JPH0262941A - 細胞内の物質測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は体細胞や菌体内に存在する物質を測定する方法
に関するものである。

Ｂ０発明の概要 本発明は、細胞膜を有機溶剤により破壊して細胞内の被
測定物質を抽出し、その後この物質を例えば光学的手法
により測定する方法において、被測定物質の抽出を室温
で行うと共に、有機溶剤の乾燥除去処理を省略すること
によって、操作及び装置の簡略化を図ったものである。

Ｃ０従来の技術 細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定量的
に測定することにより有効な知見を得ることができる。

例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネルギ
ー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。また１個の細胞中に存在するＡＴＰ
量は、同一細胞では同一濃度のＡＴＰが存在する。従っ
てＡＴＰが定量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞
かの判定や細胞の活性度が測定できることになる。

また水道原水中や大気浮遊粉塵中には、種々の発癌関連
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ａｍｅｓ法またはその変法を用いた復帰突然変異試験が
広く使用されている。これらの短期テストは方法が簡便
で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質のＤ
ＮＡ傷害を短時間に検出する有効な短期テストがいくつ
か提出されている。これらの短期テストは、特定の菌と
化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がＤＮＡ
傷害を誘起し、それに伴って生じるＳＯ８反応をβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ活性から求める方法である。従って
菌体内に発生したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定
することができれば、化学物質が発癌関連物質であるか
否かの判定ができることになる。

このように細胞内に存在する物質または生成した物質を
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。

そこで抽出方法の１つとして有機溶剤を抽出剤として用
いる方法を検討している。この方法を簡単に説明すると
、先ず試料１ｍ１２に有機溶剤であるエタノール（９９
，５％）５ｍｆ２を混合し、この混合液を沸騰（７８℃
）させながら１分間振盪して目的物質を抽出する。次い
で有機溶剤を除去するために１０分間送風乾燥処理を行
い、５ｍ１２の蒸留水に溶解して抽出液を希釈し、試料
中の目的物質を測定する。

Ｄ２発明が解決しようとする課題 この方法は目的物質の抽出率が高い反面、次のような問
題点がある。

■温度ショックによる抽出効率の向上および目的物質を
測定するときに妨害となるおそれのある有機溶剤の除去
を期待し、沸騰条件での抽出を行っている。しかしこの
条件ではヒータ、水浴等の装置を必要とすること、また
準備時間を必要とし、操作が複雑化することなどの問題
がある。

■■で述べた理由から、窒素ガスなどを用いた通気、送
風あるいは減圧蒸留などの方法で有機溶剤の除去を行っ
ている。しかし有機溶剤の除去を行った場合特別な装置
が必要となる。また操作の面でも複雑化し、この工程の
みで５〜ｌＯ分を費やしてしまう。

■有機溶剤がアルコールの場合、抽出を８０容…％以上
のアルコール濃度で行っているが、目的物質の抽出量が
最大となるような最適濃度範囲については、過去に定量
的な実験がなされていないため不明である。

本発明の目的は、操作が簡単であって短時間で測定する
ことかでき、しかも使用する装置の数が少なくて済む抽
出方法を提供することにある。

また本発明の他の目的は、有機溶剤としてアルコールを
用いた場合、目的物質の抽出量の多い抽出方法を提供す
ることにある。

８３課題を解決するための手段 本発明は、細胞と有機溶剤とを混合し、その混合液を室
温で振盪することにより細胞膜を破壊して細胞内の被測
定物質を抽出し、次いでその抽出液を希釈した後被測定
物質を測定することを特徴とする。

他の発明は、有機溶剤としてアルコールを用い、抽出時
のアルコール畠度が約７０容量％であることを特徴とす
る。

Ｆ、実施例 （実施例１；有機溶剤としてエタノールを用いたときの
大腸菌中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の測定） 大腸菌を含む水溶液（試料）０．５ｒｒｌにエタノール
（８０容量％）２．５ｒｒｌを混合した後１０秒間振盪
し、蒸留水により１０ｍ１２となるように希釈し、生物
発光法によりＡＴＰを定量した。この生物発光法は、以
下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼ
との反応により発生する光の量、具体的には３０秒間の
発光量の積分値にもとづいてＡＴＰの量を知る方法であ
り、簡便で高感度な測定法である。なおホタルの光はこ
れに相当する。

ルシフＩラーゼ ＡＴＰ＋ルシフェリン　　−一一一一一一一一令　７デ
ニルルシ７エリンアブニルルシフエリン＋０２−一−−
−−−−−−◆　アｆニルオＮシルシフェリン十光第１
図は、試料としてＡＴＰ標準液を用い、当該実施例の方
法によりＡＴＰの量を測定した場合の検量線の一例であ
る。またエタノールの初期濃度を調整することによって
、抽出時のエタノール濃度（容量％）を変え、その濃度
とＡＴＰ抽出量との関係を調べたところ、第２図に示す
結果が得られた。この結果から抽出時のエタノール濃度
の最適値は約７０容量％であることがわかる。振盪時間
の影響についても調べたところ、ｌＯ秒間程度が最適で
あった。このような実施例の方法によって発光量から検
量線を介してＡＴＰ抽出１ｔ（ａ度）を求め、このＡＴ
Ｐ抽出量と菌体濃度との関係を調べたところ、第３図に
示すような直線性が得られた。従って抽出が良好に行わ
れていることが裏付けられている。

（実施例２；有機溶剤としてクロロホルムを用いたとき
の大腸菌中のＡＴＰの測定） 実施例１と同様の試料０．５ｍＱにクロロホルム（９８
容量％）０２ｍｇを加えた他は実施例１と同様の操作を
行い、ＡＴＰ抽出量と菌体濃度との関係を調べた。結果
は第４図に示すとおりであり、抽出が良好に行われてい
ることが裏付けられている。

（実施例３；有機溶剤としてエタノールを用いたときの
大腸菌中に生成したβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ活性の測
定） 大腸菌をＬＢ培地（各種の栄養分を備えた培地）で−夜
培養し、その培養液を波長６００　ｎｍにおける吸光度
がＯｌｌ　になるようにＬＢ培地で希釈調製する。こう
して得られた試験液３．０ｍ１２にＤＮＡ損傷を引き起
こす化学物質０．０５ｍＣを加え、３７℃で２時間培養
する。これにより大腸菌中にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が生成する。次いで培養した試験液１．０ｍ１２にエタ
ノールを加えてエタノール濃度が７０容量％になるよう
に調製し、１０秒間振盪した後５分間静置した。しかる
後にこの反応液０．２５ｍｆＪに０．１ｍｏＱ／＜２の
Ｎａ−ＰＢＳ（リン酸緩衝液）２．２５ｍ（２，０、１
ｍＱ／（ｌのＮａＮ０．５ｍｆ２，０．２５ｍｏ１２／
Ｉのラクトース１．０ｍｆ２及び６Ｕ／ｍ１２（Ｕとは
酵素活性を表す単位である。）のグルコースオキシダー
ゼ１−を加え、３７℃で２時間酵素反応させた。なおＮ
ａＰＢＳ２．２５ｍ、ｆ２を加えた理由は、ラクトース
とクシレコースオキシダーゼと反応液との比率を一定に
するためである。その後この酵素反応液０゜２ｍＱに２
　Ｘ　１０−７ｍｏＱ／　Ｑのルミノール０．５ｍ１２
と６　Ｘ　１０−３ｍ　ｏ　Ｑ／Ｑのフェリシアン化カ
リウム０．５ｍｇを加え、１秒後から３０秒間の発光量
を計測した。

ここで上記のプロセス中の酵素反応と化学発光反応とは
次の通りである。

く酵素反応〉 α−Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　β
−Ｄ−グルコース〈化学発光反応〉 第５図は既知量のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性と発光
量との関係を示す検量線であり、図中の黒丸は当該実施
例の抽出法によって菌から抽出した測定結果である。

以上において、本発明の対象となる細胞は、微生物ある
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類あ
るいは原生動物等が挙げられる。

抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。

有機溶剤としては、エタノールやブタノール等のアルコ
ール、アセトンあるいはクロロホルム等を用いることが
できる。

抽出した物質については、生物発光法や化学発光法を利
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。

Ｇ９発明の効果 本発明によれば、沸騰状態で抽出するのではなく室温で
抽出しているため、水浴ヒータ等の加温装置が不要とな
り、操作も簡略化することができ、更に自動化する場合
にも容易となった。また高温で変性しやすい物質につい
ても抽出が可能となった。

窒素ガスなどによる通気、送風、あるいは減圧蒸留など
により有機溶剤を蒸発させるといった除去操作を省略す
ることによって感度の低下は認められなかったので、除
去操作及びこの操作のための装置が不要となり、かつ処
理時間の短縮が可能となった。

既に検討している方法では、抽出時エタノール濃度が８
０容量％以上であったが、本発明では最大の消毒、殺菌
力を示す７０容量％程度に設定したため、目的物質の抽
出量が増加し、より一層精度の高い測定ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＴＰの検量線を示すグラフ、第２図はＡＴＰ
抽出量とエタノール濃度との関係を示すグラフ、第３図
及び第４図は各々菌体濃度とＡＴＰａ度との関係を示す
グラフ、第５図はβ−Ｄガラクトシダーゼ活性の検量線
を示すグラフであ第１図 ＡＴＰの検量線 ＡＴ＋４度（ｍｏｌ／ｌ） 第３図 菌体ａ変とＡＴＰａ度との関係図 菌体濃度（ｃｅ ｓ／＋Ｌｂｅ） 第４図 菌体濃度とＡＴＰ濃度との関係図 菌体濃度（ｃｅｌｌｓ／ｌシｂｅ） 手続補正書０．え。 平成１　年　５月１０日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞と有機溶剤とを混合し、その混合液を室温で
   振盪することにより細胞膜を破壊して細胞内の被測定物
   質を抽出し、次いでその抽出液を希釈した後被測定物質
   を測定することを特徴とする細胞内の物質測定方法。
2. （２）細胞とアルコールとを混合し、その混合液を室温
   で振盪することにより細胞膜を破壊して細胞内の被測定
   物質を抽出し、次いで抽出液中の被測定物質を測定し、 抽出時のエタノール濃度は７０容量％であることを特徴
   とする細胞内の物質測定方法。