CN101469340B - 革兰阳性需氧菌鉴定板及其制备方法 - Google Patents

革兰阳性需氧菌鉴定板及其制备方法 Download PDF

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陈弛宇
朱骏娜
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Abstract

本发明提供了革兰阳性需氧菌鉴定板。本发明鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阳性菌种类有300余种，可以鉴定葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、阳性杆菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果，操作简单，结果准确，因而，有较大的临床应用价值。本发明提供了革兰阳性需氧菌鉴定板的制备方法。

Description

革兰阳性需氧菌鉴定板及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂。具体涉及一种革兰阳性需氧菌鉴定板及其制备方法。
背景技术
近20年来，由于临床上广泛大量地使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐2-7种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来很大困难，特别是对于医院内感染的细菌。医院内感染是出现在医院环境中的感染，并易发生流行，故又可将其称为医院获得性感染(Hospital acquiredinfection)。虽然发生医院感染的病情有轻有重，但都给病人增加了额外的痛苦、经济负担和不幸，同时也会由于延长住院时间而加重医疗和护理工作的负担，影响病床周转。严重的医院感染往往使病人所患的疾病不能达到预期的疗效，甚至产生难以治疗的后遗症或死亡。据美国的一次不完全统计资料报告，其住院病人中约有5％发生医院感染，平均延长住院4～5d，每年约有10万人死亡于医院感染，估计每年由于医院感染要多消耗20余亿美元。
从引起医院感染的微生物来看，固然有些仍是所熟悉的致病性很强的微生物，但是近年来医院感染的病原体种类有明显变化的趋势，革兰氏阴性菌已取代了原来为主要病原的革兰氏阳性球菌，其中肠杆菌科及假单胞菌约占医院感染的60％-65％，并且主要为多耐药性细菌。由于广泛应用抗生素，细菌的不断变迁，助长了医院内感染的存在和发展，今日的临床微生物学最重要的特点是向医院感染方面转变。
微生物鉴定及药敏分析系统是主要应用于临床实验室的高科技体外诊断产品，对辅助临床各科室诊断治疗具有重要意义。目前在国际上，对细菌的快速鉴定和药敏分析已经取得了很大的进展，微生物自动化检测产品逐步替代了手工检测。
目前，微生物自动化检测产品主要有：法国生物-梅里埃公司的VITEK-AMS微生物分析系统、美国Dade-MicroScan公司的MicroScan自动微生物鉴定和药敏测试系统以及英国Trek Diagnostic System Ltd.的SENSTITRE荧光法快速微生物鉴定和药敏分析系统。它们的工作原理相近，主要是根据细菌理化性质的差异，采用光电比色，测定细菌生长分解底物导致PH值改变而产生的不同颜色和浊度变化来判断反应情况，从而给出鉴定药敏结果。
但是，上述检测产品在临床推广上，用于微生物鉴定主要存在以下几个方面的问题：
(1)鉴定时间偏长，需要16-24小时给出结果；
(2)鉴定范围比较狭窄，可以鉴定的细菌种类少。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种快速准确革兰阳性需氧菌鉴定板。
本发明的鉴定检测实验基于下列原理：
根据目前微生物鉴定领域权威的伯杰细菌鉴定手册，细菌的鉴定主要通过检测细菌对各种营养物质的利用情况，即通过检测细菌生化反应特性来鉴定细菌。而细菌利用营养物质发生生化反应的过程中，会发生一系列的氧化还原反应，这些氧化还原反应中会产生NADH，而NADH能够把四唑紫(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)指示剂由无色的氧化型转变为紫色的还原型。因此我们使用四唑紫作为细菌发生生化反应的指示剂，来检测细菌的生化反应特性，从而达到细菌鉴定的目的。
不同细菌利用不同碳源或氮源进入新陈代谢过程，而对其他一些碳源或氮源则无法利用，这些特性是细菌的遗传物质所决定的。目前现有的微生物鉴定板最多只有30个生化反应，因此对于鉴定细菌的种类方面比较狭窄，可以鉴定的革兰阳性菌种类最多只有150余种，且不同种类的细菌需要使用不同种类的板条进行鉴定，同时需要通过补充实验进行验证才能得出鉴定结果，操作比较繁琐。
因此，为了克服上述不足之处，达到鉴定所需细菌的目的，就需要选择一组合适的碳源和氮源。本发明人选择了500多种碳源和氮源，对多种细菌进行检测，通过对这些数据的分析整理，最终确定目前板条的碳源和氮源的组合(见下表)。该种鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阳性菌种类有300余种，可以鉴定葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、阳性杆菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果。
革兰阳性需氧菌鉴定板底物表
Figure GSB00000599112600041
本发明提供了一种革兰阳性需氧菌鉴定板，该鉴定板由反应底物原液和肉汤培养基组成，所述反应底物原液在鉴定板上的位置及其各成分的浓度为：(g/ml)
  位置   溶液名称   浓度
  A1，A7   水   100％
  A2，A8   糊精   4％
  A3，A9   N-乙酰-D-葡糖胺   4％
  A4，A10   N-乙酰-β-D-甘露糖胺   4％
  A5，A11   苦杏苷   4％
  A6，A12   L-树胶醛糖   4％
 B1，B7   对苯二酚葡萄糖苷  4％
 B2，B8   D-纤维二糖  4％
 B3，B9   D-半乳糖  4％
 B4，B10   D-葡萄糖酸  4％
  B5，B11   α-D-葡萄糖  4％
  B6，B12   甘油  4％
 C1，C7   α-D-乳糖  4％
 C2，C8   乳果糖  4％
 C3，C9   麦芽糖  4％
 C4，C10   麦芽三糖  4％
 C5，C11   D-甘露醇  4％
 C6，C12   D-蜜二糖  4％
 D1，D7   3-甲基-葡萄糖  4％
 D2，D8   β-甲基-D-葡糖苷  4％
 D3，D9   帕拉金糖  4％
 D4，D10   D-阿洛酮糖  4％
 D5，D11   D-棉子糖  4％
 D6，D12   D-核糖  4％
 E1，E7   水杨甙  4％
 E2，E8   D-山梨糖醇  4％
 E3，E9   蔗糖  4％
 E4，E10   D-塔格糖  4％
 E5，E11   D-海藻糖  4％
 E6，E12   松二糖  4％
 F1，F7   木糖醇  4％
 F2，F8   丙酮酸甲基酯  4％
 F3，F9   单甲基琥珀酸  4％
 F4，F10   醋酸  2％
 F5，F11   α-羟基丁酸钠  2％
 F6，F12   α-酮戊酸  2％
 G1，G7   L-乳酸  4％
 G2，G8   D-丙氨酸  2％
 G3，G9   L-丙氨酸  2％
 G4，G10   L-丙氨酰-甘氨酸  2％
 G5，G11   L-丝氨酸  3％
 G6，G12   腺苷  2％
 H1，H7   2’-脱氧腺苷  2％
 H2，H8   肌苷  2％
 H3，H9   胸腺嘧啶脱氧核苷  2％
 H4，H10   尿嘧啶核苷  2％
  H5，H11   尿嘧啶核苷-5’-单磷酸酯  2％
  H6，H12   D-葡萄糖-6-磷酸酯  2％
所述肉汤培养基由下列成分组成：(v/v)
 物质名称   所占比例
 纯水   64％
 GP/MT(革兰阳性菌盐贮液)   21.9％
 氯化铵NH4Cl水溶液   4.4％
 GP(革兰阳性菌)混合贮液   0.88％
 50μM叶酸水溶液   0.088％
 8mM维生素K3亚硫酸氢钠水溶液   4.4％
 结晶紫水溶液   4.4％
其中GP/MT(革兰阳性菌盐贮液)由下列成分组成：(重量％浓度)
  物质名称   所占比例
  纯水[H2O]   80％
  2水合磷酸二氢钠[NaH2PO4-2H2O]   4.68％
  磷酸氢二钠[Na2HPO4]   12.775％
  氯化钾[KCl]   2.61％
  十水合焦磷酸钠[Na4P2O7-10H2O]   0.018％
本发明的另一目的是提供了革兰阴性需氧菌鉴定板的制备方法。
由于革兰阳性菌需氧菌鉴定板可以鉴定不同种类的细菌，包括一些营养成分要求比较高的苛养菌，因此必须有一种合适的营养物质来满足各种不同种类细菌生长的需要。
本发明人通过以下实验对混合试剂中的成分组成进行了选择，研制发明了一种混合试剂，该混合试剂有多种细菌生长所需的营养物质混合组成。
1、实验方法
选取无机盐基础、氨基酸、磷酸缓冲液、维生素、蛋白胨、牛肉膏、麦芽膏等多种细菌生长营养物质按不同的组合方式和适当的比例混合配置成试剂，然后选取不同种类的细菌进行试验，以确定合种组合方式可以满足各种不同种类细菌的生长。
2、实验结果
本实验选取了金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大鼠链球菌、马红球菌、极小棒杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌不同种类细菌加入不同混合试剂配置的鉴定板条中进行实验，实验结果如下：
Figure GSB00000599112600071
通过上述实验表明：组合5的混合试剂可能满足不同种类细菌生长的需要，因此本发明人确定了混合试剂的组合方式，该混合试剂的各物质按下列比例混合配置成GP(革兰阳性菌)混合试剂：重量％浓度
  物质名称   所占比例
  纯水[H2O]   75％
  无机盐   6％
  氨基酸   8％
  维生素B6   7.5％
  牛肉膏   0.5％
  磷酸缓冲液   1％
  蛋白胨   1.5％
  麦芽膏   0.5％
本发明方法包括下列步骤：
1、配置鉴定板反应底物原液
根据下列配置浓度要求配置各反应底物的原液。(g/ml)
 位置   溶液名称   浓度
 A1，A7   水   100％
 A2，A8   糊精   4％
 A3，A9   N-乙酰-D-葡糖胺   4％
 A4，A10   N-乙酰-β-D-甘露糖胺   4％
 A5，A11   苦杏苷   4％
 A6，A12   L-树胶醛糖   4％
 B1，B7   对苯二酚葡萄糖苷  4％
 B2，B8   D-纤维二糖  4％
 B3，B9   D-半乳糖  4％
 B4，B10   D-葡萄糖酸  4％
 B5，B11   α-D-葡萄糖  4％
 B6，B12   甘油  4％
 C1，C7   α-D-乳糖  4％
 C2，C8   乳果糖  4％
 C3，C9   麦芽糖  4％
 C4，C10   麦芽三糖  4％
 C5，C11   D-甘露醇  4％
 C6，C12   D-蜜二糖  4％
 D1，D7   3-甲基-葡萄糖  4％
 D2，D8   β-甲基-D-葡糖苷  4％
 D3，D9   帕拉金糖  4％
 D4，D10   D-阿洛酮糖  4％
 D5，D11   D-棉子糖  4％
 D6，D12   D-核糖  4％
 E1，E7   水杨甙  4％
 E2，E8   D-山梨糖醇  4％
 E3，E9   蔗糖  4％
 E4，E10   D-塔格糖  4％
 E5，E11   D-海藻糖  4％
 E6，E12   松二糖  4％
 F1，F7   木糖醇  4％
 F2，F8   丙酮酸甲基酯  4％
 F3，F9   单甲基琥珀酸  4％
 F4，F10   醋酸  2％
 F5，F11   α-羟基丁酸钠  2％
  F6，F12   α-酮戊酸  2％
 G1，G7   L-乳酸  4％
 G2，G8   D-丙氨酸  2％
 G3，G9   L-丙氨酸  2％
 G4，G10   L-丙氨酰-甘氨酸  2％
 G5，G11   L-丝氨酸  3％
 G6，G12   腺苷  2％
 H1，H7   2’-脱氧腺苷  2％
 H2，H8   肌苷  2％
 H3，H9   胸腺嘧啶脱氧核苷  2％
 H4，H10   尿嘧啶核苷  2％
 H5，H11   尿嘧啶核苷-5’-单磷酸酯  2％
 H6，H12   D-葡萄糖-6-磷酸酯  2％
2、配置肉汤培养基
(1)、下列各物质的按比例混合配置GP/MT(革兰阳性菌盐贮液)重量％浓度
  物质名称   所占比例
  纯水[H2O]   80％
  2水合磷酸二氢钠[NaH2PO4-2H2O]   4.68％
  磷酸氢二钠[Na2HPO4]   12.775％
  氯化钾[KCl]   2.61％
  十水合焦磷酸钠[Na4P2O7-10H2O]   0.018％
(2)、按下列各物质配置浓度要求配置GP混合贮液(g/ml)
  物质名称   浓度
  GP混和试剂加水配置GP混合贮液   0.2475％
(3)、根据下列配置浓度要求配置以下几种物质的水溶液。(g/ml)
  物质名称   浓度
  0.5mM叶酸   0.022％
  结晶紫   1.8-2.1％
  8mM维生素K3亚硫酸氢钠   0.2％-0.24％
  氯化铵   5.3％
(4)、按下列各物质的比例混合配置肉汤培养基(v/v)
 物质名称   所占比例
 纯水   64％
 GP/MT   21.9％
 氯化铵NH4Cl水溶液   4.4％
 GP混合贮液   0.88％
 50μM叶酸水溶液   0.088％
 8mM维生素K3亚硫酸氢钠水溶液   4.4％
  结晶紫水溶液   4.4％
3、分装
(1)根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤1配置的反应底物原液分装到96支试管中。
(2)根据板条批量生产的数量要求将步骤2配置的肉汤培养基加入到(1)的试管中。
4、加样分装板条
使用分装系统在96孔的相应位置对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul；
5、板条干燥
上述板条常温干燥16-18小时；
6、包装。
7、板条存贮
由于本发明鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阳性菌种类有300余种，可以鉴定葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、阳性杆菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果，操作简单，结果准确，因而，有较大的临床应用价值。
具体实施方式：
革兰阳性需氧菌鉴定板，批量生产375块产品的生产工艺流程如下：
配置鉴定板反应底物原液(g/ml)
  孔位   药物名称   纯水本批所需量(ml)  药物本批所需量(g)
  A1，A7   水   18  18
  A2，A8   糊精   18  0.72
  A3，A9   N-乙酰-D-葡糖胺   18  0.72
  A4，A10   N-乙酰-β-D-甘露糖胺   18  0.72
  A5，A11   苦杏苷   18  0.72
  A6，A12   L-树胶醛糖   18  0.72
  B1，B7   对苯二酚葡萄糖苷   18  0.72
  B2，B8   D-纤维二糖   18  0.72
  B3，B9   D-半乳糖   18  0.72
  B4，B10   D-葡萄糖酸   18  0.72
  B5，B11   α-D-葡萄糖   18  0.72
  B6，B12   甘油   18  0.72
  C1，C7   α-D-乳糖   18   0.72
  C2，C8   乳果糖   18   0.72
  C3，C9   麦芽糖   18   0.72
  C4，C10   麦芽三糖   18   0.72
  C5，C11   D-甘露醇   18   0.72
  C6，C12   D-蜜二糖   18   0.72
  D1，D7   3-甲基-葡萄糖   18   0.72
  D2，D8   β-甲基-D-葡糖苷   18   0.72
  D3，D9   帕拉金糖   18   0.72
  D4，D10   D-阿洛酮糖   18   0.72
  D5，D11   D-棉子糖   18   0.72
  D6，D12   D-核糖   18   0.72
  E1，E7   水杨甙   18   0.72
  E2，E8   D-山梨糖醇   18   0.72
  E3，E9   蔗糖   18   0.72
  E4，E10   D-塔格糖   18   0.72
  E5，E11   D-海藻糖   18   0.72
  E6，E12   松二糖   18   0.72
  F1，F7   木糖醇   18   0.72
  F2，F8   丙酮酸甲基酯   18   0.72
  F3，F9   单甲基琥珀酸   18   0.72
  F4，F10   醋酸   18   0.36
  F5，F11   α-羟基丁酸钠   18   0.36
  F6，F12   α-酮戊酸   18   0.36
  G1，G7   L-乳酸   18   0.72
  G2，G8   D-丙氨酸   18   0.36
  G3，G9   L-丙氨酸   18   0.36
  G4，G10   L-丙氨酰-甘氨酸   18   0.36
  G5，G11   L-丝氨酸   18   0.54
  G6，G12   腺苷   18   0.36
  H1，H7   2’-脱氧腺苷   18   0.36
  H2，H8   肌苷   18   0.36
  H3，H9   胸腺嘧啶脱氧核苷   18   0.36
  H4，H10   尿嘧啶核苷   18   0.36
  H5，H11   尿嘧啶核苷-5’-单磷酸酯   18   0.36
  H6，H12   D-葡萄糖-6-磷酸酯   18   0.36
2、配置肉汤培养基
(1)、将下列各物质混合配置GP/MT
  物质名称   药物本批所需量
  纯水[H2O]   400ml
  2水合磷酸二氢钠[NaH2PO4-2H2O]   18.72g
  磷酸氢二钠[Na2HPO4]   51.1g
  氯化钾[KCl]   10.44g
  十水合焦磷酸钠[Na4P2O7-10H2O]   0.071g
(2)、按下列各物质的比例混合配置GP混合贮液
  物质名称   纯水本批所需量(ml)   药物本批所需量(g)
  GP混合试剂   50   12.375
(3)、根据配置浓度要求配置以下几种物质水溶液。
  物质名称   纯水本批所需量(ml)   药物本批所需量(g)
  0.5mM叶酸   10   0.0022
  结晶紫   50   0.9-1.05
  8mM维生素K3亚硫酸氢钠   50   0.1-0.12
  氯化铵   50   2.65
(4)将下列各物质混合配置肉汤培养基
  物质名称   药物本批所需量
  纯水   656ml
  GP/MT   225ml
  氯化铵NH4Cl水溶液   45ml
  GP混合贮液   9ml
  50μM叶酸水溶液   0.9ml
  8mM维生素K3亚硫酸氢钠水溶液   45ml
  结晶紫水溶液   45ml
3、分装
(1)将配置的反应底物原液分装到相对应的96支试管中，每管加入6.675ml。
(2)将配置的肉汤培养基加入到96支试管中，每管加入8.95ml。
4、加样分装板条
将配置好的96根试管装在加样机上，使用加样机对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul。(在这之前要先运行分装系统；整个程序大约需要3个小时)。
5、板条干燥
将加样好的板条放入干燥间进行常温干燥，24小时后板条可干燥完毕。
6、板条包装
将干燥好的板条从干燥间经传递窗送到包装间进行包装。
7、板条存贮
包装完毕的板条放入2-8℃冰箱进行保存。

Claims (5)

1.一种革兰阳性需氧菌鉴定板，其特征在于该鉴定板由反应底物原液和肉汤培养基组成，所述反应底物原液在鉴定板上的位置及其各成分的浓度为：g/ml
Figure FSB00000599112700011
所述肉汤培养基由下列成分组成：v/v
Figure FSB00000599112700022
2.根据权利要求1所述一种革兰阳性需氧菌鉴定板，其特征在于所述肉汤培养基中的革兰阳性菌盐贮液由下列成分组成：重量％浓度
Figure FSB00000599112700023
3.根据权利要求1所述一种革兰阳性需氧菌鉴定板，其特征在于所述肉汤培养基中的革兰阳性菌混合贮液由下列成分组成的革兰阳性菌混合试剂加水配置而成，重量％浓度
Figure FSB00000599112700031
4.根据权利要求1所述一种革兰阳性需氧菌鉴定板，其特征在于所述革兰阳性需氧菌鉴定板的底物及其在鉴定板上的位置为：
5.一种革兰阳性需氧菌鉴定板的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)配制鉴定板反应底物原液
根据下列配置浓度要求配置各反应底物的原液：g/ml
Figure FSB00000599112700051
(2)配制肉汤培养基
①下列各物质按比例混合配制革兰阳性菌盐贮液        重量％浓度
②按下列各物质配制浓度要求配制革兰阳性菌混合贮液  g/ml
物质名称                                          浓度
革兰阳性菌混和试剂加水配置溶液                    0.2475％
③根据下列配制浓度要求配制以下几种物质的水溶液    g/ml
Figure FSB00000599112700053
④按下列各物质的比例混合配制肉汤培养基 v/v
Figure FSB00000599112700054
Figure FSB00000599112700061
(3)分装
①根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤1配制的反应底物原液分装到96支试管中；
②根据板条批量生产的数量要求将步骤2配制的肉汤培养基加入到①的试管中；
(4)加样分装板条
使用分装系统在96孔的相应位置对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul；
(5)板条干燥
上述板条常温干燥16-18小时；
(6)包装；
(7)板条存贮。
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