JPH1156393A - Ａｔｐの測定法およびａｔｐ測定用試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】バックグラウンドＡＴＰをＡＴＰ分解酵素によ
り分解する工程を含む標的ＡＴＰの測定法において、標
的ＡＴＰの測定を阻害することなくＡＴＰ分解酵素を失
活させること。 【解決手段】１．バックグラウンドＡＴＰを、アデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼにより分解した後、上記アデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼを阻害剤により失活させ、次いで
標的ＡＴＰを測定することを特徴とする標的ＡＴＰの測
定法。 ２．アデノシンリン酸デアミナ−ゼ及び阻害剤を成分と
するバックグラウンドＡＴＰ分解用試薬キット。 ３．（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ、（２）阻害
剤、（３）標的ＡＴＰの測定に関与する物質、を含む標
的ＡＴＰ測定用試薬キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＡＴＰ（アデノシ
ン−５´−三リン酸）の測定方法およびＡＴＰ測定用試
薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＡＴＰは、すべての生物の細胞内に含ま
れるヌクレオチドである。試料中に含まれる測定するべ
きＡＴＰ（以下「標的ＡＴＰ」という）の測定は、各種
工業分野において広く行なわれている。特に、食品衛
生、バイオ、臨床検査、医学などの現場では、試料中の
微生物の有無の判定、該微生物の細胞数の計数等を目的
として、細胞内ＡＴＰの測定が行なわれている。細胞内
ＡＴＰを測定する場合、細胞を含む試料に界面活性剤等
を添加して細胞内ＡＴＰを抽出した後、抽出されたＡＴ
Ｐを測定する方法が多用されている。

【０００３】標的ＡＴＰの測定法としては、例えば生物
発光反応、具体的にはルシフェリン−ルシフェラーゼ発
光反応を利用する方法等が知られている。生物発光反応
を利用する方法は、高感度な測定が短時間で行なえると
いう点で優れている。

【０００４】標的ＡＴＰの測定法においては、標的ＡＴ
Ｐ以外のＡＴＰ（以下「バックグラウンドＡＴＰ」とい
う）が測定系に混入することによる測定感度の低下が問
題となっていた。バックグラウンドＡＴＰが測定系（例
えば、試料、各種試薬、容器、測定器具・装置等）に混
入した場合、バックグラウンドＡＴＰが標的ＡＴＰと同
時に測定されるため、標的ＡＴＰのみを正確に測定する
ことが困難になる。

【０００５】生物が存在する場所にはＡＴＰが存在する
ので、測定系へのバックグラウンドＡＴＰの混入を完全
に防止することは非常に困難である。また、測定系にお
いて精製度の低い試薬を使用する場合、該試薬にバック
グラウンドＡＴＰが混入しているおそれもある。例え
ば、酵母エキスを含む培地中に存在する微生物の細胞数
を、細胞内ＡＴＰ量に基づいて計数する場合、酵母エキ
ス中にバックグラウンドＡＴＰが大量に存在するため、
細胞内ＡＴＰの正確な測定が困難になるという問題があ
った。

【０００６】従って、標的ＡＴＰの測定法においては、
測定系へ混入したバックグラウンドＡＴＰを効率的に除
去する方法の確立が求められていた。

【０００７】バックグラウンドＡＴＰの除去法として
は、メンブレンフィルタ−による濾過や、遠心分離によ
り試料中のバックグラウンドＡＴＰを除去する方法が知
られているが、これらの方法は操作が煩雑である。

【０００８】その他の除去法としては、ＡＴＰ分解酵素
（例えばアピラ−ゼ、アデノシントリホスファタ−ゼ、
ヘキソキナ−ゼ、ＡＴＰピロホスファタ−ゼ等）を使用
してバックグラウンドＡＴＰを分解する方法が知られて
いる（月刊フ−ドケミカル、食品化学新聞社発行、９５
年５月号、第５５〜６３ペ−ジ；特開平２−６５８０
０；ＵＳＰ５，３１６，９０７、アナリティカル・バイ
オケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）第２１８巻 ２０−２５ページ１９９４
年；ビュレティン・オブ・ザ・ジャパニーズ・ソサイア
ティー・オブ・サイエンティフィック・フィッシャリー
ズ（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉ
ｓｈｅｒｉｅｓ） 第５２巻 ９号 １６９５ページ
１９８６年；及びマリン・エコロジー−プログレス・シ
リーズ（Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ−Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ） １３巻 ３０５−３０９ページ
１９８３年）。

【０００９】ＡＴＰ分解酵素を使用してバックグラウン
ドＡＴＰを分解する方法は、操作が簡便であり、かつバ
ックグラウンドＡＴＰの分解効率が高いという点で優れ
ている。この方法では、標的ＡＴＰの測定に先立ち、測
定系からＡＴＰ分解酵素を除去する必要がある。標的Ａ
ＴＰの測定時にＡＴＰ分解酵素が存在していると、標的
ＡＴＰが分解されてしまうので、標的ＡＴＰの正確な測
定が不可能となるからである。

【００１０】ＡＴＰ分解酵素の除去法としては、固定化
アピラーゼを使用する方法が知られている（Nyren P.,
(1994) Journal of Biolumin. and Chemilumin.
9,29-34）。この方法は、試料に固定化アピラーゼを
作用させてバックグラウンドＡＴＰを分解し、標的ＡＴ
Ｐの測定時には固定化アピラーゼを除去するというもの
である。しかしながらこの方法は、酵素の固定化という
煩雑な操作が必要であり、またバックグラウンドＡＴＰ
の分解効率にも問題があった。

【００１１】その他の方法としては、ＡＴＰ分解酵素を
含む試料を加熱して該酵素を失活させる方法や、測定系
に変性剤（例えばトリクロロ酢酸）を添加してＡＴＰ分
解酵素を失活させる方法が知られている。しかしながら
これらの方法は、操作が煩雑であったり、変性剤が標的
ＡＴＰの測定を阻害するという問題があった。例えば、
標的ＡＴＰの測定法がルシフェリン−ルシフェラーゼ発
光反応を利用する方法である場合、上記変性剤としてト
リクロロ酢酸を用いると、測定系が酸性となり、発光反
応が阻害されるという問題がある。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、バッ
クグラウンドＡＴＰをＡＴＰ分解酵素により分解する工
程を含む標的ＡＴＰの測定法において、標的ＡＴＰの測
定を阻害することなくＡＴＰ分解酵素を失活させること
を特徴とする標的ＡＴＰの測定法を提供することにあ
る。また、本発明の目的は、上記標的ＡＴＰの測定法に
用いられる試薬キットを提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行なった。その結果、ＡＴＰ分
解酵素としてアデノシンリン酸デアミナーゼを使用する
場合、標的ＡＴＰの測定を阻害することのない該酵素の
阻害剤（以下、単に「阻害剤」という）としては、コホ
ルマイシンが非常に優れていることを見いだし、本発明
を完成した。

【００１４】すなわち本発明は、以下に示す標的ＡＴＰ
の測定法、バックグラウンドＡＴＰ分解用試薬キットお
よび標的ＡＴＰ測定用試薬キットに関する。 １．以下の工程を含むことを特徴とする標的ＡＴＰの測
定法 （１）測定系に存在するバックグラウンドＡＴＰを、ア
デノシンリン酸デアミナ−ゼにより分解する工程。 （２）上記アデノシンリン酸デアミナ−ゼを阻害剤によ
り失活させる工程。 （３）標的ＡＴＰを測定する工程。 ２．以下の成分を含むバックグラウンドＡＴＰ分解用試
薬キット。

【００１５】（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 ３．以下の成分を含む標的ＡＴＰ測定用試薬キット （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 （３）標的ＡＴＰの測定に関与する物質

【００１６】

【発明の実施の形態】

〔本発明における標的ＡＴＰの測定法について〕 １．アデノシンリン酸デアミナ−ゼによるバックグラウ
ンドＡＴＰの分解 本発明ではまず、測定系に存在するバックグラウンドＡ
ＴＰを、アデノシンリン酸デアミナ−ゼにより分解す
る。

【００１７】測定系とは、標的ＡＴＰの測定に関与する
物質、または該物質の組み合わせを意味する。標的ＡＴ
Ｐの測定に関与する物質とは、具体的には標的ＡＴＰを
含むと思われる試料、各種試薬、容器、測定器具・装置
等である。また、標的ＡＴＰの測定の前処理において使
用される試薬、容器、測定器具・装置等も、本発明でい
う測定系に含まれる。前処理とは、例えば、標的ＡＴＰ
が細胞内ＡＴＰである場合に行われる、細胞内ＡＴＰの
抽出処理等である。

【００１８】試料は、標的ＡＴＰを含むと思われるもの
であれば特に限定されないが、例えば飲食物・医薬品・
化粧品等の各工業製品・その半製品・その原料、海水、
河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀
痰、膿汁、細胞の培養液等である。また、細菌汚染検
査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種検査における検
体も、本発明の試料とすることができる。さらには、上
記試料を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等
等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。試料が固形分
を含む場合には、該試料を上記溶媒に懸濁するか、ミキ
サ−などでホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱
うことができる。

【００１９】拭き取り検査における検体を試料とする場
合は、綿棒のような拭き取りスティックを無菌水で湿ら
せ検査箇所を拭き取った後に、無菌水又は試薬液をいれ
た試験管の中ですすぎ、その液体部分を試料とする。

【００２０】標的ＡＴＰが細胞内ＡＴＰである場合は、
細胞を含むと思われる溶液あるいは細胞の培養液を試料
とすればよい。また、上記の溶液あるいは培養液を、親
水性または疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕捉した後
に該濾過膜を試料としてもよい。なお、ここでいう細胞
とは、例えば、酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単
細胞藻類、ウイルス、原生動物、動物または植物の細胞
及び組織培養物等を意味する。

【００２１】細胞を捕捉した濾過膜を試料とする場合、
親水性濾過膜としては、例えば親水性ポリテトラフルオ
ロエチレン、親水性ポリビニリデンフルオライド、親水
性ポリアミド、アセチルセルローズ、ニトロセルローズ
等を材料とするフィルム状又はシート状のものが使用で
きる。また、疎水性濾過膜としては、例えばＰＶＤＦ
（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポリトラ
フルオロエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）等を材料と
するものが使用できる。

【００２２】アデノシンリン酸デアミナーゼは、脱アミ
ノ反応を触媒する公知酵素（E.C.3.5.4.6）であり、ア
デノシンリン酸エステルを基質とすることができる。ア
デノシンリン酸エステルとは、例えば、ＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰ、アデノシン、サイクリックＡＭＰ等であ
る。

【００２３】アデノシンリン酸デアミナ−ゼは、基質と
してＡＴＰを用いたときはイノシン三リン酸（ＩＴＰ）
を生成し、ＡＤＰを用いたときはイノシン二リン酸（Ｉ
ＤＰ）を生成し、ＡＭＰを用いたときはイノシンモノリ
ン酸（ＩＭＰ）を生成する。（赤堀四郎編「酵素ハンド
ブック」朝倉書店１９８２年１２月１日発行、第６１１
ペ−ジ；馬場茂明ら編集、「臨床酵素ハンドブック」講
談社１９８２年９月１０日発行、第５５頁参照；「Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第１３巻、
３３５〜３４７ペ−ジ、１９６７年；「Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ」第２９巻、６号、５０８〜５１４ペ−ジ、
１９６５年）。

【００２４】アデノシンリン酸デアミナーゼにより、測
定系に存在するバックグラウンドＡＴＰが分解され、標
的ＡＴＰの正確な測定が可能となる。

【００２５】なお、本発明でいう「バックグラウンドＡ
ＴＰの分解」とは、測定系の全てのバックグラウンドＡ
ＴＰ分子を分解することのみならず、標的ＡＴＰの測定
に実質的に影響しない程度までバックグラウンドＡＴＰ
の量を減少させることも意味する。

【００２６】本発明のアデノシンリン酸デアミナーゼと
しては、例えば、真菌類（Aspergillus属 、Microspor
um audouini）、細菌（Desulfovibrio desulfurican
s）、紅藻類（Porphyra crispata、Porphyra yezoens
is）等を由来とする公知の酵素が使用できる。

【００２７】また、脱アミノ反応を触媒する活性を有す
る限り、上記酵素のアミノ酸配列中の１または複数のア
ミノ酸に付加、欠失、置換等の変異が導入された変異型
アデノシンリン酸デアミナーゼを使用することもでき
る。

【００２８】測定系に存在するバックグラウンドＡＴＰ
を分解する方法は特に限定されない。バックグラウンド
ＡＴＰの分解は、例えば以下の方法により実施されう
る。 （１）試料や各種試薬等へのアデノシンリン酸デアミナ
−ゼの添加。 （２）容器、測定器具・装置等のアデノシンリン酸デア
ミナ−ゼ溶液による洗浄。

【００２９】バックグラウンドＡＴＰの分解条件（試料
や試薬に添加するアデノシンリン酸デアミナ−ゼの終濃
度、アデノシンリン酸デアミナ−ゼと測定系との接触条
件等）は測定系の種類・性状等に応じて適宜設定すれば
よい。

【００３０】２．阻害剤によるアデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼの失活 ついで、測定系中に存在するアデノシンリン酸デアミナ
−ゼを、阻害剤により失活させる。本発明でいう阻害剤
とは、標的ＡＴＰの測定を阻害することなくアデノシン
リン酸デアミナ−ゼを失活させることができる物質をい
う。

【００３１】なお、「アデノシンリン酸デアミナ−ゼの
失活」とは、アデノシンリン酸デアミナーゼの活性が完
全に抑制されることのみならず、測定すべきＡＴＰの測
定に実質的に影響しない程度まで、アデノシンリン酸デ
アミナーゼの活性が減少することも意味する。また「標
的ＡＴＰの測定を阻害することなく」とは、阻害剤の存
在が標的ＡＴＰの測定に全く影響しないことのみなら
ず、その存在が標的ＡＴＰの測定に実質的に影響しない
ことも意味する。

【００３２】本発明の阻害剤としては、例えば、コホル
マイシン（Coformycin）を挙げることができる。コホル
マイシンは、標的ＡＴＰの測定を阻害することなくアデ
ノシンリン酸デアミナ−ゼを失活させることができるの
で、本発明の阻害剤として好適である。コホルマイシン
としては、例えばストレプトマイセス属（Streptomyces
属）等を由来とするもの、およびその誘導体が使用でき
る。なお、コホルマイシンとしては、市販品（例えば、
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）も使用できる。

【００３３】阻害剤によりアデノシンリン酸デアミナ−
ゼを失活させる方法は特に限定されない。アデノシンリ
ン酸デアミナ−ゼの失活は、例えば以下の方法により実
施される。 （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼを含む測定系（試
料・各種試薬等）への阻害剤の添加。 （２）あらかじめアデノシンリン酸デアミナ−ゼ溶液で
洗浄された容器、測定器具・装置等の阻害剤溶液による
洗浄。

【００３４】アデノシンリン酸デアミナ−ゼを失活させ
るための条件（試料や試薬に添加する阻害剤の終濃度、
阻害剤と測定系との接触条件等）は、測定系の種類・性
状および使用したアデノシンリン酸デアミナ−ゼの量等
に応じて適宜設定すればよい。溶液にコホルマイシンを
添加する場合、効率よくアデノシンリン酸デアミナ−ゼ
を失活させる点から、コホルマイシンの添加は下記の条
件で行なうことが好ましい。

【００３５】（１）コホルマイシンの終濃度：１００p
Ｍ以上、特に１０nＭ〜１ｍＭであることが好ましい） （２）反応時間：約２秒以上、特に１０秒〜２分が好ま
しい） ３．標的ＡＴＰの測定 ついで試料中の標的ＡＴＰを測定する。なお、試料の種
類・性状によっては、標的ＡＴＰの測定に先立ち、前処
理を行うことが好ましい。前処理とは、例えば、標的Ａ
ＴＰが細胞内ＡＴＰである場合に行われる、細胞内ＡＴ
Ｐの抽出処理等である。

【００３６】標的ＡＴＰの測定法は特に限定されない
が、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利
用する方法、ＡＴＰ変換反応を利用する方法等が採用で
きる。以下に、標的ＡＴＰの測定法について具体例に説
明する。 （１）ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用す
る標的ＡＴＰの測定方法この方法は、ルシフェリンおよ
びルシフェラーゼを含む発光試薬と、標的ＡＴＰとを、
金属イオン（マグネシウムイオン等）の存在下で接触さ
せ、生成した光の発光量を測定することにより標的ＡＴ
Ｐを測定する方法である。

【００３７】ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む
発光試薬（以下「ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光試
薬」という）とは、例えば以下の（イ）〜（ハ）の成分
を含む試薬である。

【００３８】（イ）ルシフェリン （ロ）ルシフェラーゼ （ハ）マグネシウムイオン ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法
は、短時間で高感度な測定が可能である点、およびコホ
ルマイシンによる阻害を受けないという点で、本発明に
おける標的ＡＴＰの測定法として優れている。

【００３９】該発光反応の模式図を以下に示す。

【化１】

【００４０】ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応と
しては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタル、
北米産ホタル、ヒカリコメツキムシ、ツチボタル等）を
由来とする反応系が使用できる。ルシフェラーゼとして
は、上記生物の発光組織から精製した天然型ルシフェラ
ーゼや、遺伝子工学的手法により調製した天然型ルシフ
ェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼのアミノ酸配
列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の
変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使用することが
できる。

【００４１】ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応に
より生じた光の発光量は、ルミノメーター、例えばアロ
カ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（改良
型）、ベルトールド社製Lumat LB9501等により測定す
ることができる。また、細胞を捕捉した濾過膜を試料と
する場合、生物発光画像解析システム装置、例えばＡＲ
ＧＵＳー５０／ＣＬ〔テーパーファイバー付：浜松ホト
ニクス（株）社製〕を用いて濾過膜上の輝点を撮像する
ことにより、細胞数を測定することが可能である。

【００４２】（２）ＡＴＰ変換反応を利用する標的ＡＴ
Ｐの測定法 試料中の細胞の有無の判定や細胞数の計測を目的とする
場合、細胞中に含まれるアデノシンリン酸エステルであ
ってＡＴＰ以外のもの（例えばＡＭＰ、ＡＤＰ、サイク
リックＡＭＰ等）をＡＴＰに変換した後、全てのＡＴＰ
を測定すれば、細胞の有無の判定等が容易になる。ＡＴ
Ｐ以外のアデノシンリン酸エステルをＡＴＰに変換する
反応を「ＡＴＰ変換反応」という。

【００４３】特にルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反
応を利用して標的ＡＴＰを測定する場合、発光反応の結
果、ＡＴＰからＡＭＰが生成するので、ＡＴＰ変換反応
を利用してＡＭＰからＡＴＰを再生させることにより、
発光量や発光時間を増加させることができる。

【００４４】ＡＴＰ変換反応を利用する方法は、標的Ａ
ＴＰの測定感度を向上させる方法として好適である。し
かしながら、測定系に、バックグラウンドＡＴＰ、ある
いはＡＴＰ以外のアデノシンリン酸エステルが混入して
いる場合、標的ＡＴＰの正確な測定が困難になるという
問題があった。

【００４５】ＡＴＰ分解酵素として知られるアピラーゼ
は、ＡＴＰおよびＡＤＰを脱リン酸化する酵素であり、
ＡＭＰには作用しない。一方、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼは、試料等に混入したＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰを
分解することができる。従って本発明は、ＡＴＰ変換反
応を利用する標的ＡＴＰの測定法において、特に好適に
使用できる。

【００４６】ＡＴＰ変換反応としては、例えばピルベ−
トオルトホスフェ−トジキナ−ゼ（以下「ＰＰＤＫ」と
いう）が関与する反応が挙げられる。ＰＰＤＫは、マグ
ネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノ−ルピル
ビン酸及びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸
及びリン酸を生成させる反応を触媒し、その逆の反応も
触媒する公知酵素である。ＰＰＤＫが触媒するＡＴＰ生
成反応は以下の通りである。

【００４７】

【化２】

【００４８】ＰＰＤＫの理化学的性質及び製法は公知で
あり、その入手は比較的に容易である。植物由来のＰＰ
ＤＫとしては、例えばトウモロコシ葉由来[Biochemistr
y 12、2862-2867 (1973)]及びサトウキビ葉由来[The Bio
chemical Journal 114、117-125(1969)]の酵素が挙げら
れる。 また、微生物由来のものとしては、例えばプロ
ピオニバクテリウム・シェルマニ(Propionibacterium s
hermanii)[Biochemistry10、721-729(1971)]、アセトバ
クタ−・キシリナム(Acetobacter xylinum)[Journal of
Bacteriology(1970)]、バクテロイデス・シンビオサス
(Bacteroides symbiosus)[Methods in Enzymology 42、1
99-212(1975)]及びミクロビスポ−ラ属［例えばミクロ
ビスポ−ラ・サ−モロ−ザ(Microbispora thermorosea)
IFO 14047]等に属する微生物の生産する酵素が挙げられ
る。ミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ(Microbispora th
ermorosea IFO 14047)由来のＰＰＤＫを使用する場合、
酵素の精製及び活性測定は、特開平８−１６８３７５号
に記載の方法に従えばよい。

【００４９】本発明のＰＰＤＫとしては、上記の生物か
ら精製した天然型ＰＰＤＫの他、酵素活性を失わない範
囲で、天然型ＰＰＤＫのアミノ酸配列中の１または複数
のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異が導入された変
異型ＰＰＤＫを使用することもできる。

【００５０】ＡＴＰ変換反応を利用する標的ＡＴＰの測
定法の一例として、ＰＰＤＫが関与するＡＴＰ変換反応
と、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応とを組み合
わせた方法について説明する。この方法では、次の
（イ）〜（ニ）を含むＡＴＰ変換反応試薬、ルシフェリ
ン−ルシフェラーゼ発光試薬、標的ＡＴＰを接触させ、
生成した光の発光量を測定する。

【００５１】（イ）ＰＰＤＫ （ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸 （ハ）ピロリン酸 （ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン ＰＰＤＫを利用することにより、ＡＭＰからＡＴＰが新
たに生成され、かつルシフェリン-ルシフェラーゼ発光
反応において消費されたＡＴＰも再生される。その結
果、発光量および発光時間が増大するので、測定感度が
向上する。

【００５２】ＡＴＰ変換反応試薬、発光試薬、標的ＡＴ
Ｐの反応は以下の通りである。

【００５３】

【化３】

【００５４】また、上記（イ）〜（ニ）を含むＡＴＰ変
換反応試薬に、ピルビン酸キナーゼを加えた場合は、Ａ
ＭＰのみならず、ＡＤＰからもＡＴＰが生成する。その
反応は以下の通りである。

【００５５】

【化４】

【００５６】また、上記（イ）〜（ニ）を含むＡＴＰ変
換反応試薬に、サイクリック３’，５’−ヌクレオチド
ホスホジエステラーゼを加えた場合は、ＡＭＰのみなら
ず、サイクリックＡＭＰからもＡＴＰが生成する。その
反応は以下の通りである。

【００５７】

【化５】

【００５８】〔バックグラウンドＡＴＰ分解用試薬キッ
トについて〕本発明のバックグラウンドＡＴＰ分解用試
薬キットは、以下の成分を含むものである。

【００５９】（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 阻害剤としては、例えば、コホルマイシンが挙げられ
る。（１）と（２）の成分は分離して保存する必要があ
る。また各成分は、乾燥状態または溶液状態で保存され
うる。また、各成分には、ｐＨ調製や保存性向上に関与
する物質を添加してもよい。そのような物質としては、
例えば、EDTA 2Na、ジチオスレイトール、硫酸アンモ
ニウム、シュークロース、HEPES等が挙げられる。

【００６０】上記の各成分は、本発明の測定系で使用す
る他の試薬と混合して使用してもよい。 〔標的ＡＴＰ測定用試薬キットについて〕本発明の標的
ＡＴＰ測定用試薬キットは、以下の成分を含むものであ
る。

【００６１】（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 （３）標的ＡＴＰの測定に関与する物質 阻害剤としては、例えば、コホルマイシンが挙げられ
る。

【００６２】標的ＡＴＰ測定用試薬キットにおいて、
（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼと（２）阻害剤と
は分離して保存する必要がある。また各成分は、乾燥状
態または溶液状態で保存されうる。また、各成分には、
ｐＨ調製や保存性向上に関与する物質を添加してもよ
い。そのような物質としては、例えば、EDTA 2Na、ジ
チオスレイトール、硫酸アンモニウム、シュークロー
ス、HEPES等が挙げられる。

【００６３】なお、（１）と（３）の成分、あるいは
（２）と（３）の成分は混合して使用してもよい。混合
する成分の組み合わせは、採用する測定系の種類・性状
等に応じて適宜設定すればよい。また、各成分は、本発
明の測定系で使用する他の試薬と混合して使用してもよ
い。

【００６４】「標的ＡＴＰの測定に関与する物質」と
は、特に限定されず、標的ＡＴＰを測定するために使用
される任意の物質を意味する。ルシフェリン-ルシフェ
ラーゼ発光反応を利用して標的ＡＴＰを測定する場合、
「標的ＡＴＰの測定に関与する物質」とは、例えば以下
の成分を含むものである。

【００６５】（イ）ルシフェラーゼ （ロ）ルシフェリン （ハ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン また、ＡＴＰ変換反応とルシフェリン-ルシフェラーゼ
発光反応とを組み合わせた方法により標的ＡＴＰを測定
する場合、「標的ＡＴＰの測定に関与する物質」とは、
例えば以下の成分を含むものである。

【００６６】（イ）ルシフェラーゼ （ロ）ルシフェリン （ハ）ピルベ−トオルトフォスフェ−トジキナ−ゼ （ニ）ホスホエノ−ルピルビン酸 （ホ）ピロリン酸 （ヘ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン 〔本発明の具体例〕以下具体例により本発明をさらに詳
説する。 具体例１：（阻害剤がコホルマイシン、標的ＡＴＰが細
胞内ＡＴＰであり、標的ＡＴＰをルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ発光反応を利用する方法により測定する場合） １．アデノシンリン酸デアミナ−ゼによるバックグラウ
ンドＡＴＰの分解 まず、細胞を含む試料にアデノシンリン酸デアミナーゼ
溶液を添加して、試料中のバックグラウンドＡＴＰを分
解する。

【００６７】試料としては、例えば、細胞を含む溶液、
細胞を捕捉した濾過膜等が使用できる。

【００６８】アデノシンリン酸デアミナーゼによるバッ
クグラウンドＡＴＰの分解条件は、試料の種類・性状等
に応じて適宜設定すればよい。バックグラウンドＡＴＰ
の分解は、例えば下記の条件で行なうことができる。

【００６９】（１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼの終
濃度：０．００１Ｕ／ｍｌ以上（特に０．０１〜１０Ｕ
／ｍｌであることが好ましい） （２）ｐＨ条件：弱酸性〜弱アルカリ性（特にｐＨ５．
０〜８．０が好ましい） （３）反応温度：２０〜５０℃（特に４０〜４５℃が好
ましい） （４）反応時間：約２時間以内（特に１〜３０分が好ま
しい） 試料やアデノシンリン酸デアミナ−ゼ溶液のｐＨの調整
には、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メ
ス（ＭＥＳ）緩衝液等が使用できる。

【００７０】なお、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの活
性は、以下の方法で測定するものとする。基質溶液（１
００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、８０μＭ ＡＴＰ）３ｍｌに酵素溶液１００μｌ
を添加し、３０℃で３０分間反応した後に６０％過塩素
酸１００μｌを添加して、反応を停止し、２６５ｎｍの
吸光度ＯＤを測定する。ＯＤ値が１分間当り２．４変化
する酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。

【００７１】２．コホルマイシンによるアデノシンリン
酸デアミナ−ゼの失活 バックグラウンドＡＴＰを分解した後の試料にコホルマ
イシン溶液を添加して、試料中のアデノシンリン酸デア
ミナーゼを失活させる。

【００７２】コホルマイシン添加量や反応条件は、試料
の種類・性状、試料に添加したアデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼの終濃度等に応じて適宜設定すればよい。効率よ
くアデノシンリン酸デアミナ−ゼを失活させる点から、
コホルマイシン溶液の添加は、例えば下記の条件で行な
うことができる。

【００７３】（１）コホルマイシンの終濃度：１００p
Ｍ以上、特に１０nＭ〜１ｍＭであることが好ましい） （２）反応時間：約２秒以上、特に１０秒〜２分が好ま
しい） ３．細胞内ＡＴＰの抽出 測定感度の向上のため、細胞内ＡＴＰの測定に先立ち、
該ＡＴＰを細胞外に抽出することが好ましい。

【００７４】ＡＴＰの抽出法は特に限定されないが、例
えば、ＡＴＰ抽出試薬を試料に添加する方法が採用され
る。ＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、エタノールとア
ンモニアの混合液、メタノール、エタノール、界面活性
剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリ
トンＸ１００等）水溶液、トリクロル酢酸水溶液、過塩
素酸水溶液等が使用できる。

【００７５】なお、コホルマイシンを試料に添加する工
程と、細胞内ＡＴＰの抽出工程とを同時に行ってもよ
い。その場合は、アデノシンリン酸デアミナーゼにより
試料中のバックグラウンドＡＴＰを分解した後、該試料
にコホルマイシンを含む抽出試薬を添加すればよい。 ４．細胞内ＡＴＰの測定 試料中のアデノシンリン酸デアミナーゼを失活させた
後、細胞内ＡＴＰを測定する。細胞内ＡＴＰの測定法は
特に限定されないが、例えば、ルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ発光反応を利用する方法が使用できる。その場合
は、以下の（イ）〜（ハ）の物質を含むルシフェリン-
ルシフェラーゼ発光試薬を試料に添加し、生じた光の発
光量を測定すればよい。

【００７６】（イ）ルシフェリン （ロ）ルシフェラーゼ （ハ）マグネシウムイオン また、ＡＴＰ変換反応を利用して細胞内ＡＴＰを測定す
る場合は、ＡＴＰ変換反応試薬とルシフェリン-ルシフ
ェラーゼ発光試薬との混合試薬を調製し、該試薬を試料
に添加すればよい。その場合、以下の（イ）〜（ヘ）の
物質を含む発光試薬を試料に添加し、生じた光の発光量
を測定すればよい。

【００７７】（イ）ＰＰＤＫ （ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸 （ハ）ピロリン酸 （ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン （ホ）ルシフェリン （ヘ）ルシフェラーゼ 具体例２：（阻害剤がコホルマイシン、拭き取り検査に
おける検体溶液が試料であり、かつ試料中に含まれるＡ
ＴＰが標的ＡＴＰであって、標的ＡＴＰをＡＴＰ変換反
応を利用する方法により測定する場合） 使用する試薬：以下の（イ）〜（ヘ）の物質を含むＰＰ
ＤＫ発光試薬 （イ）ＰＰＤＫ （ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸 （ハ）ピロリン酸 （ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン （ホ）ルシフェリン （ヘ）ルシフェラーゼ １．試薬中のバックグラウンドＡＴＰの分解 ＰＰＤＫ発光試薬にアデノシンリン酸デアミナ−ゼ溶液
を添加して、ＰＰＤＫ発光試薬中のバックグラウンドＡ
ＴＰおよびアデノシンリン酸エステルを分解する。 ２．コホルマイシンによるアデノシンリン酸デアミナ−
ゼの失活 アデノシンリン酸デアミナ−ゼを含むＰＰＤＫ発光試薬
にコホルマイシン溶液を添加し、アデノシンリン酸デア
ミナ−ゼを失活させる。 ３．標的ＡＴＰの測定 ＰＰＤＫ発光試薬に試料を添加する。ＰＰＤＫ発光試薬
と、試料中の標的ＡＴＰとの接触によりルシフェリン-
ルシフェラーゼ発光反応が起こる。生じた発光の発光量
を測定することにより標的ＡＴＰが測定される。ＰＰＤ
Ｋ発光試薬中にはＡＴＰ変換反応に関与する物質が含ま
れているので、発光量が増加し、かつ発光が長時間持続
する。

【００７８】

【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する。
なお、本発明は実施例により限定されない。

【００７９】〔実施例1〕：（コホルマイシンによるア
デノシンリン酸デアミナ−ゼの失活、およびコホルマイ
シンのルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応に与える
影響に関する実験） （１）本発明 アデノシンリン酸デアミナーゼ（Aspergillus属由来）
を0.05U/mlで含有する蒸留水をサンプル液とした。サン
プル液100μlに150μＭのコホルマイシン（ＣＡＬＢＩ
ＯＣＨＥＭ社製）溶液を5μl添加して、３０秒放置した
後、2x10^-9 MのATP溶液を添加した。次いで、キッコー
マン社製ルシフェールLUを100μl添加し、発光量（ＲＬ
Ｕ）の経過をベルトールド社製Lumat LB9501にて２秒
ごとに計測した。

【００８０】（２）比較例 コホルマイシンを添加しない比較例として、サンプル液
100μlに蒸留水を5μl添加して、３０秒放置してから2x
10^-9 M のATP溶液を添加した。そして、キッコーマン
社製ルシフェールLUを100μl添加した。発光の経過を上
記と同様に計測した。

【００８１】（３）対照 対照として、蒸留水100μlに蒸留水を5μl添加して、３
０秒放置してから2x10^-9 M のATP溶液を添加した。そ
して、キッコーマン社製ルシフェールLUを100μl添加し
た。発光の経過を上記と同様にして測定した。 （４）結果 結果を図１に示す。

【００８２】比較例では、アデノシンリン酸デアミナ−
ゼによりATPが分解されるので発光の減衰が大きい。一
方、本発明では、コホルマイシンによりアデノシンリン
酸デアミナ−ゼが失活するのでサンプル液に添加したAT
Pが分解されず、発光の減衰が少ないことがわかる。

【００８３】本発明と対照とを比較すると、コホルマイ
シンは、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応を阻害
しないことがわかる。

【００８４】コホルマイシンの使用により、標的ＡＴＰ
の測定を阻害することなくアデノシンリン酸デアミナ−
ゼを失活させることが可能となることがわかる。 〔実施例２〕：（標的ＡＴＰの測定法がＡＴＰ変換反応を利用する方法である場 合の実験例） 試薬：ＰＰＤＫ発光試薬 ルシフェリン 0.5ｍＭ ゲンジボタルルシフェラーゼ 1.5mg/ml ＰＰＤＫ（Microbispora thermorosea IFO14047由来） 0.6U/ml ホスホエノールピルビン酸 1.4ｍＭ EDTA 2Na 1.0mM ジチオスレイトール 1.0ｍＭ 硫酸マグネシウム 15ｍＭ 硫酸アンモニウム 2.5ｍＭ ピロリン酸ナトリウム 14μＭ シュークロース 0.37％ アデノシンリン酸デアミナーゼ（Aspergillus属由来） 0.1U/ml HEPES 50mM(pH7.0)

【００８５】（１）本発明 ＰＰＤＫ発光試薬100μlに300μMコホルマイシン（ＣＡ
ＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）溶液を5μl添加して30秒放置
し、ＰＰＤＫ発光試薬中のアデノシンリン酸デアミナ−
ゼを失活させた。

【００８６】ＰＰＤＫ発光試薬に4x10^-10 MATP溶液を1
0μl添加し、発光の経過をベルトールド社製Lumat LB9
501にて２秒ごとに計測した。 （２）比較例 コホルマイシンを添加しない比較例として、300μMコホ
ルマイシン溶液の代わりに、超純水5μlを添加する以外
は上記（１）と同様にして、発光を計測した。 （３）結果 結果を図２に示す。

【００８７】比較例では、ＰＰＤＫ発光試薬中のアデノ
シンリン酸デアミナーゼにより測定系中のATPやAMPが分
解され、わずか５分間で発光が減衰してしまう。一方、
本発明ではＰＰＤＫ発光試薬中のアデノシンリン酸デア
ミナーゼが失活されることにより、ＡＴＰ変換反応が行
われるので、発光が長時間にわたって持続する。

【００８８】本発明は、ＡＴＰ変換反応を利用する標的
ＡＴＰの測定法において好適に使用されうることが分か
る。 〔実施例３〕：（細胞内ＡＴＰの測定による、大腸菌の
細胞数の測定） 使用する試薬：ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光試薬 ルシフェリン 0.5ｍＭ ゲンジボタルルシフェラーゼ 1.5mg/ml 硫酸マグネシウム 10ｍＭ EDTA 2Na 1.0mM ジチオスレイトール 1.0ｍＭ シュークロース 0.37％ HEPES 50ｍＭ(pH 7.5) （１）本発明 標準培地（酵母エキス0.25％、グルコース0.1％、トリ
プトン0.5％、pH7.1)8ｍｌに大腸菌（Escherichia col
i NISL B-4300）を一白金耳植菌し、３５℃で一晩静
置培養した。培養液を、新しい標準培地にて10000倍希
釈し、希釈液を試料とした。

【００８９】試料に、終濃度1.0U/mlとなるようにアデ
ノシンリン酸デアミナーゼ（Aspergillus属由来）溶液
を添加して３５℃で30分静置し、試料中のバックグラウ
ンドＡＴＰを分解した。

【００９０】試料１００μlに、300μMコホルマイシン
（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）溶液を5μl添加し、30秒
後にキッコーマン社製ATP抽出試薬100μlを添加した。
さらに20秒後にルシフェリン-ルシフェラーゼ発光試薬
を100μl添加して、キッコーマン社製ルミテスターK-10
0にて発光量を測定した。

【００９１】あらかじめ作成したATP検量線より細胞内
ＡＴＰ量を求めたところ、1.93x10^-13mol/mlであった。
この値をあらかじめ求めた、一細胞あたりのATP量4x10
^-18molで割って、細胞数を求めたところ、48300 CFU/m
lであった。

【００９２】なお、一細胞あたりのATP量は、標準培地
中のバックグラウンドATPをアデノシンリン酸デアミナ
ーゼで分解し、オートクレーブでアデノシンリン酸デア
ミナーゼを失活させた培地を使用して求めた。 （２）比較例１ コホルマイシン300μMの溶液を5μl添加する代わりに、
超純水を5μl添加して上記と同様に細胞内ATP量を求め
たところ、3.67x10^-14molであった。この値を一細胞あ
たりのATP量4x10^-18 molで割って、細胞数を求めたと
ころ、9180 CFU/mlであった。 （３）比較例２ アデノシンリン酸デアミナ−ゼ溶液およびコホルマイシ
ン溶液の代わりに、超純水を使用した以外は上記（１）
と同様の操作を行い、細胞内ATP量を求めた。しかしな
がら、培養液に含まれていたバックグラウンドＡＴＰに
由来する強い発光が生じたため、細胞数の測定は不可能
であった。 （４）対照 上記試料を、標準寒天培地（酵母エキス0.25％、グルコ
ース0.1％、トリプトン0.5％、寒天1.5％、pH7.1)を用
いて、混釈培養法により、35℃で２日間培養して細胞数
を求めたところ、48600CFU/mlであった。 （４）結果 本発明では、抽出された細胞内ATPが分解されることな
く測定できる。従って、本発明の結果は、混釈培養法
（対照）により求めた細胞数と良く一致した。

【００９３】しかしながら、比較例１では、試料中のア
デノシンリン酸デアミナーゼにより、抽出された細胞内
ATPが分解されてしまう。このため、比較例の結果は、
混釈培養法により求めた細胞数に比べ大幅に少なかっ
た。

【００９４】 実施例4（細胞内ＡＴＰの測定による、濾過膜に捕捉された酵母の細胞数の測 定） 試薬 ・ＰＰＤＫ発光試薬 ルシフェリン 0.5ｍＭ ゲンジボタルルシフェラーゼ 1.5mg/ml ＰＰＤＫ（Microbispora thermorosea IFO14047由来）0.6U/ml ホスホエノールピルビン酸 1.4ｍＭ EDTA 2Na 1.0mM ジチオスレイトール 1.0ｍＭ 硫酸マグネシウム 15ｍＭ 硫酸アンモニウム 2.5ｍＭ ピロリン酸ナトリウム 14μＭ シュークロース 0.37％ HEPES 50mM(pH7.0) ・ＡＴＰ抽出試薬 エタノール９０％ 水酸化アンモニウム１％ コホルマイシン ０．０１５ｍＭ

【００９５】（１）本発明 サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e, NISL Y-3398)をＹＭ培地（1％グルコース、0.5％
ペプトン、0.3％酵母エキス、0.3％モルトエキス、ｐＨ
6.0）を用いて一晩培養を行い、培養液を市販のビール
で希釈した。得られた希釈液を試料とした。

【００９６】濾過膜（日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メン
ブレンフィルター：0.45μｍ疎水性格子入り、直径47ｍ
ｍ）を装着した濾過器に5ｍｌの超純水を加え、さらに
試料0.1ｍｌを加えてから吸引濾過した。さらに超純水1
0ｍｌを用いて２回洗浄した後、0.5U/mlのアデノシンリ
ン酸デアミナーゼ（Aspergillus属由来）溶液５ｍｌに
濾過膜を１０分間浸漬した。

【００９７】さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ溶液
（0.01U/ml）５ｍｌにて濾過膜を洗浄した後、ＡＴＰ抽
出試薬を松下電工製超音波式噴霧器（EW622)にて１０秒
間噴霧した。次いで濾過膜を50℃で乾燥させた。

【００９８】濾過膜上に、ＰＰＤＫ発光試薬を１０秒間
噴霧した後、５分間放置した。次いで、浜松ホトニクス
社製ARGUS 50にて濾過膜状の発光を１０分間蓄積させ
た後、画像処理を行い、テレビモニター上で閾値以上の
輝点のみを撮像し細胞数を求めた。細胞数は４１であっ
た。 （２）比較例１ コホルマイシンを含まないＡＴＰ抽出試薬を用いた以外
は、上記（１）と同様の操作を行い、濾過膜上の細胞数
を求めた。細胞数は０であった。 （３）比較例２ アデノシンリン酸デアミナ−ゼ溶液およびコホルマイシ
ン溶液の代わりに蒸留水を使用した以外は上記（１）と
同様の操作を行い、濾過膜上の細胞数を求めた。しかし
ながら、ビールに含まれていたバックグラウンドＡＴＰ
に由来する強い発光が濾過膜全体に生じたため、細胞数
の測定は不可能であった。 （４）対照 上記試料を、ＹＭ寒天培地上、３５℃で４８時間培養し
て、細胞数を求めた。細胞数は３９であった。 （５）結果 比較例１では、標的ＡＴＰおよび発光反応において生成
したＡＭＰが、アデノシンリン酸デアミナ−ゼにより分
解されるので、発光が短時間で減衰し、輝点が出現しな
かった。

【００９９】一方、本発明では、コホルマイシンにより
アデノシンリン酸デアミナ−ゼが失活してＡＴＰ変換反
応が継続するので、発光量および発光時間が増大し、輝
点が出現した。また、本発明の結果は、ＹＭ寒天培地を
用いて求めた細胞数と良く一致した。

【０１００】

【発明の効果】本発明ではアデノシンリン酸デアミナ−
ゼにより、測定系に存在するバックグラウンドＡＴＰが
効率的に分解され、該アデノシンリン酸デアミナ−ゼ
は、阻害剤（標的ＡＴＰの測定を阻害しない物質、例え
ば、コホルマイシン）の添加により失活する。アデノシ
ンリン酸デアミナーゼとコホルマイシンとを組み合わせ
て用いることにより、バックグラウンドＡＴＰによる影
響（測定感度の低下等）を受けない標的ＡＴＰの測定が
可能となる。

【０１０１】本発明により、バックグラウンドＡＴＰを
ＡＴＰ分解酵素により分解する工程を含む標的ＡＴＰの
測定法において、標的ＡＴＰの測定を阻害することなく
ＡＴＰ分解酵素を失活させることを特徴とする標的ＡＴ
Ｐの測定法が提供され、また、該標的ＡＴＰの測定法に
用いられる試薬キットが提供された。

【０１０２】本発明は、各種工業分野、特に、食品衛生
・バイオ・臨床検査・医学などの現場における標的ＡＴ
Ｐの測定法として好適に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の方法における発光量の経時変化

【図２】実施例２の方法における発光量の経時変化

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程を含むことを特徴とする標的Ａ
   ＴＰの測定法 （１）測定系に存在するバックグラウンドＡＴＰを、ア
   デノシンリン酸デアミナ−ゼにより分解する工程。 （２）上記アデノシンリン酸デアミナ−ゼを阻害剤によ
   り失活させる工程。 （３）標的ＡＴＰを測定する工程。
2. 【請求項２】標的ＡＴＰを測定する方法がルシフェリン
   −ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法である、請求
   項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】標的ＡＴＰを測定する方法がＡＴＰ変換反
   応を利用する方法である、請求項１に記載の測定法。
4. 【請求項４】以下の工程を含むことを特徴とする細胞内
   ＡＴＰの測定法 （１）細胞を含む試料にアデノシンリン酸デアミナーゼ
   を添加して、試料中のバックグラウンドＡＴＰを分解す
   る工程。 （２）バックグラウンドＡＴＰを分解した後の試料に阻
   害剤を添加して、試料中のアデノシンリン酸デアミナー
   ゼを失活させる工程。 （３）細胞内ＡＴＰを測定する工程。
5. 【請求項５】以下の工程を含むことを特徴とする細胞内
   ＡＴＰの測定法。 （１）細胞を含む試料にアデノシンリン酸デアミナーゼ
   を添加して、試料中のバックグラウンドＡＴＰを分解す
   る工程。 （２）バックグラウンドＡＴＰを分解した後の試料に阻
   害剤を添加して、試料中のアデノシンリン酸デアミナー
   ゼを失活させる工程 （３）細胞内ＡＴＰを抽出する工程 （４）抽出された細胞内ＡＴＰを測定する工程。
6. 【請求項６】細胞内ＡＴＰを測定する方法がルシフェリ
   ン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法である、請
   求項４または５に記載の測定法。
7. 【請求項７】細胞内ＡＴＰを測定する方法がＡＴＰ変換
   反応を利用する方法である、請求項４または５に記載の
   測定法。
8. 【請求項８】以下の成分を含むバックグラウンドＡＴＰ
   分解用試薬キット。 （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤
9. 【請求項９】以下の成分を含む標的ＡＴＰ測定用試薬キ
   ット。 （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 （３）標的ＡＴＰの測定に関与する物質
10. 【請求項１０】以下の成分を含む標的ＡＴＰ測定用試薬
    キット。 （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 （３）ルシフェラーゼ （４）ルシフェリン （５）マグネシウムイオン又は他の金属イオン
11. 【請求項１１】以下の成分を含む標的ＡＴＰ測定用試薬
    キット。 （１）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ （２）阻害剤 （３）ルシフェラーゼ （４）ルシフェリン （５）ピルベ−トオルトフォスフェ−トジキナ−ゼ （６）ホスホエノ−ルピルビン酸 （７）ピロリン酸 （８）マグネシウムイオン又は他の金属イオン