方配制基础培养基
溶液A的制备：称取䏡蛋白胨15.0g、3-N吗啉丙磺酸(MOPS) 9.6g、磷酸氢二钠十二水合物19.0g溶于400ml水，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.3±0.1，121℃/15min灭菌，冷却至室温得到溶液A备用；
溶液B的制备：直链玉米淀粉17.0g、琼脂糖0.6g加入700ml水，用恒温磁力搅拌器80℃，1000转/分加热搅拌进行溶解，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.3±0.1，121℃/15min灭菌，冷却至室温后，加入经0.22um超滤除菌的5%麦芽三糖溶液8.0ml充分混匀，室温静置过夜，待淀粉链上的活性羟基封闭，得到溶液B；
老化复性：将上述溶液B于2～8℃放置24h，37℃放置24h，2～8℃再次放置24h，使得含未封闭的活性羟基淀粉链复性沉淀；
取复性后的溶液B上清540ml，加入溶液A400ml配制成基础培养基；
4.2按表2中实施例1的配方配制补充液
称量葡萄糖20.0g、丙酮酸钠12.0g、无水硫酸镁2.8g、硫酸庆大霉素100mg、萘啶酮酸200mg、结晶紫5.0mg、奥硝唑200mg，加入工艺用纯化水100ml充分混匀，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调pH至7.3±0.1。
4.3按表3中实施例1的配方配制全培养基
在超净工作台内，每940ml基础培养基加入补充液10ml和已灭活无菌马血清50ml，充分混匀，得到实施例1的全培养基。
5、实施例2：
5.1按表1中实施例2的配方配制基础培养基
溶液A的制备：称取䏡蛋白胨17.0g、3-N吗啉丙磺酸(MOPS) 10.3g、磷酸氢二钠十二水合物20.2g溶于400ml水，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.3±0.1，121℃/15min灭菌，冷却至室温得到溶液A备用；
溶液B的制备：直链玉米淀粉18.5g、琼脂糖0.3g加入700ml水，用恒温磁力搅拌器80℃，1000转/分加热搅拌进行溶解，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.3±0.1，121℃/15min灭菌，冷却至室温后，加入经0.22um超滤除菌的5%麦芽三糖溶液16.0ml充分混匀，室温静置过夜，待淀粉链上的活性羟基封闭，得到溶液B；
老化复性：将上述溶液B于2～8℃放置24h，37℃放置24h，2～8℃再次放置24h，使得含未封闭的活性羟基淀粉链复性沉淀；
取复性后的溶液B上清540ml，加入溶液A400ml配制成基础培养基；
5.2按表2中实施例2的配方配制补充液
称量葡萄糖22.0g、丙酮酸钠11.0g、无水硫酸镁2.4g、硫酸庆大霉素120mg、萘啶酮酸250mg、结晶紫4.0mg、奥硝唑180mg，加入工艺用纯化水100ml充分混匀，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调pH至7.3±0.1。
5.3按表3中实施例2的配方配制全培养基
在超净工作台内，每940ml基础培养基加入补充液10ml和已灭活无菌马血清50ml，充分混匀，得到实施例2的全培养基。
6、实施例3～5按上述实施例配制步骤分别配制各自全培养基，在此不一一赘述。
7、全培养基的分装：在超净工作台内打开培养基瓶盖，用可调定量移液器按4.25ml/管，将培养基分装至无菌的定制培养管内并加盖。
8、生长性能：
8.1 质控菌株的活化：B族链球菌「无乳链球菌Streptococcus agalactiae，BNCC316406（=ATCC12386）」按说明书活化，活化步骤： ①准备 1 支含有 5~10mL 脑心浸液培养基的试管和 2 个血平板；②安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂， 随后用镊子将其敲碎；③吸取 0.5mL 脑心浸液培养基打入冻干管， 充分溶解后重新打回脑心浸液试管中，混匀；④吸取 0.2mL 菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板；⑤将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h，菌种长出即可使用。
8.2 接种菌悬液制备：将活化的无乳链球菌Streptococcus agalactiae，
BNCC316406（=ATCC12386）菌种用分区划线法接种于血平板上37℃培养24h，挑取菌落加入到2ml无菌生理盐水中，置WGZ-XT麦氏浊度仪读取浊度，用无菌生理盐水调整浊度至0.5麦氏单位（0.5MCF，约为108CFU/ml）。
8.3 接种和培养：各取1接种环上述菌悬液（约10ul）分别接种于2支培养管（每管含4.25ml B族链球菌液体显色培养基，此时接种终浓度约为105CFU/ml）中，37℃恒温培养箱中培养24h，静止状态下（勿摇动）观察，显橙红色沉淀或培养基变为橙红色，符合生长性要求。对照试剂为：珠海贝索生物技术有限公司生产的“B群链球菌液体显色培养基” [冻干型，注册证号：粤械注准20192400162]， 结果见表4。
表4 生长性能结果
Figure 208294DEST_PATH_IMAGE004
9、特异性：
9.1质控菌株的活化：大肠埃希菌Escherichia coli, BNCC 269342（=ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, BNCC 139843（=ATCC 29213)、粪肠球菌Enterococcus faecalis,BNCC 290708（=ATCC29212）、白假丝酵母菌(Candidaalbicans，BNCC333935= ATCC 10231)按说明书活化，活化步骤：①准备 2 支含有 5~10mL营养肉汤培养基的试管、1支含有 5~10mL YM肉汤培养基的试管、1支含有 5~10mL 脑心浸液培养基的试管和4个营养琼脂平板、4个血平板；②安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂， 随后用镊子将其敲碎；③各吸取 0.5mL 液体培养基（大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌用肉汤培养基，粪肠球菌用脑心浸液培养基，白假丝酵母菌用YM培养基）打入冻干管， 充分溶解后重新打回液体试管中，混匀；④吸取 0.2mL 菌悬液 打入平板中（大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌用营养琼脂平板，粪肠球菌和白假丝酵母菌用血平板），涂布均匀，重复两次各获得两个平板；⑤将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h，菌种长出即可使用。
9.2接种菌悬液的准备：将活化的大肠埃希菌(Escherichia coli, ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, ATCC 29213)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC29212)和白假丝酵母菌(Candida albicans,ATCC 10231)菌种用分区划线法分别接种于营养琼脂平板和血平板上37℃培养24h，挑取菌落加入到2ml无菌生理盐水中，置WGZ-XT麦氏浊度仪读取浊度，用无菌生理盐水调整浊度至0.5麦氏单位（0.5MCF，约为108CFU/ml）。
9.3 按表5分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和白假丝酵母菌，37℃恒温培养箱中培养24h，结果符合特异性的要求。对照试剂为：珠海贝索生物技术有限公司生产的“B群链球菌液体显色培养基” [冻干型，注册证号：粤械注准20192400162]，见表6。
表5 特异性试验相关菌株接种
Figure 288246DEST_PATH_IMAGE005
表6 特异性试验结果
Figure 313970DEST_PATH_IMAGE007
10、十二种常见菌（临床分离株）的培养，其阴性符合率满足临床要求。对照试剂为：珠海贝索生物技术有限公司生产的“B群链球菌液体显色培养基” [冻干型，注册证号：粤械注准20192400162]，结果见表7。
表7 其他常见菌临床分离株培养结果
Figure 223414DEST_PATH_IMAGE008
11、新鲜配制的实施例1～5液态B群链球菌选择性显色培养基于2～8℃存放6个月，取出恢复至室温后，按步骤8、9做生长性培养和特异性培养，其稳定性试验结果见表8。
表8 培养基稳定性测试结果
Figure 625576DEST_PATH_IMAGE009
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种液态B群链球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述培养基包含以下组分：
基础培养基：䏡蛋白胨、直链玉米淀粉、麦芽三糖、琼脂糖、3-N吗啉丙磺酸MOPS、磷酸氢二钠十二水合物、纯化水；
补充液：葡萄糖、丙酮酸钠、无水硫酸镁、硫酸庆大霉素、萘啶酮酸、结晶紫、奥硝唑、纯化水；
无菌灭活马血清；
基础培养基以940mL计 由以下组分组成：䏡蛋白胨15.0～23.0g、3-N吗啉丙磺酸MOPS9.6～12.4g、磷酸氢二钠十二水合物19.0～23.8g、直链玉米淀粉17.0～23.0g、麦芽三糖0.4～0.8g、琼脂糖0.3～0.7g；
补充液以100mL计由以下组分组成：葡萄糖20～28g、丙酮酸钠8.0～12g、硫酸镁1.2～2.8g、硫酸庆大霉素80～200mg、萘啶酮酸120～250mg、结晶紫1.5～5.0mg、奥硝唑100～200mg。
2.如权利要求1所述的一种液态B群链球菌选择性显色培养基的制备方法，其特征在于：包括基础培养基的制备、补充液的制备、全培养基的制备；
所述基础培养基的制备包括以下步骤：
溶液A的制备：称取䏡蛋白胨15.0～23.0g、3-N吗啉丙磺酸(MOPS) 9.6～12.4g、磷酸氢二钠十二水合物19.0～23.8g溶于400ml水，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.0～7.6，121℃/15min灭菌，冷却至室温得到溶液A，备用；
溶液B的制备：直链玉米淀粉17.0～23.0g、琼脂糖0.3～0.7g加入700ml水，用恒温磁力搅拌器50～90℃，800～1200转/分加热搅拌进行溶解，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调PH至7.0～7.6，121℃/15min灭菌，冷却至室温后，加入经0.22um超滤除菌的5%麦芽三糖溶液8.0～16ml充分混匀，室温静置过夜，待淀粉链上的活性羟基封闭，得到溶液B，备用；
老化复性：上述溶液B于2～8℃放置24h，37℃放置24h，2～8℃再次放置24h，使得含未封闭的活性羟基淀粉链复性沉淀，得到老化后的溶液B，备用；
取老化后的溶液B上清液540ml，加入溶液A 400ml配制成基础培养基；
所述补充液的制备包括以下步骤：称取葡萄糖20～28g、丙酮酸钠8.0～12g、硫酸镁1.2～2.8g、硫酸庆大霉素80～200mg、萘啶酮酸120～250mg、结晶紫1.5～5.0mg、奥硝唑100～200mg，再加入工艺用纯化水100ml充分混匀，待完全溶解后用3.0mol氢氧化钠调pH至7.0～7.6，用0.22um滤膜超滤除菌备用。
3.根据权利要求2所述的一种液态B群链球菌选择性显色培养基的制备方法，其特征在于：全培养基的制备包括以下步骤：基础培养基940ml加入补充液10ml和无菌灭活马血清50ml。
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