JP2006081506A - 微生物の高感度迅速検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 微生物種の同定を同時に行うことが可能な、ＡＴＰ増幅方法を利用した微生物の高感度迅速検出方法を提供する。
【解決手段】 標的微生物特異的抗体を用いて標的微生物を分離・回収した後に、標的微生物のＡＴＰを増幅し、増幅されたＡＴＰを測定する。この方法により、迅速かつ高感度に微生物の検出および同定を行うことができる。
【選択図】 なし
【解決手段】 標的微生物特異的抗体を用いて標的微生物を分離・回収した後に、標的微生物のＡＴＰを増幅し、増幅されたＡＴＰを測定する。この方法により、迅速かつ高感度に微生物の検出および同定を行うことができる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、特定の微生物を高感度かつ迅速に検出する方法および当該方法の実施に用いられるキットに関するものである。
微生物の検査は、食品製造現場、医薬品製造現場、病院、プール、浴場等の環境微生物検査、食品、医薬品等への微生物の混入検査、医療現場における感染症の検査など多くの場面で必要な検査である。特に、環境衛生分野、食品衛生分野、医療分野において非常に重要な検査である。
従来、微生物検査は栄養培地を用いて生細胞を増殖させて検出する方法が行われてきたが、この方法では微生物が増殖して検出可能となるまでにある程度の日数を要するため、迅速性に問題があった。
一方、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）は、動物、植物、微生物などの全ての生物に存在するエネルギー物質であり、このＡＴＰを利用して微生物を検出する方法が検討されている。ＡＴＰを検出する方法としては、ホタルルシフェラーゼを用いる生物発光アッセイが知られている。この方法はＡＴＰを測定する方法として確立されており（非特許文献１）、迅速な衛生学的モニタリングとして用いられている（非特許文献２）。
しかし、上記従来のＡＴＰ検出方法では、１アッセイあたりの検出限界が大腸菌約１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）程度（約１０−１４ｍｏｌのＡＴＰ相当）であり、工業的な応用に十分な感度を有していなかった。
本願発明者らは、微量のＡＴＰを検出するために、ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法を開発した（特許文献１）。この方法により、従来のレベルより格段に高い感度で微生物を検出することが可能となった。また検出に要する時間も１時間程度であり、飛躍的に効率的な検出方法を実現した。
さらに、本願発明者らは、上記ＡＴＰの連鎖的増幅方法を改良し、不純物としてのＡＤＰを含まない酵素を用いることにより外因性のＡＴＰのみを増幅でき、細胞１個レベルの微生物のＡＴＰを増幅、検出可能な改良方法を開発した（非特許文献３）。
特開２００１−２９９３９０号（公開日：平成１３年１０月３０日）
DeLuca, M., and McElroy, W. D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26, 921-925 (1974).
Bautista, D. A., Vaillancourt, J. P., Clarke, R. A., Renwick, S., and Griffiths, M. W., Adenosine triphosphate bioluminescence as a method to determine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir. Poult. Sci., 73, 1673-1678 (1994).
Satoh, T., Kato, J., Takiguchu, N., Ohtake, H., and Kuroda, A., ATP Amplification for Ultrasensitive Bioluminescence Assay: Detection of a Single Bacterial Cell. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1216-1220 (2004).
上述のように、非特許文献３に開示されている本願発明者らが開発した、改良ＡＴＰ増幅方法を用いれば、１個の微生物を検出することが可能である。しかしながら、検出された微生物種の同定を同時に行うことはできないという問題点がある。
一方、従来の培養法は、数日間という時間を要するが微生物株の同定まで行う様々な方法がある。
非特許文献３に開示された微生物検出方法において、微生物種の同定も同時に行うことが可能となれば、迅速かつ高感度な微生物の同定を必要とするあらゆる分野の微生物検査に利用することができるようになり、その利用価値は格段に向上する。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来のＡＴＰ増幅方法を利用した微生物検出方法では実現されていなかった、微生物種の同定を同時に行うことが可能な、ＡＴＰ増幅方法を利用した微生物の高感度迅速検出方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、標的微生物特異的抗体を用いて、試料に含まれる微生物のうち標的微生物のみを分離した後に、従来のＡＴＰ増幅方法を利用した微生物検出方法に供することにより、微生物の検出と微生物種の同定とを同時に行うことが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明に係る標的微生物検出方法は、標的微生物の存在を迅速に検出する方法であって、試料に含まれる標的微生物を分離する分離工程と、分離した微生物中のＡＴＰを増幅するＡＴＰ増幅工程と、増幅したＡＴＰを検出する検出工程とを含有することを特徴としている。
分離工程において標的微生物を分離した後にＡＴＰ増幅工程および検出工程に移行するため、検出された微生物種が明らかとなる。また、標的微生物由来のＡＴＰを増幅した後に検出するため、分離工程において分離された標的微生物が極少数であっても検出することが可能である。
上記分離工程においては、標的微生物特異的抗体を用いることが好ましい。標的微生物特異的抗体を用いることにより、試料中に存在する標的微生物を簡便かつ迅速に分離することができる。
また、上述のように標的微生物が極少数であっても検出可能であるため、使用する抗体量は少なくてもよい。さらに、大容量の試料中に少数の標的微生物が含まれているような場合でも簡便に標的微生物を分離することができる。
上記分離工程においては、さらに上記標的微生物特異的抗体と結合可能な二次抗体を用いることが好ましい。複数種類の標的微生物特異的抗体を使用する場合でも、これらの抗体の動物種および免疫グロブリンのクラスが同じであれば１種類の二次抗体を準備すれば足りるという利点がある。
上記標的微生物特異的抗体または上記二次抗体は担体に担持されていることが好ましい。担体に担持された抗体を用いれば、抗体と結合した標的微生物の回収が容易となる。担体としては磁気ビーズを挙げることができる。磁気ビーズを用いれば、磁石により容易に標的微生物を回収することができる。
上記ＡＴＰ増幅工程においては、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼおよびアデニレートキナーゼを含むＡＴＰ増幅系を用いることが好ましい。上記ポリリン酸キナーゼおよびアデニレートキナーゼは別のタンパク質として用いてもよく、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質として用いてもよい。融合タンパク質とすれば調製が容易となり、両酵素の活性差による反応効率の低下を抑制できる。
当該ＡＴＰ増幅系を用いることにより、試料中の標的微生物が極少数であっても検出することができる。
さらに、上記ポリリン酸キナーゼまたはポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質はＡＤＰ除去処理済であることが好ましい。これにより、内因性のＡＴＰの増幅を除外して外因性のＡＴＰのみを増幅して測定することが可能となり、細胞１個レベルの微生物のＡＴＰを増幅することができる。
上記標的微生物は感染症原因微生物であることが好ましい。感染症原因微生物を迅速かつ高感度に同定する技術は未だ開発途上である。本発明に係る標的微生物検出方法は、感染症原因微生物の高感度迅速検出法として好適に利用することができる。
本発明に係る標的微生物検出キットは、上記標的微生物検出方法を実施するために用いられるキットであって、標的微生物特異的抗体を含む標的微生物分離用試薬と、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ＡＤＰ除去処理済のポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含むＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬とを包含することを特徴としている。上記構成のキットを利用することにより、上記本発明に係る標的微生物検出方法を簡便に実施することが可能となる。
本発明に係る標的微生物検出方法は、試料に含まれる標的微生物を分離する分離工程と、分離した微生物中のＡＴＰを増幅するＡＴＰ増幅工程と、増幅したＡＴＰを検出する検出工程とを含有するものである。すなわち、あらかじめ標的微生物を分離し、その後ＡＴＰ増幅方法を利用した微生物検出方法に供する方法であるため、標的微生物を細胞１個のレベルで検出することが可能である。したがって、従来のＡＴＰ増幅法による微生物の検出では実現できなかった微生物種の同定を同時に行うことができるという効果を奏する。
それゆえ、本発明は様々な微生物検出に好適に用いることができ、特に試料中の微生物数が少ないことが予想される場合においても、標的微生物を高感度に検出できるという効果を奏する。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
〔標的微生物検出方法〕
本発明に係る標的微生物検出方法は、標的微生物の存在を迅速に検出する方法であって、試料に含まれる標的微生物を分離する分離工程と、分離した微生物中のＡＴＰを増幅するＡＴＰ増幅工程と、増幅したＡＴＰを検出する検出工程とを含有するものであればよい。
本発明に係る標的微生物検出方法は、標的微生物の存在を迅速に検出する方法であって、試料に含まれる標的微生物を分離する分離工程と、分離した微生物中のＡＴＰを増幅するＡＴＰ増幅工程と、増幅したＡＴＰを検出する検出工程とを含有するものであればよい。
標的微生物とは、試料中に存在するか否かを調べようとする微生物である。標的微生物は特に限定されるものではなく、検査の目的に応じて選択すればよい。また、標的微生物は１種類のみに限るものではなく、２種類以上を標的微生物としてもよい。なお、微生物には細菌、真菌、ウイルス、寄生虫等が含まれる。
試料は、標的微生物が存在するか否かを調べようとするものであればよい。例えば、血液、体液などの生体試料、微生物の混入が問題となる食品や医薬品、衛生管理上微生物のモニターが必要なプールや浴槽などの水等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
以下、各工程について順に説明する。
（１）分離工程
分離工程において標的微生物を分離する方法は特に限定されるものではない。ただし、微生物の分離方法として一般に用いられる培養法は、標的微生物を分離できるまでにある程度の日数を要し、また、分離した微生物については様々な方法で微生物種の同定が可能であるため、本発明の分離方法には適さない。
分離工程において標的微生物を分離する方法は特に限定されるものではない。ただし、微生物の分離方法として一般に用いられる培養法は、標的微生物を分離できるまでにある程度の日数を要し、また、分離した微生物については様々な方法で微生物種の同定が可能であるため、本発明の分離方法には適さない。
培養法以外の微生物分離方法としては、例えばセルソーターを用いる方法を挙げることができる。この方法は、試料中に含まれる微生物のうち標的微生物の大きさが異なる場合等に用いることができる。
他の微生物分離方法としては、標的微生物特異的抗体を挙げることができる。この方法では上記セルソーターを用いる方法のように標的微生物の大きさが他の微生物と異なる等の条件が必要でないため、分離工程における標的微生物分離方法として好適である。
標的微生物特異的抗体は、標的微生物と特異的に結合できるものであればよく、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれでもよい。当該標的微生物特異的抗体は、標的微生物を抗原として公知の抗体作製方法により作製することができる。また、市販の抗体を用いてもよい。
また、標的微生物特異的抗体（以下、「一次抗体」と称する場合がある。）と結合可能な二次抗体を用いてもよい。例えば、一次抗体がマウスＩｇＧであれば、二次抗体を抗マウスＩｇＧ抗体とすればよい。複数の標的微生物を設定した場合、すなわち複数種類の一次抗体を使用する場合でも、一次抗体の動物種および免疫グロブリンのクラスを同一にすれば、二次抗体は一種類でよいという利点がある。
試料と標的微生物特異的抗体との反応は、試料が液体であれば試料または試料の希釈液に抗体を添加して反応させればよい。試料が固体の場合は、試料懸濁液、試料洗浄液、試料破砕物の懸濁液などに抗体を添加して反応させればよい。反応条件については特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択すればよい。なお、二次抗体の反応についても同様に行えばよい。
標的微生物と抗体との複合体を分離する方法は、特に限定されるものではない。例えば、反応液を適当な条件で遠心分離することにより、標的微生物と抗体との複合体のみを沈殿させることが可能である。また、標的微生物特異的抗体を適当な担体にあらかじめ担持（固定化）させて試料と反応させ、担体を適当な方法で回収すれば、簡便に標的微生物と抗体との複合体を回収することができる。担体としては、例えばスライドグラス等のガラス、ＥＬＩＳＡプレート等のプラスチック等を挙げることができる。
また、上記担体として、磁気ビーズを用いることができる。磁気ビーズに標的微生物特異的抗体を固定化して試料と反応させた後、磁石により標的微生物と抗体との複合体を回収することができる。磁気ビーズは抗体を担持できるものであれば特に限定されるものではなく、市販の磁気ビーズを好適に用いることができる。
なお、担体に担持させる抗体は上記二次抗体でもよい。二次抗体を担体に担持させた場合は、試料と標的微生物特異的抗体（一次抗体）の反応液を担体に担持させた二次抗体と反応させればよい。あるいは、先に標的微生物特異的抗体（一次抗体）と担体に担持させた二次抗体が結合した複合体を形成しておき、当該複合体と試料とを反応させてもよい。
また、抗体を担体に担持させた場合には、標的微生物と結合していない抗体（または、一次抗体と二次抗体の複合体）も同時に回収されることになるが、後段のＡＴＰ増幅工程に供する際には問題とならない。
〔ＡＴＰ増幅工程〕
ＡＴＰ増幅工程においては、先ず上記分離工程で分離回収された標的微生物からＡＴＰ含有試料を調製する。
ＡＴＰ増幅工程においては、先ず上記分離工程で分離回収された標的微生物からＡＴＰ含有試料を調製する。
標的微生物からのＡＴＰ含有試料の調製方法は特に限定されるものではない。例えば、細胞を溶解してＡＴＰを溶出させる方法を挙げることができる。しかしながら、細胞を溶解するのみでは、細胞中に含まれるポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」と略記する。）、アデニレートキナーゼ（以下、「ＡＤＫ」と略記する。）などの酵素の影響を考慮する必要が生じるため、細胞を溶解してＡＴＰを溶出後に加熱処理を行って酵素を失活させるか、加熱処理によりＡＴＰを溶出させる方法を用いることが好ましい。細胞溶解処理は、例えば、市販のＡＴＰアッセイキットに添付されている溶解緩衝液を用いて行うことができる。
ＡＴＰ増幅工程におけるＡＴＰ増幅反応では、本発明者らが開発したＡＴＰ増幅方法（特許文献１および非特許文献３参照）を好適に用いることができる。
当該ＡＴＰ増幅方法は、図１に示すように、ＡＴＰが存在するとＡＤＫによってＡＴＰからＡＭＰへのリン酸転移反応が起こり２分子のＡＤＰが生成する（第１反応）。この第１反応で生じた２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの作用によりポリリン酸（図中「ＰｏｌｙＰ」）からリン酸基を受け取り、２分子のＡＴＰを生じる（第２反応）。この第２反応で生じた２分子のＡＴＰは、再度第１反応に使用され、４分子のＡＤＰを生成し、この４分子のＡＤＰはＰＰＫによって４分子のＡＴＰに変換される。
このように過剰のＡＭＰとポリリン酸を存在させて、ＡＤＫとＰＰＫとの平衡状態をそれぞれＡＤＰ生成方向（第１反応）およびＡＴＰ生成方向（第２反応）に向かわせるようにし、第１反応と第２反応とを１つの反応系とし、ｎ回この反応系を繰り返すことにより、１個のＡＴＰが２ｎ個に増幅される。
したがって、ＡＴＰ増幅工程におけるＡＴＰ増幅反応は、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼおよびアデニレートキナーゼを含むＡＴＰ増幅系を用いるものであればよい。
上記ＡＤＫとＰＰＫとは別のタンパク質であるので、それぞれ別のタンパク質としてＡＴＰ増幅系に用いればよいが、ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質としてもよい。融合タンパク質とすれば、ＡＤＫとＰＰＫとを個々に用いた場合、両酵素の活性に違いがあると反応効率が低下するが、融合タンパク質とした場合にはこのような問題は生じない。また、ＡＤＫとＰＰＫとが近接するため拡散律速にならず、効率良く反応が進む。さらに、２つの酵素を同時に調製できるので、調製が容易となる。
ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質は、ＡＤＫをコードする遺伝子ａｄｋとＰＰＫをコードする遺伝子ｐｐｋとを連結した発現ベクターを公知の方法により構築し、適切な宿主細胞に導入して発現させることにより製造することができる。具体的には、例えば非特許文献３に記載されている手順で作製することができる。
上記ＰＰＫ、またはＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質はＡＤＰ除去処理を施されていることが好ましい。ＰＰＫには不純物としてＡＤＰが結合している場合がある。このＰＰＫに結合しているＡＤＰは、ポリリン酸の存在下でＰＰＫの基質とされ得、このＡＤＰがＰＰＫによりＡＴＰに変換され得る。すなわち、図１に示すような反応系において、ＡＴＰ非存在下であっても、まず第２反応であるＡＤＰからＡＴＰへの反応が生じ、このＡＴＰが第１反応で使用されることにより、自動的にＡＴＰ増幅反応が開始されることになる。
上記ＡＤＰ除去処理の方法は特に限定されるものではないが、例えばアピラーゼ処理を挙げることができる。アピラーゼはＡＴＰまたはＡＤＰからリン酸基を除去し、ＡＭＰを生成する。
ＡＴＰ増幅反応は、適切な緩衝液中で、適切な温度（例えば、３０℃〜４０℃）で行うことができる。ＡＴＰの存在が微量であると思われる場合には、反応時間を長め（例えば、１時間以上）にすればよい。
ポリリン酸化合物としては、ポリリン酸あるいはその塩を好適に用いることができる。好ましくは１０個〜１０００個、より好ましくは１０個〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものが用いられる。ポリリン酸は細菌由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成したものでもよい。
〔検出工程〕
検出工程における増幅されたＡＴＰの検出方法は特に限定されるものではなく、ＡＴＰを測定できる公知の方法から適宜選択して用いればよい。ＡＴＰ測定に用いられる最も一般的な方法として、ルシフェラーゼとＡＴＰとの反応による蛍光発光量の測定を挙げることができ、本発明の検出工程にも好適に用いることができる。蛍光発光量の測定によりＡＴＰを測定する場合には、市販のルシフェラーゼを用いるＡＴＰ測定キットを用いることができる。
検出工程における増幅されたＡＴＰの検出方法は特に限定されるものではなく、ＡＴＰを測定できる公知の方法から適宜選択して用いればよい。ＡＴＰ測定に用いられる最も一般的な方法として、ルシフェラーゼとＡＴＰとの反応による蛍光発光量の測定を挙げることができ、本発明の検出工程にも好適に用いることができる。蛍光発光量の測定によりＡＴＰを測定する場合には、市販のルシフェラーゼを用いるＡＴＰ測定キットを用いることができる。
〔標的微生物検出方法の利用〕
上述のように、本発明に係る標的微生物検出方法における標的微生物は特に限定されるものではないが、感染症原因微生物を標的微生物とすることが好適である。感染症患者の原因微生物が迅速に同定できれば、投与すべき薬剤を適切に選択でき、治療効果が向上するとともに、医療費節約にも貢献できる。
上述のように、本発明に係る標的微生物検出方法における標的微生物は特に限定されるものではないが、感染症原因微生物を標的微生物とすることが好適である。感染症患者の原因微生物が迅速に同定できれば、投与すべき薬剤を適切に選択でき、治療効果が向上するとともに、医療費節約にも貢献できる。
対象とする感染症は特に限定されるものではないが、迅速な対応ができなければ死亡する可能性が高い敗血症などは、対象感染症として好適である。敗血症の原因微生物の検査は、主として培養法が用いられており、迅速かつ高感度の検出・同定方法の開発が強く望まれている。したがって、本発明に係る標的微生物検出方法を敗血症の原因微生物の検出に適用すれば、大いに貢献できるものと考えられる。
敗血症の原因微生物としては、例えば黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、レジオネラ属菌による肺炎等のレジオネラ症が、近年問題となっている。レジオネラ症の感染源としては、給水・給湯設備、冷却塔水、循環式浴槽、加湿器、水景施設、蓄熱槽等からの感染が報告されており、感染経路は汚染水のエアロゾル吸入、汚染水の吸引、嚥下・経口感染等が考えられている。
レジオネラ属菌の検出方法は主として培養法であり、１０ＣＦＵ／１００ｍＬが検出限界である。ＰＣＲによる検出も可能であるが菌の数を特定することはできない。そこで、レジオネラ属菌の高感度検出方法の開発が強く望まれている。
したがって、本発明に係る標的微生物検出方法をレジオネラ属菌の検出に適用すれば、大いに貢献できるものと考えられる。
さらに、本発明に係る標的微生物検出方法は、大容量の試料中に少量の標的微生物が含まれている場合に好適に用いることができる。従来のＡＴＰ測定方法の感度では、測定可能な感度を得るためにはある程度の細胞数が必要であるため、例えば本発明と同様に抗体を用いて標的微生物を分離・回収しようとすれば大量の試料が必要であり、それに伴い使用する抗体の量も膨大となる。しかし本発明では１個の細胞からでもＡＴＰを検出可能なレベルまで増幅することができるため、試料量および抗体量は少量でよい。
したがって、本発明に係る標的微生物検出方法は、例えばプールや海水浴場等の微生物モニター等にも好適に利用できると考えられる。
食品中の病原微生物（食中毒原因菌）の検出にＡＴＰ法を用いる場合、食品中にＡＴＰが含まれるため標的微生物のみを検出することは困難である。また、通常用いられる培養法は検出までに時間を要するため、予防衛生的な見地からは有効といえない。これに対して本発明に係る標的微生物検出方法は、標的微生物を選択的に迅速検出することができるので、食品衛生管理のモニター試験として好適に利用できると考えられる。例えば、ミルク中の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の検出や、固形食品中の病原微生物の検出に有効であると考えられる。
〔標的微生物検出キット〕
本発明に係る微生物検出キットは、上記本発明に係る標的微生物検出方法を実施するために用いられるものであって、標的微生物特異的抗体を含む標的微生物分離用試薬と、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ＡＤＰ除去処理済のポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含むＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬とを包含するものであればよい。
本発明に係る微生物検出キットは、上記本発明に係る標的微生物検出方法を実施するために用いられるものであって、標的微生物特異的抗体を含む標的微生物分離用試薬と、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ＡＤＰ除去処理済のポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含むＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬とを包含するものであればよい。
標的微生物分離試薬としては、上記標的微生物特異的抗体以外に、例えば当該標的微生物特異的抗体と結合可能な二次抗体、磁気ビーズと結合した抗体を用いる場合には磁気ビーズを回収するための磁石等、適宜必要な試薬や器具をキットの構成とすればよい。
また、標的微生物特異的抗体は目的に応じて複数種類の抗体としてもよい。複数種類の標的微生物特異的抗体を含むキットとする場合には、動物種および免疫グロブリンのクラスを同一とし、１種類の二次抗体を含む構成とすれば標的微生物の回収が容易となる。また、キットの使用者は、キットの対象外の微生物を標的としたい場合にも、二次抗体が結合可能な一次抗体を自分で準備すれば当該キットを使用できることになり、利用価値が高くなる。さらに、抗体を固定化したプレートを含むキットとすれば多検体を同時に検出することが可能となる。
また、上記ＡＴＰ増幅試薬に微生物からＡＴＰ含有試料を調製するために試薬（例えば、細胞溶解液等）を含む構成としてもよい。
ＡＴＰ検出試薬としては、例えばルシフェラーゼなどを挙げることができる。
具体的には、例えばレジオネラ検出キットとする場合には、標的微生物特異的抗体をレジオネラ特異的抗体とし、ＡＴＰ増幅試薬およびＡＴＰ検出試薬からなるキットとして実施することができる。
また、敗血症原因菌の検出キットとする場合には、複数の標的微生物（例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌、カンジダ等）特異的抗体および二次抗体を含む標的微生物分離用試薬、ＡＴＰ増幅試薬およびＡＴＰ検出試薬からなるキットとして実施することができる。
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実験材料〕
(1)使用細菌
標的微生物として黄色ブドウ球菌ＪＣＭ２１５１株（Staphylococcus aureus JCM2151、理化学研究所微生物系統保存施設より分与、以下「S. aureus」と記載する。）を用い、対照として大腸菌ＢＬ２１株（Eschrichia coli BL21、Novagen社より購入、以下「E. coli」と記載する。）を用いた。
(1)使用細菌
標的微生物として黄色ブドウ球菌ＪＣＭ２１５１株（Staphylococcus aureus JCM2151、理化学研究所微生物系統保存施設より分与、以下「S. aureus」と記載する。）を用い、対照として大腸菌ＢＬ２１株（Eschrichia coli BL21、Novagen社より購入、以下「E. coli」と記載する。）を用いた。
黄色ブドウ球菌は食中毒、化膿性疾患、敗血症等の原因菌として知られている。抗生物質耐性の黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、院内感染において問題となっている。黄色ブドウ球菌はエンテロトキシンという毒素を産生し、当該毒素を食品とともに食べることで食中毒が発生する。
大腸菌ＢＬ２１株は、菌体内プロテアーゼの失活株であり、タンパク質の発現用に広く用いられている菌株である。なお、S. aureusおよびE. coliは２×ＹＴ培地（１ＬあたりPepton:16g、Yeast Extract:10g、NaCl:5g）に接種し、37℃で一夜、振盪しながら培養したものを用いた。
(2)一次抗体
Staphylococcus aureus Monoclonal Antibodies（Cat. No. 15703、フナコシ）を購入し、使用した。
Staphylococcus aureus Monoclonal Antibodies（Cat. No. 15703、フナコシ）を購入し、使用した。
(3)二次抗体（免疫磁気ビーズ、以下単に「ビーズ」と称する場合がある。）
Dynabeads M-280 Anti-Mouse IgG（DYNAL社製）を用いた。この製品は、表面にアフィニティー精製したマウスIgGに対するヒツジポリクローナル抗体（Fcと反応）を結合した磁気ビーズであり、ビーズの濃度は6.7×108beads/mL（10mg/mL）である。
Dynabeads M-280 Anti-Mouse IgG（DYNAL社製）を用いた。この製品は、表面にアフィニティー精製したマウスIgGに対するヒツジポリクローナル抗体（Fcと反応）を結合した磁気ビーズであり、ビーズの濃度は6.7×108beads/mL（10mg/mL）である。
〔S. aureus の分離〕
上記免疫磁気ビーズを二次抗体として用いて、標的のS. aureus を分離する方法としては、先に一次抗体と標的微生物（S. aureus ）とを反応させた後に、二次抗体（免疫磁気ビーズ）と一次抗体とを反応させる方法（以下、「直接法」と称する。）と、先に一次抗体と二次抗体（免疫磁気ビーズ）とを反応させた後に、当該複合体と標的微生物（S. aureus ）と標的微生物（S. aureus ）とを反応させる方法（以下、「間接法」と称する。）との２種類があり、いずれを用いてもS. aureus を分離することが可能である。以下にそれぞれの手順を示すが、この手順は本実施例において実際に用いた手順を示すものであり、これに限定されるものではない。なお、本実施例ではS. aureus およびE. coli の培養液について、それぞれ独立に、上記S. aureus 特異的モノクローナル抗体を用いて実験を行った。
上記免疫磁気ビーズを二次抗体として用いて、標的のS. aureus を分離する方法としては、先に一次抗体と標的微生物（S. aureus ）とを反応させた後に、二次抗体（免疫磁気ビーズ）と一次抗体とを反応させる方法（以下、「直接法」と称する。）と、先に一次抗体と二次抗体（免疫磁気ビーズ）とを反応させた後に、当該複合体と標的微生物（S. aureus ）と標的微生物（S. aureus ）とを反応させる方法（以下、「間接法」と称する。）との２種類があり、いずれを用いてもS. aureus を分離することが可能である。以下にそれぞれの手順を示すが、この手順は本実施例において実際に用いた手順を示すものであり、これに限定されるものではない。なお、本実施例ではS. aureus およびE. coli の培養液について、それぞれ独立に、上記S. aureus 特異的モノクローナル抗体を用いて実験を行った。
Ａ．直接法
(1)ビーズの前洗浄
1. １．５ｍＬチューブにＰＢＳ（NaH2PO4・H2O：0.16g、Na2HPO4・12H20：1.98g、NaCl：8.10g／L）１ｍＬを分注する。
2. 上記１にビーズ５０μＬを分注する。
3. 上記２をＭＰＣ（磁性粒子収集装置、DYNAL社製）にセットし、１分間静置する。
4. 上清を除去する。
5. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
6. ３〜５を３回繰り返す。
7. 上清除去後、ＰＢＳを５０μＬ加える。
(1)ビーズの前洗浄
1. １．５ｍＬチューブにＰＢＳ（NaH2PO4・H2O：0.16g、Na2HPO4・12H20：1.98g、NaCl：8.10g／L）１ｍＬを分注する。
2. 上記１にビーズ５０μＬを分注する。
3. 上記２をＭＰＣ（磁性粒子収集装置、DYNAL社製）にセットし、１分間静置する。
4. 上清を除去する。
5. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
6. ３〜５を３回繰り返す。
7. 上清除去後、ＰＢＳを５０μＬ加える。
(2)一次反応（一次抗体と標的微生物との反応）
8. １．５ｍＬチューブに一次抗体（1mg/mL）１０μＬを分注する。
9. 上記８に菌培養液１ｍＬを分注する。
10. 上記９をＭＰＣおよびサンプルミキサー（DYNAL社製）にセットする。
11. ３７℃で１時間反応させる。
8. １．５ｍＬチューブに一次抗体（1mg/mL）１０μＬを分注する。
9. 上記８に菌培養液１ｍＬを分注する。
10. 上記９をＭＰＣおよびサンプルミキサー（DYNAL社製）にセットする。
11. ３７℃で１時間反応させる。
(3)二次反応（一次抗体／標的微生物複合体との反応）
12. 一次反応後の反応液に上記７の洗浄済ビーズを添加する。
13. 上記１２をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
14. ３７℃で１時間反応させる。
12. 一次反応後の反応液に上記７の洗浄済ビーズを添加する。
13. 上記１２をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
14. ３７℃で１時間反応させる。
(4)分離・洗浄
15. 二次反応後の反応液をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
16. ３分間静置する。
17. 上清を除去する。
18. チューブをＭＰＣおよびサンプルミキサーから取り出し、ＰＢＳを1mL加える。
19. 上記１８をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
20. 上清を除去する。
21. １８〜２０を５回繰り返す。
22. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
15. 二次反応後の反応液をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
16. ３分間静置する。
17. 上清を除去する。
18. チューブをＭＰＣおよびサンプルミキサーから取り出し、ＰＢＳを1mL加える。
19. 上記１８をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
20. 上清を除去する。
21. １８〜２０を５回繰り返す。
22. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
(4)分離菌の培養
23. 上記２２から１０μＬを採り、分離平板培地（ＬＢプレート：１ＬあたりPepton:10g、Yeast Extract:10g、NaCl:5g、agar:15g）に塗布する。
24. ３７℃で一夜培養し、コロニー数を数える。
23. 上記２２から１０μＬを採り、分離平板培地（ＬＢプレート：１ＬあたりPepton:10g、Yeast Extract:10g、NaCl:5g、agar:15g）に塗布する。
24. ３７℃で一夜培養し、コロニー数を数える。
Ｂ．間接法
(1)ビーズの前洗浄
1. １．５ｍＬチューブにＰＢＳを１ｍＬ分注する。
2. 上記１にビーズ５０μＬを分注する。
3. 上記２をＭＰＣにセットし、１分間静置する。
4. 上清を除去する。
5. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
6. ３〜５を３回繰り返す。
7. 上清除去後、ＰＢＳを５０μＬ加える。
(1)ビーズの前洗浄
1. １．５ｍＬチューブにＰＢＳを１ｍＬ分注する。
2. 上記１にビーズ５０μＬを分注する。
3. 上記２をＭＰＣにセットし、１分間静置する。
4. 上清を除去する。
5. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
6. ３〜５を３回繰り返す。
7. 上清除去後、ＰＢＳを５０μＬ加える。
(2)一次反応（一次抗体と二次抗体との反応）
8. 上記７に一次抗体（1mg/mL）１μＬ、５μＬまたは１０μＬを添加する。
9. サンプルミキサーにセットする。
10. ２〜８℃で３０分間反応させる。
11. ＭＰＣにセットする。
12. 上清を除去し、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡを１ｍＬ加えて懸濁する。
13. １１〜１２を３〜４回繰り返す。
14. 洗浄後、０.０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡを１ｍＬ加えて懸濁する（この状態で、４℃で２週間以上保存可能である。）。
8. 上記７に一次抗体（1mg/mL）１μＬ、５μＬまたは１０μＬを添加する。
9. サンプルミキサーにセットする。
10. ２〜８℃で３０分間反応させる。
11. ＭＰＣにセットする。
12. 上清を除去し、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡを１ｍＬ加えて懸濁する。
13. １１〜１２を３〜４回繰り返す。
14. 洗浄後、０.０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡを１ｍＬ加えて懸濁する（この状態で、４℃で２週間以上保存可能である。）。
(3)二次反応（一次抗体／二次抗体複合体と標的微生物との反応）
15. １．５ｍＬチューブにＰＢＳで１万倍に希釈した菌液を１ｍＬ分注する。
16. 上記１５に、上記１４の懸濁液１０μＬ添加する。
17. サンプルミキサーにセットする。
18. ４℃で３０分間反応させる。
15. １．５ｍＬチューブにＰＢＳで１万倍に希釈した菌液を１ｍＬ分注する。
16. 上記１５に、上記１４の懸濁液１０μＬ添加する。
17. サンプルミキサーにセットする。
18. ４℃で３０分間反応させる。
(4)分離・洗浄
19. 二次反応後の反応液をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
20. ３分間静置する。
21. 上清を除去する。
22. チューブをＭＰＣおよびサンプルミキサーから取り出し、ＰＢＳを１ｍＬ加える。
23. 上記１８をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
24. 上清を除去する。
25. ２２〜２４を３回繰り返す。
26. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
19. 二次反応後の反応液をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
20. ３分間静置する。
21. 上清を除去する。
22. チューブをＭＰＣおよびサンプルミキサーから取り出し、ＰＢＳを１ｍＬ加える。
23. 上記１８をＭＰＣおよびサンプルミキサーにセットする。
24. 上清を除去する。
25. ２２〜２４を３回繰り返す。
26. ＰＢＳを１ｍＬ加える。
(4)分離菌の培養
27. 上記２６から１０μＬを採り、分離平板培地（ＬＢプレート）に塗布する。
28. ３７℃で一夜培養し、コロニー数を数える。
27. 上記２６から１０μＬを採り、分離平板培地（ＬＢプレート）に塗布する。
28. ３７℃で一夜培養し、コロニー数を数える。
〔ＡＴＰ増幅法による菌の検出〕
上記直接法２２の洗浄済み複合体懸濁液または間接法２６の洗浄済み複合体懸濁液を１００℃で２分間処理して菌抽出液を調製し、この２μＬをＡＴＰ増幅反応に供した。S. aureus 抽出液および E. coli抽出液以外に、標準ＡＴＰ（シグマ）３.３ｆｍｏｌを添加した陽性対照およびＡＴＰ無添加の陰性対照を設けた。
上記直接法２２の洗浄済み複合体懸濁液または間接法２６の洗浄済み複合体懸濁液を１００℃で２分間処理して菌抽出液を調製し、この２μＬをＡＴＰ増幅反応に供した。S. aureus 抽出液および E. coli抽出液以外に、標準ＡＴＰ（シグマ）３.３ｆｍｏｌを添加した陽性対照およびＡＴＰ無添加の陰性対照を設けた。
ポリリン酸キナーゼ・アデニレートキナーゼ融合タンパク質：０．１μｇ、ＡＭＰ（シグマ）：３２μＭ、ポリリン酸（平均鎖長６５、シグマ）：８００μＭ、ＭｇＣｌ２：８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 7.4）：６０ｍＭを含む混合液４８μＬに、上記ＡＴＰサンプル２μＬを添加して、ＡＴＰを増幅した。なお、ポリリン酸キナーゼ・アデニレートキナーゼ融合タンパク質は非特許文献３の記載にしたがって作製した。
経時的（０分、５分、１５分、３０分および６０分）に５μＬの反応液を採取し、４０μＬのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬（ロシュ）と混合し、直ちに蛍光光度計を用いて蛍光を測定した。
〔結果〕
表１に間接法による菌の回収率を示した。表中、「Mono ab」はビーズ５０μＬあたりの一次抗体の量を示し、「Culture」は前培養後の培養液を１万倍希釈した菌懸濁液１０μＬ中の生菌数を示し、「IMB」は１万倍希釈した菌懸濁液から抗体を用いて回収した生菌数を示す。「Binding efficiency」は上記「IMB」／「Culture」により算出された数値である。
表１に間接法による菌の回収率を示した。表中、「Mono ab」はビーズ５０μＬあたりの一次抗体の量を示し、「Culture」は前培養後の培養液を１万倍希釈した菌懸濁液１０μＬ中の生菌数を示し、「IMB」は１万倍希釈した菌懸濁液から抗体を用いて回収した生菌数を示す。「Binding efficiency」は上記「IMB」／「Culture」により算出された数値である。
表１から明らかなように、用いた一次抗体（Staphylococcus aureus Monoclonal Antibodies（Cat. No. 15703、フナコシ））は、S. aureusのみに結合し、E. coliには結合しなかった。また、磁気ビーズに結合した二次抗体を用いることにより、培養液中の約３０％のS. aureusを回収することができた。なお、一次抗体量が増加した場合に回収率が減少したのは、二次抗体と比較して一次抗体が過剰になったことに起因するものと考えられた。
また、データを示していないが、直接法を用いた場合も同様の結果が得られた。
ＡＴＰ増幅法による菌の検出結果を図２に示した。図２から明らかなように、陽性対照（標準ＡＴＰ溶液）およびS. aureus抽出液では発光量が増加したが、E. coli抽出液および陰性対照では発光量が増加しなかった。すなわち、この結果は、上記一次抗体により、S. aureusは回収されたが、E. coliは回収されなかったことを示すものである。なお、図１に示したS. aureusの発光量は、１０ｃｆｕ／５μＬに相当する。
本発明は、微生物の検査が必要な様々な分野において利用可能である。特に、食品産業、医薬品産業、臨床検査分野、環境衛生分野などでの利用に好適であり、迅速、簡便かつ高感度な微生物検査を提供することができる。
Claims (10)
- 標的微生物の存在を迅速に検出する方法であって、
試料に含まれる標的微生物を分離する分離工程と、
分離した微生物中のＡＴＰを増幅するＡＴＰ増幅工程と、
増幅したＡＴＰを検出する検出工程とを含有することを特徴とする標的微生物検出方法。 - 上記分離工程において、標的微生物特異的抗体を用いることを特徴とする請求項１に記載の標的微生物検出方法。
- 上記分離工程において、さらに標的微生物特異的抗体と結合可能な二次抗体を用いることを特徴とする請求項２に記載の標的微生物検出方法。
- 上記標的微生物特異的抗体または上記二次抗体が担体に担持されていることを特徴とする請求項２または３に記載の標的微生物検出方法。
- 上記担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項４に記載の標的微生物検出方法。
- 上記ＡＴＰ増幅工程において、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼおよびアデニレートキナーゼを含むＡＴＰ増幅系を用いることを特徴とする請求項１ないし５に記載の標的微生物検出方法。
- 上記ＡＴＰ増幅工程において、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含むＡＴＰ増幅系を用いることを特徴とする請求項１ないし５に記載の標的微生物検出方法。
- 上記ポリリン酸キナーゼまたはポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質はＡＤＰ除去処理済であることを特徴とする請求項６または７に記載の標的微生物検出方法。
- 上記標的微生物が感染症原因微生物であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の標的微生物検出方法。
- 請求項１ないし９のいずれか１項に記載の標的微生物検出方法を実施するために用いられるキットであって、
標的微生物特異的抗体を含む標的微生物分離用試薬と、
ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、ＡＤＰ除去処理済のポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含むＡＴＰ増幅試薬と、
ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬とを包含することを特徴とする標的微生物検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004272089A JP2006081506A (ja) | 2004-09-17 | 2004-09-17 | 微生物の高感度迅速検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006081506A true JP2006081506A (ja) | 2006-03-30 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2006081506A (ja) |
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| JPWO2021241446A1 (ja) * | 2020-05-25 | 2021-12-02 | ||
| WO2022239867A1 (ja) | 2021-05-14 | 2022-11-17 | 株式会社堀場アドバンスドテクノ | 微生物検出装置及び微生物検出方法 |
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2004
- 2004-09-17 JP JP2004272089A patent/JP2006081506A/ja active Pending
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| WO2022239867A1 (ja) | 2021-05-14 | 2022-11-17 | 株式会社堀場アドバンスドテクノ | 微生物検出装置及び微生物検出方法 |
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