JPH074272B2 - 微生物検出用特異的培地 - Google Patents

微生物検出用特異的培地

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JPH074272B2
JPH074272B2 JP62041220A JP4122087A JPH074272B2 JP H074272 B2 JPH074272 B2 JP H074272B2 JP 62041220 A JP62041220 A JP 62041220A JP 4122087 A JP4122087 A JP 4122087A JP H074272 B2 JPH074272 B2 JP H074272B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水、食品等のような試料中の微生物の検出に関
する。さらに特に、本発明は目標微生物だけが有意に代
謝でき、そして代謝されると、試料の特性を変える分子
を放出する栄養源を含有する、殺菌が不必要の試験用培
地を用いる目標微生物の検出に関する。従つて、本発明
による培地は目標微生物以外の微生物の生育をまた支持
する一般培地とは異なり、目標微生物だけの生育を支持
するという点で「特異的培地」である。
人間、動物または環境起源のいづれかの検査試料中の微
生物病原体を検出するために、次の一般的方法が常用さ
れている。試料中の目標（およびその他の）微生物をこ
の試料とともに、これらの微生物の生育に必要な全ての
栄養源を提供する培養培地中に接種する。検査試料は未
処理の天然試料であつてもよく、あるいは、たとえば膜
濾過により予備処理された試料でもよい。培養培地は栄
養源および代謝拮抗物質または抗生物質のような目標微
生物以外の微生物に対して選択的に活性であるその他の
選択性化学物質を含有する。このような培養培地は選択
性化学物質を含有しているけれども、目標微生物および
関連微生物の両方の生育を支持し、従つて目標微生物に
対して部分的にだけ特異性であることから「一般培地」
である。
水溶液または水ゲルであることができるこの培養培地は
存在することがあり、従つて分析を干渉しうるいづれか
の汚染性微生物を排除するために殺菌される。培養培地
は製造後の汚染を避けるために連続乾燥させ、包装せね
ばならない。
一種または二種以上の培養培地に検査試料を接種した後
に、接種した培地は制御された大気条件下に少なくとも
16〜18時間、あるいはそれ以上の間インキユベートす
る。インキユベーシヨン後に、培養培地を目標微生物の
生育適合性について検査する。このような生育が見られ
たならば、その試料をさらに分析する。これは目標微生
物の存在がその他の微生物との混合状態でなく、純粋な
状態で単離することによつてだけ確認できるからであ
る。後続の培養培地上に単離した後に、目標微生物は種
々の物理的および化学的特徴についての試験により同定
される。明確な目標微生物増殖物が単離されない場合に
は、誤つた陰性の試験結果になることがある。
この最も慣用の分析方法は時間が掛り、また無菌性が保
持されるように注意深く実施しなければならない。
試験方法を簡単で、迅速にするためのかなりの研究が行
なわれている１分野に水の微生物についての試験方法が
あり、このような研究には次例がある。
Manjaは飲料水の糞便汚染を反応ブロスからの硫化水素
の直接的分析により検出する野外試験法を開発した。こ
の試験はサルモネラ菌の単離に役立つがエスケリツチヤ
コリ（Escherichia coli、以下E.coliで示す）を選択
しないために、まだ広く普及していない。SmithはE.col
i用の迅速な単一管確認試験を開発した。彼は乳糖の量
を半減し、そして10％トリプトフアンを加えることによ
りラウリル トリプトースを修飾した。Reasonerは膜濾
過法にもとづく迅速７時間糞便大腸菌（fecal colifor
m）試験方法を開発した。この方法では、試料100mlを膜
に通して濾過し、ｍ−７と称されている培地上におき、
44.5℃で７時間インキユベートする。糞便大腸菌は黄色
であり、これは乳糖醗酵を示している。この技法は迅速
であるが、野外作業用に変更できず、MPN（most probab
le number＝最高確率数）としての特異性を同様に欠い
ている。
数人の研究者は上水道の分析手段として細菌副産物の検
出を試みている。Jorgensenは細菌性毒素の検出にリム
ルス（Limulus）溶解物を利用している。細菌の存在は
また電気的インピーダンス測定により評価されている。
しかしながら、これらの試験の中で、当分野において受
け入れられた方法はない。これはこれらの試験法がコロ
ニイ内で生存すると見做され、胃腸内病原菌の存在を予
期させる見張り細菌（sentinal bacteria）として使用
できる微生物を特異的に分析しない方法であるからであ
る。
微生物が生育した後にだけ色が変わる微生物増殖物の指
示体がある。しかしながら、これらは微生物用の餌とし
ては役立たない。これらは目標微生物により産生される
代謝副産物との化学的反応により単独で作用を現わす。
これらは目標微生物に対していづれの刺激作用も示さな
い。pHが変化すると色が変わる化学物質が細菌増殖物の
存在または不存在を示すために使用されている。常用さ
れているpH指示薬はフエノール レツド、ブロモクレゾ
ール ブルーおよびニユートラル レツドを包含する。
これらの指示薬を使用するためには、微生物を生育させ
る培地を完全なものにしなければならない。すなわち、
炭素源、アミノ酸源、塩類、ビタミン類脂肪酸、エネル
ギー源が必要である。指示薬は補助的材料である。微生
物学の用語において、培地は一般に多大の微生物のため
のものである。すなわちこれらは添加された指示薬とと
もに、多大の微生物の生育を支持する。
pH指示薬以外の指示薬を用いる細菌生育の検出方法が提
案されている。これらの方法では、電気的インピーダン
ス、電導度、ATP（アデノシントリホスフエート）の
量、濁度（光学濃度）のような標示対象が一般培地にお
ける被測定化学物質の添加下に微生物の増殖により検出
される。たとえば、Golber（米国特許第3,206,317号）
はタンパク質、酵母エキス、デキストロース、塩化ナト
リウムおよびその他の栄養源を含有する培地でトリフエ
ニル テトラゾリウム クロリドを使用している。彼は
この特許において、pH指示薬であるフエノール レツド
を含む一般培地をまた開示している。目標微生物（一種
または二種以上）を含有すると考えられる試料をこの培
地に接種する。この培地は目標微生物ばかりでなく、ま
た同様のその他の微生物の生育、代謝および増殖に必要
な全成分を含有する。微生物が増殖した後に、これらの
微生物は培地中の一種または二種以上の成分を代謝す
る。その老廃物およびその他の生成物が指示薬との反応
により測定できる。たとえば、微生物からの老廃物の一
種にイオン性水素があり、これは酸性状態を作り出し、
フエノール レツドを赤色から黄色に変える。別の老廃
物には還元剤がある。これらはテトラゾリウム クロリ
ドと反応して、この染料を無色から青紫色に変える。
Berger等（米国特許第3,496,066号）は細菌が先駆体化
合物から染料に変換する新規な一連の化合物を開示して
いる。彼等は異なる細菌が異なる先駆体化合物を異なる
色の染料に変換できることを開示している。各場合に、
先駆体化合物は細菌の餌としては役立たない。微生物が
一般培地で代謝し、生育し、そして増殖すると、先駆体
化合物は染料に変換される。
Bochner（米国特許第4,129,483号）は酸化−還元指示薬
の変化による微生物の同定または試験方法を開示してい
る。微生物がこの酸化−還元指示薬であるテトラゾリウ
ム化合物に異化作用する。本発明の要件は指示薬として
作用する指示薬それ自体を使用することなく、微生物の
生育を支持する栄養源を培地中に含有することにある。
Bochnerは彼の発明において非生体内分解性であり、還
元された後に色を変えることにより関与する化合物を指
示薬として必要としている。
本発明では、目標微生物にとつて好ましいまたは主要栄
養源であるが、試料中に目標微生物とともに存在するこ
とがあるいづれかのその他の生きている微生物が実質的
に代謝できない指示物質を使用することにより試料中の
目標微生物を検出する。従つて、本発明は従来技術で使
用されていた積極的反応剤ではなく、むしろ目標微生物
の活性選択体（active selector）を使用する。このよ
うな指示物質は当該栄養源が目標微生物により代謝され
ると、試料の特性を変化させる。この特性は色（可視光
線、紫外線または赤外線）、電導度、電気的インピーダ
ンス等であることができる。本発明の好ましい態様は代
謝されると、検査試料を含有する水溶液の可視色または
蛍光色を変える栄養源−指示物質を使用する目標微生物
の検出を包含する。
この栄養源−指示物質は好適または主要栄養源としての
役目を果すことにより目標微生物の生育に実際的に関与
する。目標微生物はこれらが、そして実質的にこれらだ
けがその主要栄養源として指示物質を使用できるので、
生育し、代謝し、そして増殖できる。指示物質は塩、炭
素、窒素、イオウ、アミノ酸、脂肪酸、ペプチトまたは
その他の微生物用主要栄養源に結合した色原体を含有す
る。目標微生物以外の微生物は生育、代謝または増殖が
妨害されるので、この培地は非常に特異性であつて、本
発明では使用前の殺菌は不要である。目標微生物とその
他の微生物との間の培地中の利用可能な栄養源に対する
競合は本発明では排除される。本発明による培地は試験
する試料に添加する粉末形で製造でき、包装できる。前
記したように、殺菌は不必要である。本発明による培地
は水に溶解でき、試料はこの溶液に添加できる。あるい
は、試料が水性である場合には、培地を試料に直接添加
できる。試料中のその他の微生物の中でこの培地中の栄
養源を実質的に代謝できるものは存在しないので、目標
微生物の生育を確実にするための最低インキユベーシヨ
ン時間も不必要である。
特定の色の発現が目標微生物の存在を指示する。これは
処理を開始した後のいづれかの時点で生起しうる。目標
微生物の精製も不必要である。目標微生物が存在するか
否かを決定するために試料を化学的に分析する必要もな
い。
微生物の命名は分類学的に行なわれる。或る全般的特徴
から出発して、樹木様判定図をたどつていく。さらにこ
の樹木様判定図を下がつていくと、さらに特異的な特性
が一つの微生物をあるレベルに位置づけることになる。
各レベルは界、族、科等のようなそれ自身の名前を有す
る。属および種はこの樹木様判定図の最後の２つのレベ
ルである。微生物の名前はこの属および種によつて知ら
れている。
人間と同様に、微生物も科学の世界におけるそれらの位
置について２つの名前を有する。すなわち属名と種名で
ある。属は共通の特徴を分け合つている微生物の群を表
わす。人間の家族の名前と類似している。種はそれ以上
分類できない分類区分である。これは人の名と同様であ
る。しかしながら、人間の名前と同様に、同一属および
種名を有する微生物（たとえば、Escherichia coli）も
全部が同一であることはない。属名は種名の前にくる
（姓を始めに書くのと同様である）。
本明細書で使用するかぎりにおいて、「目標微生物」の
用語は単一の微生物、関連種の微生物または共通の分類
学的特徴を有する大きい範囲の属の微生物を表わす。本
発明における指示物質は「目標微生物」に対して特異的
である必要があるだけである。たとえば、指示物質はEs
cherichia coli（E.coli）のような単一の微生物の検出
に、あるいはKlebsiella-Enterobacter-Serratiaのよう
な密に関連する種の微生物の検出に、あるいはグラム陰
性細菌のような広範な属の微生物のいづれか一種の検出
に利用できる。栄養源−指示物質に使用される色原体は
可視光線範囲、紫外線範囲または赤外線範囲で色を生じ
ることができるものである。前記から明白なように、栄
養源−指示物質は好ましくは未代謝状態で無色であり、
好ましくは微生物により代謝された後に、発色基を放出
する。この色は可視、蛍光または機械により読み取り可
能な色であることができる。前記したように、本発明を
使用すると、培地中の微生物間で餌または栄養源に対し
ての競合はほとんど僅かであるか、または全く見られな
い。これは培地中の唯一の栄養源が目標微生物により独
占的にいづれか有意の程度に代謝されうるからである。
従つて、従来技術の方法で生じる有意の数の誤つた陰性
の試験結果が本発明により排除される。使用される栄養
源は目標微生物がその他の栄養源よりも一般に好むもの
であり、またその他の微生物が僅かに好むか、または全
く好まないものである。従つて、検査試料中の目標微生
物が存在する場合にだけ、試料における色またはその他
の特性変化を生じさせるに充分な栄養源の代謝が生じ
る。
本発明における栄養源−指示物質は目標微生物に対して
だけ実質的に特異性であつて、好ましくは目標微生物用
の培地における好適または主要栄養源であるので、目標
微生物はこの栄養源−指示物質を摂取して、色変化の速
度が高められる。
従つて、本発明の目的は試料の検出できる特性の代謝的
変化により検査試料中の微生物を検出する方法を提供す
ることにある。
本発明のもう一つの目的は試料の色が目標微生物の代謝
により変えられる、前記特徴を有する方法を提供するこ
とにある。
本発明のさらにもう一つの目的は色変化が試料に添加さ
れた栄養源の代謝により与えられ、この栄養源がその代
謝後にだけ検出できる色原体分子を含むものである、前
記特徴を有する方法を提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は色原体分子を有する栄
養源が目標微生物によつてだけ有意に代謝されうるもの
である、前記特徴を有する方法を提供することにある。
本発明のこれらのおよびその他の目的は本発明の数種の
好適態様を説明する以下の詳細な記載からさらに容易に
明白になるだろう。
グラム陰性微生物の属および種の微生物（Escherichia
coli）、グラム陽性微生物の属および種の微生物（Stre
ptococcus faecalis）、およびかなりの数の微生物（グ
ラム陰性微生物）を含む広い群よりなる分類学的区分を
検出するために本発明を用いる三つの例を以下に詳細に
説明する。検査試料をこれらの三種のいづれかについて
検査する場合に、それぞれの目標微生物を標記する。
Escherichia coli 栄養源は酵素Ｂ−グルクロニダーゼの基質である。E.co
liの存在と色変化により検出しようとする場合には、栄
養源−指示物質はオルトニトロフエニル−Ｂ−Ｄ−グル
クロニド（黄色）、Ｂ−ナフタルアミド−Ｂ−Ｄ−グル
クロニド（紫色）、アルフア−ナフトール−Ｂ−Ｄ−グ
ルクロニド（赤色）、またはメチル ウンビリフエリル
−Ｂ−Ｄ−グルクロニド（蛍光色）等であることができ
る。
これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用す
る。培地の残りの成分は各成分がE.coliに必要な成分を
提供するように作成する。
先ず、培地からグラム陰性微生物に族する広い分類範囲
以外の微生物との競合を防止するために、抗生物質、バ
ンコマイシンおよびアンシオマイシンを５重量％の量で
加える。これらの抗生物質は１〜10重量％の範囲で存在
できる。
次いで、グラム陰性細菌からE.coliを選択するために、
次の成分を使用する： Streptococcus faecalis Streptococcus faecalisは尿道管系感染に見られる微生
物である。この微生物はプールの水で分析される主要微
生物でもある。
栄養源−指示物質は酵素Ｌ−ピロニドリル アミノペプ
チダーゼの基質である。S.faecalisの存在を色変化によ
り検出しようとする場合には、栄養源−指示物質部分は
オルトニトロフエニル−Ｂ−Ｌ−ピロニドニル（黄
色）、Ｂ−ナフタルアミド−Ｂ−Ｌ−ピロニドリル（紫
色）、アルフア−ナフトール−Ｂ−Ｌ−ピロニドニル
（赤色）、およびメチルウンビリフエニル−Ｂ−Ｌ−ピ
ロニドニル（蛍光）である。
これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用す
る。培地中の残りの成分は各成分がS.faecalisに要求さ
れる成分を提供するようにする。
先ず、グラム陽性細菌に族する広い区分以外の微生物と
の競合を防止するために、抗生物質コリスチン、ナラデ
イキシン酸およびアンシオマイシンを加える。
次いで、グラム陽性細菌からS.faecalisを選択するため
に、E.coliの場合について特定されている同一成分混合
物を前記栄養源−指示物質および抗生物質とともに使用
する。栄養源−指示物質は0.345重量％の濃度で存在さ
せる；その使用可能範囲は約0.2〜約2.0重量％である。
抗生物質は５重量％の濃度で存在させ、その使用可能範
囲は約１〜約10重量％である。
グラム陰性細菌 細菌には２つの広い群、すなわちグラム陽性群とグラム
陰性群とがある。グラム陰性細菌は、これらがその身体
の一部分として毒性物質、いわゆるエンドトキシンを含
有することから重要である。これらの細菌はまた医薬品
およびその他の医療用製剤の汚染物でありうる。
栄養源−指示物質は酵素Ｌ−アラニン アミノペプチダ
ーゼの基質である。グラム陰性細菌の存在を色変化によ
り検知しようとする場合には、栄養源−指示物質部分は
Ｌ−アラニン−Ｂ−オルトニトロフエニル（黄色）、ベ
ーター−ナフタルアミド−Ｂ−Ｌ−アラニン（紫色）、
アルフア−ナフトール−Ｂ−Ｌ−アラニン（赤色）、お
よびメチルウンビリフエリル−Ｂ−Ｌ−アラニン（蛍
光）であることができる。
これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用す
る。培地の残りの成分は各成分がグラム陰性細菌に必要
な成分を提供するようにする。
先ず、グラム陰性細菌の広いカテゴリイ以外の微生物を
排除するために、抗生物質アンシオマイシン（酵母菌を
排除する）およびバンコマイシン（グラム陽性菌を排除
する）を５重量％の量で加える。
前記に特定した同一成分混合物を、0.345重量％の量お
よび約0.2〜約2.0重量％の範囲で存在する前記栄養源−
指示物質とともに使用する。抗生物質は約１〜約10重量
％の範囲で存在させることができる。
追加例 水中のKlebsiellae一族の検出には主要栄養源として主
要炭素源を使用できる。Klebsiella一族の細菌は糖分子
中の炭素がＢ−Ｄ結合により結合している炭素源を代謝
できる。この種の細菌の検出組成物は主要炭素源とし
て、Ｂ−Ｄ結合を介してオルトニトロフエニル、色原体
部分に結合しているグルコース分子、および抗生物質コ
リスチンおよびナラドキシン酸を含有する。Klebsiella
一族が存在する場合には、オルトニトロフエニル−Ｂ−
Ｄ−グルコースが代謝されてオルトニトロフエニル部分
が放出される。この分子は放出されると黄色になる。従
つて、検査試料の黄色化は目標微生物、すなわちKlebsi
ellae一族の存在を示す。その他の微生物は、これらが
指示物質であるオルトニトロフエニル−Ｂ−Ｄ−グルコ
ースを代謝できないことから生育しない。その他の微生
物が生育および代謝しないので、これらの他の微生物と
の微生物的競合は生じない。
Staphylococcus aureusは混合水試料中の別のStaphyloc
occiの存在により同定でき、これはこの目標微生物がPO
4を代謝できるからである。この種の細菌の検出には、
試験培地中の代謝性指示物質として、ホスフエートに結
合したオルトニトロフエニルを使用できる。混合物を含
有する試料を培地と混和した後に、Staphylococcus aur
eusだけが培地中のこの栄養源を代謝し、黄色で見られ
る色変化を生じる指示部分を放出する。グラム陰性細菌
および酵母菌はコリスチン、ナラドキシン酸およびアン
シオマイシンの添加により検査試料からそれぞれ排除さ
れる。
窒素およびイオウはそれらの還元形で、アミノ基または
アンモニア塩（NH3）およびスルフヒドリル（SH）基と
して原則的に微生物により代謝される。炭素と同様に、
窒素およびイオウは生育に必須である。本発明は微生物
の検出および確認に、窒素またはイオウに結合した加水
分解性基質を使用する合成性試験において、炭素につい
て記載の同一原理を使用できる。
この例として、Mycobacterium fortuitumの検出があ
る。この細菌はそのイオウ源として、硫酸イオン、SO4
を要求する。栄養源−指示物質のフエノールフタレイン
−スルフエートは通常無色である。イオウ源を除いて、
生育に必要な全成分を含有する培地において、Mycobact
erium属のMycobacterium fortuitumだけがスルフエート
を利用できる。従つて、この種の細菌だけが生育し、代
謝する。その存在は放出された色原体部分フエノールフ
タレインにより生じる赤色により照明される。
栄養源−指示物質に変換できる栄養源を使用するもう一
つの例には化合物トリグリセライド−オルトニトロフエ
ニルがある。Fusobacterium属はその生育および代謝に
トリグリセライドを利用する医療上で重要な唯一のグラ
ム陰性嫌気性細菌である。Fusobacteriumを含有する試
料を全生育必須成分およびトリグリセライドの主要源と
してトリグリセライド−オルトニトロフエニルを含有す
る無酸素性培地に接種すると、Fusobacteriumだけが代
謝する。その代謝はオルトニトロフエニル部分の放出に
より生成される黄色により示される。
本発明は目標微生物だけが主要栄養源として使用できる
栄養源−指示物質を培地中の一般的栄養源の代りに選択
することにより各目標微生物、微生物種または微生物属
に対して作成できる。すなわち、本発明による培地は特
異性であつて、一般的培地ではない。
E.coliは糖アドニトールを代謝できないのに対して、Kl
ebsiella pneumoniae （K.pneumoniae）は代謝できる。
従つて、アドニトールが培地中の唯一の栄養源である場
合には、E.coliは生育、代謝および増殖しないのに対
し、K.pneumoniaeは生育、代謝および増殖する。培地は
K.pneumoniaeが代謝し、生育する主要栄養源であるアド
ニトールとともにK.pneumoniaeが要求する全ての生育因
子を用意することによりこの事実にもとづいて作成でき
る。関連細胞であるE.coliが同一培地中に存在する場合
に、E.coliは代謝せず、また生育しない。従つて、アド
ニトールに結合している色原体部分はE.coliと混合して
試料中に存在する。K.pneumoniaeの生育および代謝を検
知するための栄養源−指示物質としての役目を果たす。
本発明で使用する栄養源−指示物質は従来、主要栄養源
として使用されたことのない合成部分である。アドニト
ールの例と同様に、特定の栄養源−色原体を目標微生物
により攻撃させ、着色部分を放出させる。その他の微生
物はこれを代謝できないので、これらの微生物は生育し
ない。
検査試料はビンのような容器に入れる。本発明による培
地を試料に加え、よく混合する。試料が固体である場合
には、水希釈剤を使用できる。目標微生物または一群の
微生物が存在する場合には、本発明による培地は色を変
える（接種時点からいづれかの時点で）。培地の接種後
の操作時間または労力は不必要である。また、終了点が
明確な変色であるので、陽性の判定に対する測定者の訓
練は不必要である。
基質は糞便大腸菌類（E.coli）、総大腸菌群、Klebsiel
la-Enterobacter-Serratia族、およびStreptococcus fa
ecalisの特定の検出について利用できる。
本発明は特に、水の分析に有用である。水を分析する場
合に、必要に応じて、チオ硫酸ナトリウムまたはEDTAナ
トリウム塩を加えて、水に見い出される抗菌剤を中和す
ることができる。
本発明により水をE.coliについて分析する場合には、次
の方法に従う： 1. 水試料を採取する。予め目盛が付けられているピペ
ツトを使用して、水試料の1.0ml、0.1mlおよび0.01mlを
３本の試験管にそれぞれ加える。本発明による前記培地
を粉末形で加える（別法として、本発明による培地を試
験管内に粉末形で存在させることもできる）。
2. 試験管を20℃（70゜F）〜44℃（140゜F）でインキ
ユベートする。
3. E.coliの存在は試験管の色の変化により指示され
る。
4. 100 E.coli/ml以上のE.coliが存在する場合には、
0.01ml試験管が陽性を示す;10 E.coli/ml以上が存在す
る場合には0.1ml試験管が陽性を示す；多くて１ E.col
i/mlが存在する場合には、1ml試験管だけが陽性を示
す。
陽性試験結果は、試料1ml中に１個の微生物が存在する
場合に、重度に接種した試料を用いて接種後の短時間か
ら20時間までの間のいづれかの時点で生起しうる。試験
管に予め目盛を付けたピペツトにより水を添加するとい
う技術的操作が必要なだけである。
前記と同一の培地をE.coliの存在または不存在（Ｐ−
Ａ）試験について水の分析に使用した。
1. 水の試料100mlを本発明による前記培地を含有する
容器に加える。
2. 反応混合物が変色した場合（最高18時間）に、E.co
liが存在し、この試験は陽性である。
3. 確認試験またはその他の試験は不必要である。
本発明による方法を野外で数種のＢ−グルクロニダーゼ
およびＢ−ガラクトピラノシド基質を用いて実施した。
Ｐ−Ａ試験方式の本発明による方法の比較は慣用の膜濾
過技法で行ない、新規用具の認可に係るEPA規約に従い
評価した。試験は二種の目標微生物、E.coliおよび総大
腸菌群について行なつた。基本的方式は前記のとおりに
行なう：但し特定の目標微生物を検出するために、加水
分解性基質だけは変える。
下記の説明は迅速自動分析組成物方式に関するものであ
る。
自動分析用組成物をＢ−グルクロニダーゼおよびＢ−ガ
ラクトシダーゼに対する数種の基質を用いて作り、野外
で試験する。Ｂ−グルクロニシダーゼ基質はE.coli用で
ある;B−ガラクトシダーゼ組成物は総大腸菌群用であ
る；二種の基質は一緒に、両方の微生物を同時的に同定
できる。このＰ−Ａ試験方式による自動分析用組成物の
比較は膜濾過技法により行なつた。
二種の目標微生物、E.coliおよび総大腸菌群についての
自動分析用組成物を作る。Ｂ−グルクロニダーゼ（E.co
li）およびＢ−ガラクトシダーゼ（総大腸菌群）につい
て異なる基質を試験する。これらの基質は分子の発色
（色原体）部分が変えられている。
Ｂ−グルクロニダーゼ用基質 １） Ｂ−グルクロニダーゼ用の下記の基質をそれらの
E.coli検出能力についてそれぞれ別々に試験する： オルトニトロフエニル−グルクロニド；これは加水分解
されると黄色になる。
メチルウンビリフエロン−グルクロニドン；これは加水
分解されると、366nmで蛍光を発する。
ブロモ−クロル−インドール−グルクロニド；これは加
水分解されると、青色になる。
２） Ｂ−ガラクトシダーゼ用の下記の基質をそれらの
総大腸菌群検出能力について、それぞれ別別に試験す
る： オルトニトロフエニル−ガラクトシド；これは加水分解
されると黄色になる。
メチルウンビリフエロン−ガラクトシド；これは加水分
解されると、366nmで蛍光を発する。
３） E.coliおよび（または）総大腸菌群の存在を同時
的に検出するそれらの能力について、下記の組合せを試
験した： メチルウンビリフエロン−グルコシド＋オルトニトロフ
エニル−ガラクトピラノシド;E.coli（排泄物大腸菌
類）が存在すると、試験溶液は366nmで蛍光を発する；
総大腸菌群が存在すると、黄色になる；両種の大腸菌が
存在すると、溶液は蛍光を発し、黄色になる。
E.coli（糞便大腸菌類）を検出するためのブロモ−クロ
ル−インドール−Ｂ−グルコシド＋総大腸菌群を検出す
るためのメチルウンビリフエロン−ガラクトピラノシ
ド;E.coli（排泄物大腸菌類）が存在すると、試験溶液
は青色になる；総大腸菌群が存在すると、黄色になる；
両方が存在すると、溶液は青色になり、蛍光を発する。
被験基礎培地 １） 下記の基礎組成を使用する： 自動分析用組成物中の色原体性基質 ラウリル乳糖トリプトース ブロス中の色原体性基質。
結果 １） ラウリル乳糖トリプトース ブロス中でメチルウ
ンビリフエロン−グルクロニドを使用することによるE.
coliの存在に係る分析： 貯水池からの生の未処理水の75個の検査試料を試験す
る。膜濾過技法では、総大腸菌群について12個が、そし
て糞便大腸菌類について12個が陽性の結果を示した。指
示物質を含有するラウリル乳糖トリプトース ブロスは
６個の場合について総大腸菌群をおよび２個の場合につ
いてE.coliを検出した。平均同定時間は16.5時間であつ
た。混濁および大腸菌以外の細菌により生じたラウリル
乳糖の乳糖醗酵により、終点の決定は困難であつた。従
つて、基礎培地としてのラウリル乳糖の使用はやめ、こ
の培地はさらに検討しなかつた。
２） 被験自動分析用組成物中でオルトニトロフエニル
−ガラクトシドを使用することによるE.coli（糞便大腸
菌類）の存在の分析 貯水池からの生の未処理水の35個の検査試料を試験し
た。膜濾過法および自動分析法でそれぞれ１個の陽性結
果が得られた。平均同定時間は18時間であつた。
３） E.coli（糞便大腸菌類）用のメチルウンビリフエ
ロン−Ｂ−グルクロニド基質＋総大腸菌群用のオルトニ
トロフエニル−Ｂ−ガラクトピラノシドを同時的に評価
した。
貯水池からの生の未処理水の80個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では糞便大腸菌類について陽性結果はゼ
ロであり、総大腸菌群についての陽性結果は８であつ
た。自動分析用組成物ではE.coliの検出はゼロであり、
そして総大腸菌群の検出は８であつた。平均検出時間は
18時間であつた。
４） E.coli（糞便大腸菌）用のブロモ−クロル−イン
ドール−Ｂ−Ｄ−グルクロニド＋総大腸菌群用のメチル
ウンビリフエロン−ガラクトピラノシドを同時的に評価
した。
貯水池からの生の未処理水の10個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では総大腸菌群について１個の陽性結果
が得られた。自動分析用組成物では同一試料において総
大腸菌群について１個の陽性結果が得られた。平均同定
時間は22時間であつた。
５） 総大腸菌群用のオルトニトロフエニル−Ｂ−ガラ
クトピラノシド。
配水系からの完全水の50個の検査試料を試験した。膜濾
過技法では総大腸菌群について２個の陽性結果が得られ
た（＜2CFU/100ml）。自動分析用組成物では同じ２個に
ついて総大腸菌群が検出された、平均検出時間は17時間
であつた。
６） 総大腸菌群用のメチルウンビリフエロン−Ｂ−ガ
ラクトシド。
配水系からの完全水の20個の検査試料を試験した。膜濾
過技法および自動分析組成物の両方で、全部で一つの同
一の総大腸菌郡についての陽性結果が得られた。平均同
定時間は18時間であつた。
７） E.coli（糞便大腸菌類）用のメチルウンビリフエ
ロン−Ｂ−グルクロニド＋総大腸菌群用のブロモ−クロ
ル−インドール−Ｂ−ガラクトシドを同時的に評価し
た。
貯水湖からの生の未処理水の50個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では総大腸菌群について16個のおよびE.
coliについて２個の陽性結果が得られた。自動分析用組
成物では同一の16個に加えて２個の追加の陽性結果が総
大腸菌群について得られ、E.coliについては２個の陽性
結果が得られた。平均同定時間は18時間であつた。
本発明に従つて有用な栄養源・指示物質は次のとおりに
して生成できる： オルトニトロフエニル誘導体 Ｏ−ニトロフエニル42gをNaOH16.8g含有蒸留水420mlに
溶解して反応混合物を生成する。この溶液に、アセトン
620ml中のテトラアセチル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル ブロミドを加える。室温で５時間、反応させた後
に、溶媒を蒸発により除去する。この生成物1gを0.4Nバ
リウム メトキシド含有メタノール50ml中に懸濁する。
この反応混合物から生成する結晶はＯ−ニトロフエニル
−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。
パラニトロフエニルスルフアターゼ 次の反応を行なう：ジメチルアナリン47mlおよび二硫化
炭素50mlを混合し、４℃に冷却し、クロルスルホン酸9.
2mlを加え、次いでｐ−ニトロフエノール13.9gを加え、
混合し、次いで一夜にわたり放置する。0.4N水酸化カリ
ウム100mlを加える。明黄色結晶が混合物を80℃で、二
硫化炭素を蒸発させなから加熱することにより生成す
る。過剰のメチルアナリンを遠心分離により分離する。
基質、ｐ−ニトロフエニルをアルコールから再結晶させ
る。
本発明による特異的培地が粉末形で生成でき、種々の目
標微生物に対して特定のそのまま使用できる量で包装で
きることは容易に認識される。生成される培地は所望に
より、抗生物質を含有できる。
本発明の前記態様において、かなりの変更および修正が
本発明の要旨から逸脱することなく実施できるので、本
発明は特許請求の範囲により要求される要件以外の何者
によつても制限されるものではない。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】検査試料中の標的微生物の存在または不在
    を決定するための、検査試料と組み合わせて使用する特
    異的培地であって、 （ａ） 前記標的微生物の生育を支持するための成分； （ｂ） 前記標的微生物によって代謝されることができ
    る部分および試料変性部分を含む栄養源−指示物質であ
    って、前記試料変性部分が前記栄養源−指示物質が前記
    標的微生物によって代謝されるときにのみ放出されて前
    記検査試料の感知される特性を変化させることを特徴と
    する栄養源−指示物質；および （ｃ） 前記成分および前記栄養源−指示物質が前記標
    的微生物のみに有意な増殖的生育をもたらすように選択
    され、前記栄養源−指示物質が前記標的微生物にとって
    好ましくかつ前記検査試料中の他の生きている微生物が
    有意に代謝することができないものである； ことを特徴とする培地。
  2. 【請求項２】前記検査試料中に存在することがある競合
    性の標的外微生物が前記栄養源−指示物質を代謝できな
    いようにするのに有効量の抗生物質をさらに含有し、前
    記抗生物質が、標的微生物に対しては無効でありかつ前
    記特異的培地の成分としてまたは前記特異的培地の別の
    添加物として与えられる、特許請求の範囲第１項に記載
    の培地。
  3. 【請求項３】前記生育支持成分がビタミン類を含む、特
    許請求の範囲第１項または第２項に記載の培地。
  4. 【請求項４】前記栄養源−指示物質が、各々の標的微生
    物に依存して、前記標的微生物のための炭素、窒素、リ
    ンまたはイオウの必須源を構成する、特許請求の範囲第
    １項から第３項のいずれかに記載の培地。
  5. 【請求項５】前記栄養源−指示物質の前記試料変性部分
    が、前記栄養源−指示物質の代謝により放出されたとき
    に前記検査試料の色を変化させる色原体である、特許請
    求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の培地。
  6. 【請求項６】前記培地が水溶性の非殺菌粉末である、特
    許請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の培
    地。
  7. 【請求項７】前記培地が約10重量％から約50重量％の窒
    素含有化合物、約0.06重量％から約1.0重量％の前記標
    的微生物の生育に必須のアミノ酸、約0.09重量％から約
    0.6重量％の前記標的微生物の生育に必須のビタミン
    類、約6.4重量％から約85重量％の前記標的微生物の生
    育に必須の塩類、および約0.2重量％から約2.0重量％の
    前記栄養源−指示物質を含むことを特徴とする、非殺菌
    水溶性粉末の形態である特許請求の範囲第１項から第６
    項のいずれかに記載の培地。
  8. 【請求項８】前記栄養源−指示物質が、E. coliにより
    代謝されたときに前記検査試料の色を変化させる色原体
    を放出するＢ−グルクロニダーゼ酵素の色原体性基質を
    含むことを特徴とする、検査試料中のE. coliの存在ま
    たは不在を検出するために前記検出試料に添加するため
    の特許請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の
    培地。
  9. 【請求項９】前記Ｂ−グルクロニダーゼの色原体性基質
    が、オルトニトロフェニル−Ｂ−Ｄ−グルクロニド、Ｂ
    −ナフタルアミド−Ｂ−Ｄ−グルクロニド、アルファ−
    ナフトール−Ｂ−Ｄ−グルクロニド、メチルウンビリフ
    ェリル−Ｂ−Ｄ−グルクロニドおよびブロモ−クロロ−
    インドール−Ｂ−Ｄ−グルクロニド、およびこれらの混
    合物からなる群より選択されるグルクロニドである、特
    許請求の範囲第８項に記載の培地。
  10. 【請求項１０】グラム陽性細菌に対して選択的に有効で
    ある抗生物質を含む、特許請求の範囲第９項に記載の培
    地。
  11. 【請求項１１】前記栄養源−指示物質が、グラム陰性細
    菌により代謝されたときに前記検査試料の色を変化させ
    る色原体を放出するＬ−アラニンアミノペプチダーゼ酵
    素の色原体性基質を含み、かつ、前記検査試料中に酵母
    およびグラム陽性菌に対して有効な抗生物質が存在する
    ことを特徴とする、検査試料中のグラム陰性細菌の存在
    または不在を検出するために前記検査試料に添加するた
    めの特許請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載
    の培地。
  12. 【請求項１２】前記Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼの
    色源体性基質が、Ｌ−アラニン−Ｂ−オルトニトロフェ
    ニル、ベータ−ナフタルアミド−Ｂ−Ｌ−アラニン、ア
    ルファ−ナフトール−Ｂ−Ｌ−アラニンおよびメチルウ
    ンビリフェリル−Ｂ−Ｌ−アラニン、およびこれらの混
    合物からなる群より選択されるアラニンである、特許請
    求の範囲第11項に記載の培地。
  13. 【請求項１３】前記栄養源−指示物質が代謝可能な部分
    としてＢ−ガラクトシダーゼの基質を含むことを特徴と
    する、検査試料中の総大腸菌群の存在または不在を検出
    するために前記検査試料に添加するための特許請求の範
    囲第１項から第７項のいずれかに記載の培地。
  14. 【請求項１４】総大腸菌群により代謝可能な部分として
    Ｂ−ガラクトシダーゼの基質を含む第１栄養源−指示物
    質、および、E. coliにより代謝可能な部分としてＢ−
    グルクロニダーゼの基質を含む第２の栄養源−指示物質
    を含むことを特徴とする、検査試料中の総大腸菌群およ
    びE. coliの存在または不在を同時に検出するために前
    記検査試料に添加するための特許請求の範囲第１項から
    第７項のいずれかに記載の培地。
  15. 【請求項１５】検査試料を試験して前記検査試料中の標
    的微生物の存在または不在を決定する方法であって、 （ａ） 少なくとも１つの既知量の前記検査試料を得
    る； （ｂ） 前記検査試料に、予め定められた量の、前記検
    査試料に可溶性でありかつ、 （ｉ） 前記標的微生物の生育を支持するための成分； （ii） 前記標的微生物によって代謝されることができ
    る部分および試料変性部分を含む栄養源−指示物質であ
    って、前記試料変性部分が前記栄養源−指示物質が前記
    標的微生物によって代謝されるときにのみ放出されて前
    記検査試料の感知される特性を変化させることを特徴と
    する栄養源−指示物質；および （iii） 前記成分および前記栄養源−指示物質が前記
    標的微生物のみに有意な増殖的生育をもたらすように選
    択され、前記栄養源−指示物質が前記標的微生物にとっ
    て好ましくかつ前記検査試料中の他の生きている微生物
    が有意に代謝することができないものである； ことを特徴とする、検査試料中の標的微生物の存在また
    は不在を決定するための、検査試料と組み合わせて使用
    する特異的培地を添加する；および （ｃ） 検査試料と特異的培地との混合物を少なくとも
    約20時間あるいは前記性質が変化して前記標的微生物の
    存在または不在が実証されるまで監視する； の各工程を含む方法。
  16. 【請求項１６】前記培地を前記検査試料1.0ml、前記検
    査試料0.1ml、および前記検査試料0.01mlに添加し、前
    記検査試料と培地との各混合物を性質の変化について監
    視して、前記検査試料中の前記標的微生物の濃度を実証
    する、特許請求の範囲第15項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記検査試料−培地混合物を約20℃から
    約44.5℃の範囲の温度でインキュベートする工程をさら
    に含む、特許請求の範囲第15項または第16項に記載の方
    法。
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