JP2003180395A - 微生物の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】濾過膜上に捕捉された微生物の迅速、簡便かつ
高感度な検出を、安価な装置を用いて行う方法を提供す
ること。 【解決手段】１．以下の工程を含む、濾過膜上の微生物
の検出法。 （１）濾過膜上に捕捉した微生物または該微生物の抽出
物と、生物発光試薬とを接触させて、濾過膜上に生物発
光を生じさせる第1工程 （２）濾過膜上の生物発光を、写真フィルムに感光させ
る第2工程 ２．第2工程が、発光を生じている濾過膜と、写真フィ
ルムとを直接または透光性の素材を介して密着させる方
法である、上記１．記載の検出方法。 ３．生物発光試薬が、ルシフェラーゼ、ルシフェリンお
よびマグネシウムイオンを含む、上記１．または２．記
載の検出法。 ４．写真フィルムがインスタントフィルムである、上記
１．２．記載の検出法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、濾過膜上に捕捉し
た微生物の、簡便且つ高感度な検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品、飲料、飲料水、製薬、化粧品、半
導体工業、電子工業などの分野では使用する水、原料、
中間体或いは製品等の中に存在する微生物の生菌数の管
理が重要である。

【０００３】従来、微生物の測定には、検体中に存在す
る生菌を寒天平板培地上で、培養しコロニーを形成させ
て検出する方法が用いられている。しかしながらこの方
法は煩雑であり、結果が得られるまで長い時間を要す
る。微生物の有無の判定あるいは微生物数の検査結果が
得られるまでは出荷や製造ができないために時間的や金
銭的な損失や、在庫に伴う空間的、金銭的な損失が大き
かった。よって、簡便迅速な方法の開発が求められてい
た。

【０００４】このため、微生物の迅速検出方法に関する
種々の提案がなされている。例えば、検体液中の生菌数
が充分に多い場合は、少量を小試験管に採取した後、ま
た、生菌数がやや少ない場合は、検体液を濾過膜で濾過
して微生物を捕捉し、該濾過膜を極少量の無菌水等に浸
漬して微生物を懸濁した液の一部を小試験管に採取した
後、バイオミルネッセンス法により測定する方法が知ら
れている（特開平2-57197号、特開平2-163098号等、春
田三佐夫他「食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速
化」第58頁、サイエンスフォーラム（1985）日本）。

【０００５】しかしながら、これらの方法は、生菌数が
少ない検体液の場合（例えば10³〜10⁴個/ml以下）ではA
TP量がルミノメーターの測定限界以下のため検出が極め
て困難である。

【０００６】特許第3133328号には、多数の疎水性区画
壁で実質的に囲まれた多数の小さな親水性濾過膜区画か
らなる濾過膜要素によって検体液を濾過し、該検体液中
に含まれている生菌を前記区画内に捕捉した後、乾燥、
前記生菌の菌体成分を抽出する抽出試薬及び前記抽出さ
れた菌体成分を発光させる発光試薬をスプレーして捕捉
された前記生菌の前記菌体成分を該区画内で抽出・発光
せしめ、次いで生物発光画像解析システムを用いてその
輝点を表示、計数することを特徴とする検体液中の前記
生菌数を測定する生菌数測定法が開示されている。

【０００７】ここで用いられている生物発光画像解析シ
ステム装置とは、例えば、浜松ホトニクス（株）製ARGU
S-50/CL(商品名)のテーパーファイバー入力式のもので
ある。この装置は、従来の測定装置に比べ、微弱な発光
であっても高感度に検知し且つ光を著しく強めて処理す
ることができ、しかもデータの処理及び解析も早く簡便
であり、さらに本発明の特殊な濾過膜及び試薬の噴霧器
を用いるスプレー効果とが相乗して、一個の生菌細胞を
も検出できる新規で画期的なものである。

【０００８】しかしながら、この装置はテーパーファイ
バー、光増幅部および撮像管からなる超高感度テレビカ
メラ、カメラコントローラー、イメージプロセッサー、
データ解析装置、テレビモニター等からなり、一式1000
万円以上もするという問題点を有する。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、濾過
膜上に捕捉された微生物の迅速、簡便かつ高感度な検出
を、安価な装置を用いて行う方法を提供することにあ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、濾過膜上に捕捉された微生物から生じる生物発
光を検出する方法として、写真フィルム、特に高感度な
インスタントフィルムを用いると、高価な生物発光画像
解析システム装置を使用することなく、同様の結果が簡
便迅速に得られることを見出し、この発明を完成させ
た。すなはち本発明は、以下の方法に関する。

【００１１】１．以下の工程を含む、濾過膜上の微生物
の検出法。 （１）濾過膜上に捕捉した微生物または該微生物の抽出
物と、生物発光試薬とを接触させて、濾過膜上に生物発
光を生じさせる第1工程 （２）濾過膜上の生物発光を、写真フィルムに感光させ
る第2工程 ２．第2工程が、発光を生じている濾過膜と、写真フィ
ルムとを直接または透光性の素材を介して密着させる方
法である、上記１．記載の検出方法。 ３．生物発光試薬が、ルシフェラーゼ、ルシフェリンお
よびマグネシウムイオンを含む、上記１．または２．記
載の検出法。 ４．写真フィルムがインスタントフィルムである、上記
１．２．記載の検出法。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、（１）濾過膜上に捕捉
した微生物または該微生物の抽出物と、生物発光試薬と
を接触させて、濾過膜上に生物発光を生じさせる第1工
程と、（２）濾過膜上の生物発光を、写真フィルムに感
光させる第2工程を含む、濾過膜上の微生物の検出法で
ある。

【００１３】[第1工程]第1工程では、濾過膜上に捕捉し
た微生物または該微生物の抽出物と、生物発光試薬とを
接触させて、濾過膜上に生物発光を生じさせる。微生物
とは、酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻
類、ウイルス、原生動物、動物又は植物の分化していな
い細胞及び組織培養物等をいう。

【００１４】濾過膜とは、微生物を捕捉できるものであ
れば特に限定されず、例えば、市販の親水性又は疎水性
の濾過膜が挙げられる。親水性濾過膜としては、例え
ば、親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリビ
ニリデンジフルオライド、親水性ポリスルフォン、親水
性ポリカーボネート、親水性ポリアミド、親水性ポリエ
チレン、親水性ポリプロピレン等の親水性のプラスチッ
ク系材料、又はアセチルセルローズ若しくはニトロセル
ローズ等の材料を用いて製造されたフィルム状若しくは
シート状のものが使用される。

【００１５】また、疎水性濾過膜としては、例えばPVDF
（ポリビニリデンジフルオライド）、PTFE（ポリトラフ
ルオロエチレン）、PE（ポリエチレン）等、あるいは、
疎水性の比較的大きい親水性濾過膜、例えばPC（ポリカ
ーボネート）、PP（ポリプロピレン）、PA（ポリアミ
ド）、PS（ポリスルフォン）等を使用することができ
る。

【００１６】また、日本ミリポア社製のRMD特殊メンブ
レンフィルター（疎水性格子入りPVDF膜）やポリカーボ
ネート膜は好ましい。また、QA LABOLATORIES社製（グ
ンゼ産業社販売）のISO-Gridシステム用のHGMF（Hydrop
hobic Grid Membrane Filter）（疎水性格子膜メン
ブランフィルター）も好ましい。

【００１７】微生物を濾過膜上に捕捉する手段は特に限
定されない。例えば、微生物を含むことが疑われる試料
液を、濾過膜を用いて濾過する。また、微生物を含むこ
とが疑われる試料液を濾過膜にスポット（滴下）しても
良い。また、濾過性の悪いサンプルの場合などは寒天培
地上で短時間培養したものを濾過膜にうつし取ってもよ
い。また、培地の阻害が大きい場合などは、濾過膜上で
短時間培養したものを別の濾過膜にうつし取ってもよ
い。試料液は、特に限定されないが、例えば、飲料（ビ
ール、ワイン、ジュース、ミネラル水）、食品（肉、
魚、野菜）、工業製品（医薬品、化粧品等若しくはその
半製品、又はこれらの原料）、海水、河川水、工業用
水、製薬用水、下水、土壌、体液（尿、糞便、血液、喀
痰、膿汁）を由来とする液体が挙げられる。

【００１８】また、上記の試料液を適当な溶媒（例え
ば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料液
としてもよい。試料液が固形分を含む場合には、該試料
液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン
酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等）に懸濁する
か、ミキサーなどでホモジナイズして溶液状にしたもの
を試料液として使用することもできる。

【００１９】試料液の濾過法としては、例えば、カップ
状濾過容器（例えば、日本ミリポア社製ミリフレックス
フィルターユニット、ステリフィル）などに、洗浄後の
濾過膜を装着して、試料液を吸引濾過し、微生物を濾過
膜上に捕捉する方法が採用される。濾過終了後は濾過器
から濾過膜を取り外し、必要により濾過膜の洗浄、風乾
を行う。微生物が、動物細胞、プロトプラスト等である
場合、細胞の破壊を防ぐため、濾過膜の洗浄には生理食
塩水等の等張液を使用することが望ましい。

【００２０】次いで、微生物または該微生物の抽出物
と、生物発光試薬とを接触させる。この操作により、微
生物の生体成分と生物発光試薬とが反応して生物発光が
生じる。十分な発光量を得るため、すなわち微生物の検
出効率の向上のため、適当な抽出剤を用いて微生物の生
体成分を抽出することが好ましい。

【００２１】生体成分とは、微生物に含まれ、生物発光
試薬と接触することにより生物発光を生じる成分のこと
である。生体成分としては、例えば、アデノシンリン酸
エステル類（ATP、AMP、ADP、サイクリックAMP、RNA
等）、PPDK、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、
ルシフェリン、ルシフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、又はサイクリック
3',5'-ヌクレオチドホスホジエステラーゼ等が挙げられ
る。その他、上記生体成分の生成に関与する物質も、本
発明でいう生体成分に含まれる。以下、主としてATPが
生体成分である場合について、本発明を説明する。

【００２２】本発明でいう生物発光試薬は、生物発光反
応に関与する物質を含む試薬であれば特に限定されな
い。微生物由来のATPと反応して発光する生物発光試薬
しては、例えば、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反
応に関与する物質を含む試薬があり、具体的には、例え
ば、次の（イ）〜（ハ）の物質を含む試薬である。 （イ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン （ロ）ルシフェリン （ハ）ルシフェラーゼ

【００２３】本発明において、ルシフェリンおよびルシ
フェラーゼとしては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘ
イケボタル、北米産ホタル、ヒカリコメツキムシ、ツチ
ボタル等）を由来とするものが使用できる。ルシフェラ
ーゼは、上記生物の発光組織から精製した天然型ルシフ
ェラーゼ、遺伝子工学的手法により調製した天然型ルシ
フェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼのアミノ酸
配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等
の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使用すること
ができる。マグネシウムイオン、ルシフェリンおよびル
シフェラーゼを含む生物発光試薬としては、市販品、例
えばキッコーマン社製の「ルシフェールHS」や「ルシフ
ェール250」が使用できる。上記の生物発光試薬には、
アデノシンリン酸エステル類をATPに変換する反応（ATP
変換反応）に関与する試薬、例えばPyruvate orthophos
phate dikinase(PPDK)を添加してもよい。ATP変換反応
試薬については後述するが、これの使用により、安定し
た高い生物発光量が得られるので、検出感度の向上が可
能となる。

【００２４】なお、微生物と生物発光試薬とを接触させ
る前に、短時間培養をして1輝点あたりの微生物を増加
させ、1輝点あたりのATP量を増やすことにより高感度に
微生物が検出できる。細菌用の培地としては、標準寒天
培地、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地、
ブレインハートインフュージョン培地、普通ブイヨン培
地、MRS培地、R2A寒天培地などがあげられる。また、真
菌用としては、サブロー寒天培地、ポテトデキストロー
ス寒天培地、ブドウ糖ペプトン培地などがあげられる。
寒天培地の場合はこれに微生物を捕捉した濾過膜をのせ
て培養する。液体培地の場合は、これを適当なパッドに
吸収させたものに、微生物を捕捉した濾過膜をのせて培
養しても良い。

【００２５】微生物を捕捉した濾過膜は、ATP分解酵素
を含む試薬（以下「ATP消去剤」という）と接触させ、
微生物菌体に含まれるATP以外のATP（以下「バックグラ
ンドATP」という）を分解しておくことが望ましい。濾
過膜をATP消去剤で処理することにより、生物発光反応
におけるバックグランド発光が低下し、微生物の測定感
度が向上する。

【００２６】ATP消去剤としては、例えば、アデノシン
リン酸デアミナーゼ溶液、アデノシンリン酸デアミナー
ゼとその他の酵素（例えば、アピラーゼ、アルカリホス
ファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、ア
デノシントリホスファターゼ）との混合溶液等が使用で
きる。ATP消去剤中のアデノシンリン酸デアミナーゼの
終濃度としては、0.001U/ml以上、好ましくは0.01〜10U
/mlが適当である。濾過膜とATP消去剤を接触させる場
合、ATP消去剤を濾過膜上に滴下又は噴霧するか、ATP消
去剤に濾過膜を浸漬すればよい。

【００２７】バックグランドATPを消去した後は、濾過
膜上のATP消去剤を除去又は失活させることが望まし
い。ATP消去剤の除去は、濾過膜をATP消去済みの超純水
又は緩衝液で洗浄することにより実施される。また、AT
P消去剤は、該消去剤に対する阻害剤を作用させること
により失活させることができる。

【００２８】ATP消去剤がアデノシンリン酸デアミナー
ゼ溶液である場合、該消去剤の阻害剤としては、例え
ば、コホルマイシンが使用できる。コホルマイシンは該
酵素の阻害剤として知られている（THE JOURNAL OF ANT
IBIOTICS,SER.A Vol20 No.4 227-231）。ATP消去剤の阻
害剤を作用させる場合は、該阻害剤を濾過膜上に滴下又
は噴霧すればよい。また、次に述べる抽出剤にコホルマ
イシンを溶解して、抽出剤と同時に作用させてもよい。

【００２９】また、濾過膜上の微生物と生物発光試薬と
の接触に先立ち、適当な抽出剤を用いて微生物のATPを
抽出することにより、検出感度が向上する。その場合、
公知のATP抽出剤を濾過膜上に滴下又は噴霧すればよ
い。ATP抽出剤としては、例えば、エタノールとアンモ
ニアとの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤
（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリト
ンX100等）、トリクロル酢酸、過塩素酸等が使用でき
る。特にエタノールとアンモニアまたはメタノールとア
ンモニアとの混合液は、ATP抽出操作後の揮発が容易で
ある点、及び前記ATP分解酵素の活性を阻害するという
点で、ATP抽出剤として好適である。その組成として
は、例えばアンモニアを１％で含有する９０％エタノー
ルを使用することができる。また、ｐHの低い培地の影
響により、発光時のｐHが低下して、輝点が写らなくな
る場合がある。このような場合は、ATP抽出剤に使用す
る緩衝液の濃度や種類やｐHを調節することにより、発
光時のｐHを上昇させて輝点を写すことができる。ま
た、アンモニアの濃度を調節することにより発光時のｐ
Hを上昇させることも好ましい。ATP抽出剤の噴霧は、例
えば超音波式噴霧機（松下電工製）等を用い、５秒〜５
分間程度行えばよい。または、平面に広げた抽出試薬に
濾過膜を浸してもよい。寒天等に抽出試薬を染み込ませ
て、これに濾過膜をのせて抽出試薬を供給しても良い。
ATP抽出後は、必要により乾燥等を行い、ATP抽出剤を除
去する。また、微生物の種類や、乾燥などの濾過膜の処
理方法によって、また、発光試薬と接触した時に微生物
の細胞からATPが外に漏出するので、抽出剤を使用しな
くても、本発明は実施可能である。

【００３０】微生物または該微生物の抽出物と、生物発
光試薬とを接触させる場合は、濾過膜上に、生物発光試
薬を滴下又は噴霧すればよい。抽出したATPなどの生体
成分の流出を防止するため、濾過膜上に試薬を供給する
場合は、松下電工製超音波式吸入器EW622や、通常の霧
吹きを使用することが好ましい。または、平面に広げた
試薬に濾過膜を浸してもよい。寒天等に試薬を染み込ま
せて、これに濾過膜をのせて試薬を供給しても良い。以
上の操作により、濾過膜上の微生物が捕捉されている位
置で発光が生じる。

【００３１】[第2工程]第2工程では、濾過膜上の生物発
光を、写真フィルムに感光させる。写真フィルムを現像
して、輝点を観察すれば、濾過膜上の微生物の有無、生
菌数が判定できる。写真フィルムとしては、白黒または
カラー写真フィルム、Ｘ線フィルム、ネガタイプまたは
ポジタイプ用のフィルムが使用でき、より高感度のもの
が望ましい。また、現像作業を省略できる点では、イン
スタントフィルムが優れている。インスタントフィルム
としては、富士写真フィルム株式会社製のFP-3000BやFP
-400BやFP-100B、ボストンプローブ社製のSPOTlight Fi
lm DT20000、ポラロイド社製のType667等が使用でき
る。

【００３２】濾過膜上の生物発光を、写真フィルムに感
光させる場合は、暗室内または暗箱中で、発光を生じて
いる濾過膜と、写真フィルムとを直接または透光性の素
材を介して密着させればよい。感光時は、濾過膜と写真
フィルムとはできる限り近づけた方が良いので、好まし
い透光性の素材としては、ボストンプローブ社製のFoto
lopesが使用できる。Fotolopesは透明な薄膜からなり、
濾過膜とフィルムが直接触れることなく、密着させるこ
とができるので高感度な測定が可能になる。

【００３３】第2工程を実施するための器具として、市
販の写真装置、例えばボストンプローブ社(Boston Prob
es, Inc)製スポットライト（SPOTlight）や、Amersham
Pharmacia Biotech社製ECL用Mini-camera RPN2069が使
用できる。これらの写真装置は、核酸等を転写した膜上
の化学発光を写真フィルムに感光させるための一種の暗
箱として使用されている。本発明において上記写真装置
は、濾過膜上の生物発光を写真フィルムに感光させるた
めの暗箱として使用できる。

【００３４】生物発光試薬として、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼを含む生物発光試薬を用いた場合は、ルシフ
ェラーゼ濃度を適度に調整することにより、１分から10
分程度の撮影時間内に発光が終了するようにして、得ら
れる光を無駄なく蓄積できるようにすることが好まし
い。また、ｐHの低い培地の影響により、発光時のｐHが
低下して、輝点が写らなくなる場合がある。このような
場合は、発光試薬に使用する緩衝液の濃度や種類やｐH
を調節することにより、発光時のｐHを上昇させて輝点
を写すことができる。

【００３５】[生物発光試薬とATP変換反応試薬との組み
合わせ]本発明で言うATP変換反応とは、反応時にATPが
生成される任意の反応系を指し、例えばAMPから直接ATP
を生成する反応系が含まれる。生物発光試薬を用いる従
来の測定法では、生物発光反応に関与する生体成分は主
にATPであり、該ATPの消費に伴って発光量が減衰してし
まうという問題があった。一方、本発明ではATP変換反
応を利用することにより、種々のアデノシンリン酸エス
テル類（AMP、サイクリックAMP、ADP、RNA等）からATP
が新たに生成され、かつ生物発光反応において消費され
たATPも再生される。その結果、発光量及び発光時間が
増大するので、迅速、簡便かつ高感度な微生物の検出が
可能となる。

【００３６】この反応を触媒する酵素としては例えば、
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(以下「PPD
K」)、ホスホエノールピルベートシンセターゼが挙げら
れる。また、アデニレートキナーゼとピルベートキナー
ゼを組み合わせて用いて、AMPからATPを生成しても良
い。また、ポリホスフェート:AMPホスホトランスフェラ
ーゼとアデニレートキナーゼとを組み合わせてATPを生
成しても良い（Applied and Environmental Microbiolo
gy, May 2000,2045-2051）。また、ADP-依存性 (AMP-Fo
rming) グルコキナーゼを用いてADPからAMPを生成し
て、さらにピルベートオルトホスフェートジキナーゼを
用いて、AMPからATPを生成しても良い（Journal of Bio
chemistry 128, 1079-1085 2000）。また、ポリリン酸
キナーゼ(Polyphosphate kinase、)とアデニレートキナ
ーゼ（Adenylate kinase、ＥＣ ２．７．４．３）を組
み合わせて用いて、ＡＭＰからＡＴＰを生成しても良い
（特開２００１−２１１９００）。また、AMP-PolyP ホ
スホトランスフェラーゼ（AMP-Polyphosphate phosphot
ransferase、）とポリリン酸キナーゼ(Polyphosphate k
inase、)を組み合わせて用いて、ＡＭＰからＡＴＰを生
成しても良い。

【００３７】ATP変換反応試薬としては、ATP変換反応に
関与する物質、具体的には、例えば、次の（ニ）〜
（ト）の物質を含む試薬が挙げられる。 （ニ）PPDK （ホ）ホスホエノールピルビン酸 （ヘ）ピロリン酸 （ト）マグネシウムイオン又は他の金属イオン

【００３８】PPDKは、マグネシウムイオン存在下で、AM
P、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸に作用し
て、ATP、ピルビン酸及びリン酸を生じる反応を触媒
し、その逆の反応も触媒する公知酵素である。上記の試
薬と、反応系中のAMPとが反応することにより、ATPが生
成する。また、本発明では、上記（ニ）〜（ト）の物質
を含むATP変換反応試薬に、他の物質を加えてもよい。
例えば、サイクリック3',5'-ヌクレオチドホスホジエス
テラーゼを加えた場合は、AMPのみならず、サイクリッ
クAMPからもATPが生成する。

【００３９】また、上記（ニ）〜（ト）の物質を含むAT
P変換反応試薬に、ピルビン酸キナーゼを加えた場合
は、AMPのみならず、ADPからもATPが生成する。この
他、上記（ニ）〜（ト）の物質と、それ以外の物質との
組み合わせであって、反応時にATPが生成する反応に関
与する物質を含む試薬は、本発明のATP変換反応試薬に
含まれる。

【００４０】PPDKとしては、植物、例えばトウモロコシ
葉由来[Biochemistry 12、2862-2867(1973)]及びサトウ
キビ葉由来[The Biochemical Journal 114、117-125(196
9)]の酵素が挙げられる。また、微生物由来のものとし
ては、例えばプロピオニバクテリウム・シェルマニ(Pro
pionibacteriumshermanii)[Biochemistry 10、721-729(1
971)]、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xyli
num)[Journal of Bacteriology(1970)]、バクテロイデ
ス・シンビオサス(Bacteroides symbiosus)[Methods in
Enzymology 42、199-212(1975)]及びミクロビスポーラ
属［例えばミクロビスポーラ・サーモローザ(Microbisp
ora thermorosea)IFO 14047]等に属する微生物の生産す
る酵素が挙げられる。PPDKは、上記生物から精製した天
然型ＰＰＤＫ、遺伝子工学的手法により調製した天然型
ＰＰＤＫ、さらには天然型ＰＰＤＫのアミノ酸配列中の
１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異を
導入した変異型ＰＰＤＫを使用することができる。

【００４１】生体成分がRNAである場合は、反応系にリ
ボヌクレアーゼ(RNase)を加えることによりRNAからAMP
が生成し、該AMPがATP変換反応においてATPとなる。ATP
変換反応及び生物発光反応の条件（試薬に含まれる各成
分の終濃度、反応時間、温度等）、上記試薬の滴下又は
噴霧の順序等は特に限定されず、微生物や濾過膜等の状
態に応じて適宜設定すればよい。すなわち、ATP変換反
応試薬と生物発光試薬は、混合して使用してもよく、順
次濾過膜上に加えてもよい。

【００４２】操作の簡便化という点から、ATP変換反応
試薬と生物発光試薬とを混合して用いることが好まし
い。その場合、例えば以下（ａ）〜（ｊ）を含む混合溶
液を使用することができる。 （a）PPDK；0.001 U/ml以上、好ましくは0.002〜100U/m
l （b）ホスホエノールピルビン酸；終濃度0.1mM以上、好
ましくは0.5〜8.0mM （c）ピロリン酸；終濃度0.01mM以上、好ましくは0.05
〜5mMとなる濃度 （d）マグネシウムイオン；終濃度1.0mM以上、好ましく
は5.0〜100mM （e）ルシフェリン；終濃度5.0μM以上、好ましくは50.
0〜10000μM （f）ルシフェラ−ゼ；終濃度0.1mg/ml以上、好ましく
は0.5〜20mg/ml （g）硫酸アンモニウム；終濃度0.1mM以上、好ましくは
0.5〜100mM （h）ジチオスレイトール；終濃度0.1mM以上、好ましく
は0.5〜10mM （i）EDTA；終濃度0.1mM以上、好ましくは0.5〜10mM （j）Tricine緩衝液(pH7.6〜8.3)；終濃度5mM以上、好
ましくは10〜1000mM

【００４３】上記の混合溶液を用いることにより、生物
発光反応におけるATPの消費により生じたAMPからATPが
再生されるので、発光量及び発光時間が増大する。な
お、上記の混合溶液において、硫酸アンモニウム、ジチ
オスレイトール（DTT）、EDTA、TricineやHEPESは、溶
液の安定性又は緩衝能の向上のために添加することが好
ましい物質である。そのような物質としては、ウシ血清
アルブミン、シュークロース等が使用できる。

【００４４】本発明において、微生物中の生体成分であ
るサイクリックAMPからATPを生成させる場合は、上記混
合溶液にサイクリック3',5'-ヌクレオチドホスホジエス
テラーゼ(0.01 U/ml以上、好ましくは0.02〜10 U/ml)を
添加すればよい。

【００４５】なお、ATP変換反応試薬と生物発光試薬に
は、ATP分解酵素であるアデノシンリン酸デアミナーゼ
を添加してもよい。上記試薬中にATPが混入している場
合は、アデノシンリン酸デアミナーゼの添加により、試
薬中のATPが消去されバックグランド発光が低下する。
その場合、ATP抽出剤中にアデノシンリン酸デアミナー
ゼの阻害剤であるコホルマイシンを添加しておくことが
好ましい。こうすることにより、濾過膜上に上記試薬を
加えた場合に、微生物由来のATPの分解が防止できる。
この結果、露光時間を長くすることにより、よりATP含
量の低い小さな微生物も検出することができるようにな
る。上記のATP変換反応試薬と生物発光試薬の混合溶液
にアデノシンリン酸デアミナーゼを添加する場合は、0.
01 U/ml以上、好ましくは0.05〜10 U/mlとなるように添
加すればよい。

【００４６】

【実施例】次に、以下実施例を挙げて本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。実施例では、本発明の試薬として、MSLU発光試薬
（ATP変換反応試薬を含まない生物発光試薬）またはPPD
K発光試薬（ATP変換反応試薬と生物発光試薬の混合試
薬）を使用した。さらに市販の発光試薬であるキッコー
マン社製ルシフェールＨＳ（ATP変換反応試薬を含まな
い生物発光試薬）も使用した。

【００４７】１．使用する試薬の組成 (1)MSLU発光試薬：ルシフェラーゼ 0.036 mg/ml、ルシ
フェリン 0.5 mM、EDTA２Na 1ｍM、酢酸マグネシウム
４水和物 10mM、DTT 0.2 mM、BSA 0.2%、シュークロ
ース 0.37%、トリシン 25mM (pH7.75) (2)PPDK発光試薬：ルシフェリン 0.75mM、ホタルルシフ
ェラーゼ 3.6mg/ml、PPDK 0.47U/ml、EDTA 2Na 1mM、
DTT 0.2mM、酢酸マグネシウム４水和物 10mM、BSA 0.2
％、シュークロース 0.4％、ピロリン酸カリウム塩 0.3
mM、PEPカリウム塩 2.1mM、アデノシンリン酸デアミナ
ーゼ 0.2U/ml、Tricine 25mM (pH7.8)

【００４８】２．酵素活性の測定法 実施例において使用する酵素の活性測定法を以下に示
す。 (1)PPDK（Microbispora thermorosea IFO14047由来） 3mM 硫酸マグネシウム、25mM 硫酸アンモニウム、2mM 2
-メルカプトエタノール、2mM ピロリン酸、2mM ホスホ
エノールピルビン酸及び0.1mM AMPを含む50mM BIS-TRIS
PROPANE緩衝液(pH6.8)180μlをマイクロチューブにと
り、温度平衡を37℃に到達させた後、適当な活性を有す
る酵素溶液20μlを加え、15分間反応させ、沸騰水中で
３分間煮沸し反応を止める。この反応液を適当に希釈し
たもの50μlを試験管にとり、そこに「ルシフェール25
0」（キッコーマン社製）溶液を50μl滴下し、発光量を
測定する。

【００４９】別に予め既知濃度のATP標準溶液を用い
て、その発光量との関係を調べたグラフを用意する。こ
のグラフを用いて、37℃で１分間当たりに生成されるAT
Pのμmolを計算し、この数値を使用酵素液中の活性単位
とする。なお、37℃で１分当たりに1μmolのATPを生成
する酵素量を１単位(U)とする。

【００５０】(2)アデノシンリン酸デアミナ−ゼ(Asperg
illus属由来)活性の測定法 100mM酢酸ナトリウム緩衝液(1mM EDTAを含む)(pH5.0)に
ATPを80μMとなるように溶解したものを基質溶液とす
る。基質液3mlに酵素溶液液100μlを添加し、30℃で30
分間反応させる。その後60％過塩素酸100μlを添加して
反応を停止し、265nmの吸光度ODを測定する。OD値が1分
間当り2.4変化する酵素量を1ユニット(U)とする。

【００５１】〔実施例１〕大腸菌（Escherichia coli）
ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振と
う培養した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾
過器にセットした。その後、洗浄液(0.05％ グルコー
ス, 0.05％フルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れ
て、菌希釈液(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.
05％ フルクトース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した
大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922を添加した。次
に、洗浄液10mlで２回洗浄した。濾過器からメンブレン
をはずし、標準寒天培地にのせて、３５℃で5時間培養
した。その後メンブレンを培地からはずして風乾した。
乾燥後、ATP抽出剤として日本ミリポア社製ATP放出用試
薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で５秒間噴霧し
て風乾した。その後、MSLU発光試薬を松下電工製超音波
式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボストンプローブ社
製Fotolopeにはさんで、ボストンプローブ社製スポット
ライトにセットして５分間露光をした。インスタントフ
ィルムは富士写真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用し
た。

【００５２】撮影された輝点数を眼視で計測した。一
方、標準寒天培地にメンブレンフィルターをのせて培養
して（35℃、48時間）目視でコロニーを計測した菌数
（ColonyForming Unit）(CFU)を計測し表１に示した。
その結果、出現した輝点数と、培養法で測定したCFUは
よく一致した。

【００５３】

【表１】

【００５４】〔実施例２〕Pseudomonas diminuta IFO12
697を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振とう培養
した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社製、疎水
性格子入りRMDフィルター、RMHV047 20)を濾過器にセッ
トした。その後、洗浄液(0.05％ グルコース, 0.05％フ
ルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れて、菌希釈液
(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.05％ フルク
トース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈したPseudomonas
diminuta IFO12697を添加した。次に、洗浄液10mlで２
回洗浄した。濾過器からメンブレンをはずし、標準寒天
培地にのせて、３５℃で20時間培養した。その後メンブ
レンを培地からはずして風乾した。乾燥後、日本ミリポ
ア社製ATP放出用試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW62
2)で５秒間噴霧して風乾した。その後、MSLU発光試薬を
松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボ
ストンプローブ社製Fotolopeにはさんで、ボストンプロ
ーブ社製スポットライトにセットして５分間露光をし
た。インスタントフィルムは富士写真フィルム株式会社
製FP-3000Bを使用した。撮影された輝点数を眼視で計測
したところ１８個であった。一方、標準寒天培地にメン
ブレンフィルターをのせて培養して（35℃、48時間）目
視でコロニーを計測した菌数（Colony Forming Unit）
(CFU)を計測したところ１９個であった。その結果、出
現した輝点数と、培養法で測定したCFUはよく一致し
た。

【００５５】〔実施例３〕酵母Saccharomyces cerevisi
ae IFO10217をブドウ糖ペプトン培地５ｍｌで30℃で一
晩培養した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾
過器にセットした。その後、洗浄液(0.05％ グルコー
ス, 0.05％フルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れ
て、菌希釈液(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.
05％ フルクトース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した
酵母Saccharomyces cerevisiae IFO10217を添加した。
次に、洗浄液10mlで２回洗浄した。濾過器からメンブレ
ンをはずし風乾した。乾燥後、日本ミリポア社製ATP放
出用試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で５秒間
噴霧して風乾した。その後、発光試薬（キッコーマン社
製ルシフェールＨＳ）を松下電工製超音波式噴霧器(EW6
22)で8秒間噴霧して、ボストンプローブ社製Fotolopeに
はさんで、ボストンプローブ社製スポットライトにセッ
トして５分間露光をした。インスタントフィルムは富士
写真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用した。

【００５６】撮影された輝点数を眼視で計測したところ
４７個であった。一方、栄研化学株式会社製ポテトデキ
ストロース寒天培地にメンブレンフィルターをのせて培
養して（35℃、48時間）目視でコロニー数を測定した菌
数（Colony Forming Unit）(CFU)は４６CFUであった。
その結果、出現した輝点数と、培養法で測定したCFUは
よく一致した。酵母Saccharomyces cerevisiae IFO102
17の場合は、培養することなく発光試薬（キッコーマン
社製ルシフェールＨＳ）を用いた本方法で検出すること
ができた。

【００５７】〔実施例４〕酵母Saccharomyces cerevisi
ae IFO10217をブドウ糖ペプトン培地５ｍｌで30℃で一
晩培養した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾
過器にセットした。その後、洗浄液(0.05％ グルコー
ス, 0.05％フルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れ
て、菌希釈液(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.
05％ フルクトース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した
酵母Saccharomyces cerevisiae IFO10217を添加した。
次に、水10mlで２回洗浄した。濾過器からメンブレンを
はずし風乾した。乾燥後、日本ミリポア社製ATP放出用
試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で５秒間噴霧
して風乾した。その後、PPDK発光試薬を松下電工製超音
波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボストンプローブ
社製Fotolopeにはさんで、ボストンプローブ社製スポッ
トライトにセットして５分間露光をした。インスタント
フィルムは富士写真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用
した。

【００５８】撮影された輝点数を眼視で計測したところ
３０個であった。一方、栄研化学株式会社製ポテトデキ
ストロース寒天培地にメンブレンフィルターをのせて培
養して（35℃、48時間）目視でコロニー数を測定した菌
数（Colony Forming Unit）(CFU)は２８CFUであった。
その結果、出現した輝点数と、培養法で測定したCFUは
よく一致した。酵母の場合は培養することなくPPDK発光
試薬を用いた本方法で検出することができた。

【００５９】〔実施例５〕Bacillus subtilis ATCC6051
を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振とう培養し
た。メンブレンフィルター(日本ミリポア社製、疎水性
格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾過器にセッ
トした。その後、洗浄液(0.05％ グルコース, 0.05％フ
ルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れて、菌希釈液
(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.05％ フルク
トース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈したBacillus su
btilis ATCC6051を添加した。次に、洗浄液10mlで２回
洗浄した。濾過器からメンブレンをはずし、風乾した。
乾燥後、コホルマイシンを5μMで含有する日本ミリポア
社製ATP放出用試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)
で５秒間噴霧して風乾した。その後、PPDK発光試薬を松
下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボス
トンプローブ社製Fotolopeにはさんで、ボストンプロー
ブ社製スポットライトにセットして３０℃で1.5時間露
光した。インスタントフィルムは富士写真フィルム株式
会社製FP-3000Bを使用した。

【００６０】撮影された輝点数を眼視で計測したところ
５３個であった。一方、標準寒天培地にメンブレンフィ
ルターをのせて培養して（35℃、48時間）目視でコロニ
ーを計測した菌数（Colony Forming Unit）(CFU)を計測
したところ５０個であった。その結果、出現した輝点数
と、培養法で測定したCFUはよく一致した。Bacillussub
tilisの場合は、培養することなく、PPDK発光試薬を用
いることにより本方法で検出することができた。

【００６１】〔実施例６〕大腸菌（Escherichia coli）
ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振と
う培養した。メンブレンフィルター、QA LABOLATORIES
社製（グンゼ産業社販売）のISO-Gridシステム用のHGMF
（Hydrophobic Grid Membrane Filter）（疎水性格
子膜メンブランフィルター）を濾過器にセットした。そ
の後、洗浄液(0.05％ グルコース, 0.05％ フルクトー
ス, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れて、菌希釈液(5％ ス
クロース, 0.05％ グルコース, 0.05％ フルクトース,
10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した大腸菌（Escherichia
coli）ATCC25922を添加した。次に、洗浄液10mlで２回
洗浄した。濾過器からメンブレンをはずし、標準寒天培
地にのせて、３５℃で６時間培養した。その後メンブレ
ンを培地からはずして風乾した。その後、MSLU発光試薬
を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、
ボストンプローブ社製Fotolopeにはさんで、ボストンプ
ローブ社製スポットライトにセットして５分間露光をし
た。インスタントフィルムは富士写真フィルム株式会社
製FP-3000Bを使用した。

【００６２】撮影された輝点数を眼視で計測したところ
３８個であった。一方、標準寒天培地にメンブレンフィ
ルターをのせて培養して（35℃、48時間）目視でコロニ
ーを計測した菌数（Colony Forming Unit）(CFU)を計測
したところ３６個であった。その結果、出現した輝点数
と、培養法で測定したCFUはよく一致した。

【００６３】〔実施例７〕大腸菌（Escherichia coli）
ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振と
う培養した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾
過器にセットした。その後、洗浄液（10mM リン酸緩衝
液入り生理食塩水ｐH7.0）10mlを入れて、菌希釈液(5％
スクロース, 0.05％ グルコース, 0.05％ フルクトー
ス, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した大腸菌（Escheri
chia coli）ATCC25922を添加した。次に、洗浄液10mlで
２回洗浄した。濾過器からメンブレンをはずし、ソイビ
ーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地にのせて、３５
℃で5時間培養した。その後メンブレンを培地からはず
して風乾した。乾燥後、日本ミリポア社製ATP放出用試
薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で５秒間噴霧し
て風乾した。その後、キッコーマン社製ルシフェールHS
を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、
ボストンプローブ社製Fotolopeにはさんで、ボストンプ
ローブ社製スポットライトにセットして５分間露光をし
た。インスタントフィルムは富士写真フィルム株式会社
製FP-3000Bを使用した。

【００６４】撮影された輝点数を眼視で計測したところ
２４個であった。一方、ソイビーン・カゼイン・ダイジ
ェスト寒天培地にメンブレンフィルターをのせて培養し
て（35℃、48時間）目視でコロニーを計測した菌数（Co
lony Forming Unit）(CFU)を計測したところ２６個であ
った。その結果、出現した輝点数と、培養法で測定した
CFUはよく一致した。

【００６５】〔実施例８〕大腸菌（Escherichia coli）
ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振と
う培養した。下記の工程にそって作製したメンブレンを
2枚作製した。メンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)を濾
過器にセットした。その後、洗浄液(0.05％ グルコー
ス, 0.05％フルクトース, 1mM HEPES pH7.0)10mlを入れ
て、菌希釈液(5％ スクロース, 0.05％ グルコース, 0.
05％ フルクトース, 10mM HEPES pH7.0)で適宜希釈した
大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922を添加した。次
に、洗浄液10mlで２回洗浄した。濾過器からメンブレン
をはずし、標準寒天培地にのせて、３５℃で5時間培養
した。その後メンブレンを培地からはずして風乾した。
乾燥後、日本ミリポア社製ATP放出用試薬を松下電工製
超音波式噴霧器(EW622)で５秒間噴霧して風乾した。そ
の後、MSLU発光試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW62
2)で8秒間噴霧した。

【００６６】1枚をボストンプローブ社製Fotolopeには
さんで、ボストンプローブ社製スポットライトにセット
して５分間露光をした。インスタントフィルムは富士写
真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用した。撮影された
輝点数を目視で計測したところ３８個であった。（本発
明の方法） もう1枚はメンブレンを浜松ホトニクス（株）製ARGUS-5
0/CL(商品名)のテーパーファイバー入力式のものにセッ
トし5分間露光をした。モニター画面上に出現した輝点
数を目視で計測したところ、３６個であった。（比較
例） 一方、標準寒天培地にメンブレンフィルターをのせて培
養して（35℃、48時間）目視でコロニーを計測した菌数
（Colony Forming Unit）(CFU)を計測したところ３７個
であった。その結果、本発明の方法で求めた輝点数、比
較例で求めた輝点数、および培養法で測定したCFUは、
よく一致した。このことにより、本発明を用いれば、安
価な装置を用いて、高額な画像解析システム装置と同程
度の結果が得られることが明らかとなった。

【００６７】〔実施例９〕大腸菌（Escherichia coli）
ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振と
う培養した。これを普通ブイヨン培地で100倍希釈し、
サンプルとした。このサンプルをメンブレンフィルター
(日本ミリポア社製、疎水性格子入りRMDフィルター、RM
HV 047 20)に1 μｌづつ5点スポットした。一方、菌を
含まない普通ブイヨン培地も同じフィルターに1 μｌづ
つ5点スポットして風乾した。乾燥後、日本ミリポア社
製ATP放出用試薬を松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で
５秒間噴霧して風乾した。その後、キッコーマン社製ル
シフェールHSを松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒
間噴霧して、ボストンプローブ社製Fotolopeにはさん
で、ボストンプローブ社製スポットライトにセットして
５分間露光をした。インスタントフィルムは富士写真フ
ィルム株式会社製FP-3000Bを使用した。撮影された輝点
を眼視で計測したところ、菌を含むサンプルを5点スポ
ットした部分は輝点が5個確認されたが、菌を含まない
普通ブイヨン培地を5点スポットした部分は何も写って
いなかった。その結果、サンプル中の菌の有無を確認す
ることができた。

【００６８】〔実施例１０〕大腸菌（Escherichia col
i）ATCC25922を普通ブイヨン培地５ｍｌで30℃で一晩振
とう培養した。これを滅菌水で10⁸倍希釈し、サンプル
とした。このサンプル１ｍｌを普通ブイヨン培地５ｍｌ
に添加して30℃で５時間振とう培養した。この培養液を
メンブレンフィルター(日本ミリポア社製、疎水性格子
入りRMDフィルター、RMHV 047 20)に1 μｌづつ5点スポ
ットした。同じサンプル１ｍｌを標準寒天培地で30℃で
2日間、混釈培養した結果、菌数は２CFU/mlであった。
一方、滅菌水１ｍｌを普通ブイヨン培地５ｍｌに添加し
て30℃で５時間振とう培養した。この培養液をメンブレ
ンフィルター(日本ミリポア社製、疎水性格子入りRMDフ
ィルター、RMHV 047 20)に1 μｌづつ5点スポットし
た。滅菌水１ｍｌを標準寒天培地で30℃で2日間、混釈
培養した結果、菌数は０CFU/mlであった。メンブレンフ
ィルターを乾燥後、日本ミリポア社製ATP放出用試薬を
松下電工製超音波式噴霧器(EW622)で５秒間噴霧して風
乾した。その後、キッコーマン社製ルシフェールHSを松
下電工製超音波式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボス
トンプローブ社製Fotolopeにはさんで、ボストンプロー
ブ社製スポットライトにセットして５分間露光をした。
インスタントフィルムは富士写真フィルム株式会社製FP
-3000Bを使用した。撮影された輝点を眼視で計測したと
ころ、菌を含む水を培養したものを5点スポットした部
分は輝点が5個確認されたが、滅菌水を培養したものを5
点スポットした部分は何も写っていなかった。その結
果、サンプル中の菌の有無を確認することができた。

【００６９】〔実施例１１〕ソイビーン・カゼイン・ダ
イジェスト（SCD）液体培地（栄研化学社製）をクエン
酸でpH3.7に調製して121℃で15分間オートクレーブをか
けた。これをSCD液体培地(pH 3.7)とした。SCD液体培地
(pH 3.7) 2mlを滅菌ペトリパッド（ミリポア社製）に
染み込ませてメンブレンフィルター(日本ミリポア社
製、疎水性格子入りRMDフィルター、RMHV 047 20)をの
せて50℃で18時間放置した。滅菌ペトリパッドから、メ
ンブレンフィルターをはずして乾燥した。これを2枚作
製した。これらにATP溶液（1×１０^−７ M）を0.1μｌ
ずつ5点スポットした。このうち1枚にキッコーマン社製
ルシフェールHSの1バイアルを５ｍｌの20 mM TricinepH
8．0で溶解したものを松下電工製超音波式噴霧器(EW62
2)で8秒間噴霧して、ボストンプローブ社製Fotolopeに
はさんで、ボストンプローブ社製スポットライトにセッ
トして５分間露光をした。インスタントフィルムは富士
写真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用した。pHの低い
培地の影響で、発光時のｐHが低いので発光が起こらな
かったので輝点は撮影されなかった。もう1枚にはキッ
コーマン社製ルシフェールHSの1バイアルを５ｍｌの500
mM Tricine pH8．0で溶解したものを松下電工製超音波
式噴霧器(EW622)で8秒間噴霧して、ボストンプローブ社
製Fotolopeにはさんで、ボストンプローブ社製スポット
ライトにセットして５分間露光をした。インスタントフ
ィルムは富士写真フィルム株式会社製FP-3000Bを使用し
た。メンブレンに染み込んだ培地の低いｐHの阻害の影
響を、キッコーマン社製ルシフェールHSの1バイアルを
５ｍｌの500 mM Tricine pH8．0で溶解したもの高い緩
衝作用で緩和し、発光時のｐHを十分上げることができ
たので輝点を撮影できた。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、濾過膜上に捕捉された微
生物の迅速、簡便かつ高感度な検出を安価な装置を用い
て行う方法が提供された。

【００７１】実施例において使用した写真装置「ボスト
ンプローブ社製スポットライト」や類似の装置は、一般
的に10万円前後の価格である。従来、濾過膜上の微生物
由来の生物発光を検出する場合は、高額な画像解析シス
テム装置が使用されていたが、本発明を用いれば、安価
な装置を用いて同程度の結果が得られることが明らかと
なった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 五十嵐 俊教 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 服部 憲晃 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 原田 靖広 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 村上 成治 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AA07 BA04 BB02 BB06 BB11 BB13 CA20 CA28 CE02 CE08 EA02 EA10 FA23 GB04 GE06 JA01 JA04 4B063 QA01 QQ05 QR03 QR50 QR66 QR69 QR82 QX01

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程を含む、濾過膜上の微生物の検
   出法。 （１）濾過膜上に捕捉した微生物または該微生物の抽出
   物と、生物発光試薬とを接触させて、濾過膜上に生物発
   光を生じさせる第1工程 （２）濾過膜上の生物発光を、写真フィルムに感光させ
   る第2工程
2. 【請求項２】第2工程が、発光を生じている濾過膜と、
   写真フィルムとを直接または透光性の素材を介して密着
   させる方法である、請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】生物発光試薬が、ルシフェラーゼ、ルシフ
   ェリンおよびマグネシウムイオンを含む、請求項１また
   は２記載の検出法。
4. 【請求項４】写真フィルムがインスタントフィルムであ
   る、請求項１または２記載の検出法。