JP4901005B2 - 細胞アッセイ、方法及び試薬 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、溶解真核細胞の内容物の存在を検出するための方法、及びこの方法を使用する手順に関する。かかる方法は、試料中のそのような細胞の存在を検出する、あるいは試料中の細胞の状態又は完全性をモニターする上で有用であり、例えば生化学的又は製薬学的研究、診断又は製品スクリーニングの場において、幅広い適用を持つ。
【０００２】
すべての生存生物は化学エネルギ−のソースとしてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用しており、ＡＴＰが推進するルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を用いてこれを検定することが知られている。この酵素反応によって生成される光をルミノメ−タによって測定し、存在するＡＴＰの量に関係づけることができる。細菌数の指標としてのＡＴＰの有用性は１９６０年代の中頃から知られており（ＡＴＰ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｓｔａｎｌｅｙら編集；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．１−１０参照）、その主たる利点は速さと感受性である。このアッセイ様式を使用すると、簡単なサンプルはおよそ数分間で分析でき、複雑なものでも、１０^−１１ｍｏｌ／ｌ ＡＴＰまで提供する検出能力で、常套的に３０分しかからない。
【０００３】
一部の哺乳類及び植物組織における活性を測定するために（植物に関してはＲｏｄｉｏｎｏｖａら、Ｆｉｚｉｏｌｏｇｉｙａ Ｒａｓｔｅｎｉｉ（１９７８）２５，４，ｐ．７３１−７３４）、ルシフェラーゼ／ルシフェリン系を使用してアデニレートキナーゼを検定することが知られている（Ｂｒｏｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １（１９７９）１６３−１６９参照）。
【０００４】
アッセイの標的を、ＡＴＰから、ＡＴＰを生成するように作製することができる特定の酵素、アデニレートキナーゼ（ＷＯ ９６／１７２０２号及びＷＯ ９６／０２２６５号）に変えることによって、微生物を検出するためのＡＴＰに基づく方法の速さと感受性が有意に高められた。アデニレートキナーゼは、アデニレ−ト、アデノシン一リン酸（ＡＭ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の相互変換のためにすべての微生物が使用する酵素である。反応は、
ＡＴＰ ＋ ＡＭＰ ←→ ＡＤＰ
として表わすことができる。
【０００５】
精製ＡＤＰが過剰に存在する場合は、反応をＡＴＰの生成へと推進することができる。例えば洗浄剤によって微生物を慎重に溶解したあと、生物発光エンドポイントアッセイによって細胞内マーカであるアデニレートキナーゼを検出することができる。
【０００６】
本発明の出願者は、かかるテクノロジーを他の分野、特に製薬学的あるいは生化学的研究及び製品スクリーニングに適用する方法を発見した。
【０００７】
インビトロでの細胞アッセイは、多様な疾患を探求する、あるいは試薬又は環境条件の影響を検討する研究室において広く実施されている。これらのアッセイの多くでは、細胞溶解が検出すべき「エンドポイント」である。これは、例えば化学的又は生化学的作用物質の腫瘍細胞への作用が重要な関心事である抗癌剤の検出にも当てはまる。そのような場合、スクリーニングの指標の検出は培養中の比較的数少ない細胞溶解に基づくと考えられる。これらの指標は、例えば化学修飾によってさらに至適化することができる。
【０００８】
多くの場合治療の標的は、壊死又はアポトーシスのいずれかによって癌細胞の死滅を生じさせることである。癌細胞における異常性は、それらが通常のプログラムされた細胞死又はアポトーシスを受けないことを意味する。それ故、一部の癌治療は癌細胞においてアポトーシスを誘導することを目指している。そのような治療は、細胞毒よりも正常細胞を損傷する可能性が低いからである。
【０００９】
細胞溶解を検出するその他のアッセイは、細胞傷害特性に関してスクリーニングするためのインビトロ毒性試験、あるいは溶解ウイルス又は大腸菌Ｏ１５７からのベロ毒素のような細菌毒素の検出を含む。
【００１０】
また一部の場合には、特定の作用物質又は環境要因が細胞の全般的状態に及ぼす影響を検討する。特定作用物質又は環境要因の組合せの存在下で細胞が溶解しないこともありうるが、その全般的状態と健常性、そして特に細胞が分裂して成長しているかどうかに関して影響を受けると考えられる。例えば成長因子の存在下では成長が増大するが、細胞にストレスを与える作用物質又は状態の存在下では成長が阻害されうる。この種のアッセイは、例えば成長因子をスクリーニングするため、あるいは治療又は診断目的に必要とされるような、アポトーシスを阻害することを意図された化合物の有害作用のスクリーニングのために使用される。
【００１１】
現在、そのようなアッセイは一般に、例えばアポトーシスの結果として細胞溶解が起こきたかどうかを調べるために、細胞を含むスライドの顕微鏡検査を必要とする。これは多大の時間と労力を要する。エンドポイントを検出する代替的な方法は、最初に細胞に導入しておかねばならない、Ｃｒ^＊のような放射性トレ−サの放出を測定することを含む。やはりこれも時間がかかって難しく、また放射標識を使用するときの安全性の問題が重要である。
【００１２】
さらに別の場合には、乳や尿のような正常であれば細胞不含の体液中での細胞の検出が、乳腺炎のような疾患状態の指標となりうる。現在これらの細胞アッセイは、液体のサンプルの顕微鏡検査、放射性チミジンの細胞への取り込み、又は比色定量シグナルを生じる酵素アッセイを含めた様々な方法で実施されうるが、より感受性の高い検出方法は、速やかで正確な診断の助けとなるであろう。
【００１３】
本発明は、（ｉ）アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を、細胞アデニレートキナーゼによってＡＤＰがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することができる条件下でサンプルに加え、
（ｉｉ）当該サンプルにおいてＡＴＰを検出し、それをアデニレートキナーゼの存在、従って溶解細胞の存在に関連づける
ことを含む、サンプル中の溶解真核細胞の存在を検出するための方法を提供する。
【００１４】
当該方法において使用するサンプルは、真核細胞試料又は真核細胞を含む可能性のあるサンプルである。細胞試料は細胞培養を含む。ここで使用するとき、「細胞培養」の語は、インビトロで維持されている多細胞生物からの真核細胞を指す。それには腫瘍細胞培養のハイブリドーマ、組換え細胞系及び健常組織細胞系が含まれるが、微生物は除外される。
【００１５】
細胞が培地中で溶解を受けるとき、細胞を構成するヌクレオチド、糖類及び蛋白質のカクテルを放出する。細胞中に存在するＡＴＰとＡＤＰの両方が放出されるが、溶解する細胞数が少ない場合には、これらの成分の量も少なくなる。これらの状況下でのＡＴＰの検出は困難であろう。
【００１６】
しかしながら、細胞が溶解を受けるときに放出されるアデニレートキナーゼは、過剰のＡＤＰの存在下でＡＤＰがＡＴＰに変換するのを触媒する。そのような過剰のＡＤＰを導入することにより、アデニレートキナーゼは平衡をＡＴＰの生成へと推進し、今度は検出して定量するのに十分なレベルのＡＴＰが存在することになる。それ故サンプルから生じるシグナルが増幅され、はるかに感受性の高いスクリーニングを実施することが可能となる。これは、非常に小量のサンプルを使用するハイスループットスクリーニングプロセスの状況において特に有用である。標準的な９６穴マイクロタイタープレートは、３８４や１５３６といったより多くのウエルを備えたプレートに取って代わられつつあるが、それらはウエルの多さに比例して保持できるサンプルの量が小さくなる。
【００１７】
適切には、検出されるＡＴＰの量を、当該培地中のＡＤＰのＡＴＰへの変換を触媒することができる遊離酵素の量に関連づける。これは当該技術において慣例的な算定法又は検定法によって実施できる。
【００１８】
アデニレートキナーゼはＡＤＰあるいはＡＴＰよりも少ない量で存在するが、細胞に関する生物学的マーカとしての使用は、それが生成するＡＴＰを通してその存在を測定することにより、典型的には４００，０００の増幅が可能な増強された感受性を提供する；すなわち、存在する酵素の１モルにつき４００，０００モルのＡＴＰが１０分間のインキュベーションでＡＴＰに変換される。従って、それが触媒する反応の基質又は産物を測定することによる酵素の評価は、１０^−２０モルという低さまでの検出を提供する。１個の哺乳類細胞のアデニレートキナーゼ含量はこれよりもかなり多い。
【００１９】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は従来の様々な方法によって検出できる。好ましくは、サンプル中のＡＴＰの量の指標となる、光度測定によって検出可能なシグナルを提供するルシフェリン／ルシフェラーゼ系を使用して検出する。ルシフェリン／ルシフェラーゼの調製及びＡＴＰの検定において使用するための方法は当業者には周知であり、市販のものが入手できる（例えばＢｒｏｌｉｎら参照）。典型的な製剤は、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｌのルシフェラーゼ、１０００μｍｏｌ／ｌのＤ−ルシフェリン、及びＭｇＣｌ_２、ＥＤＴＡ、ＢＳＡのような作用物質、そしてｐＨ７の緩衝液を含む（例えばＥＰ ０５４６７６号参照）。
【００２０】
ＡＤＰからＡＴＰへの変換はマグネシウムイオンの存在を必要とする。すべての細胞がこのイオンをある程度含むので、本発明の方法は必ずしもその添加を必要としないが、変換率を改善するため、そしてまたマグネシウム欠如サンプルを同様に検定して、十分なマグネシウムイオンを含むサンプルと同等のシグナルを生じるように反応条件を基準化するためには、明らかにマグネシウムイオンの添加が好ましいであろう。マグネシウムイオンの添加はアッセイの感受性と信頼性を高める。
【００２１】
存在するマグネシウムの量は、好ましくは、ＥＤＴＡのようなキレ−ト化剤の存在を考慮に入れても、すべてのＡＤＰ分子が少なくとも１個のマグネシウムイオンに結合することができるように、少なくともＡＤＰ１モルにつきマグネシウム１モルを提供するのに十分な量である。
【００２２】
特に、当該方法は、細胞試料、例えば細胞培養中の細胞の完全性をモニターするために使用できる。上述したように、本発明の方法を使用しうる、エンドポイントが細胞溶解である様々なスクリーニング方法が存在する。これらの方法では、検討する細胞培養を、試験条件の結果として生じる細胞溶解が確実に起こることを保証するのに適切な期間、試験条件下でインキュベートする。
【００２３】
試験条件は実施するアッセイの性質に依存する。それらは、化学物質（有機又は無機）のような作用物質の存在、生物学的又は生化学的試薬並びに温度、ｐＨ、圧、照射、あるいは細胞の生育可能性に影響を及ぼしうる他の環境要因を含みうる。しかしながら、特に、培養中で細胞溶解を生じさせることができるような条件は、細胞への溶解作用を有する可能性がある、ペプチド、蛋白質及びウイルスを含めた化学物質又は生化学物質のような作用物質の添加を含む。それらは腫瘍細胞のような特定の細胞型において標的することができ、抗癌治療における使用を目指すことができる。
【００２４】
本発明の方法を使用すれば、必要に応じてロボット技術を用いて、広い範囲の化学物質を迅速に且つ高い感受性でスクリーニングすることができる。
【００２５】
ＡＤＰ及び好ましくは同時にマグネシウムイオンを細胞培養に加え、次にそれを、アデニレートキナーゼのような存在する標的酵素がＡＤＰをＡＴＰに変換することができる条件下でさらにインキュベートしてもよい。その時点で、ルシフェラーゼやルシフェリン作用物質のような検出作用物質を加え、生じた光シグナルを検出する及び／又は定量する。必要に応じて、これをアデニレートキナーゼの存在及び／又は量に関連づけ、そこから算定又は検定によって、あるいは試験条件に供さずに１００％のアデニレートキナーゼを放出することができる溶解剤を加えた対照サンプルとの比較によって、サンプル中の細胞溶解の度合に関連づけることができる。
【００２６】
この方法は、製薬適用のための化合物のスクリーニングにおける使用に特に適する。例えば、細胞試料が腫瘍細胞系である場合には、抗癌適用を有する可能性がある試薬を適用することができる。本発明の方法に従って試料中に溶解細胞が存在することは、試薬が腫瘍細胞を死滅させることを示す。
【００２７】
それ故好ましい実施態様では、本発明は、腫瘍細胞において細胞溶解を誘導するための試薬をスクリーニングする方法を提供し、かかる方法は、前記試薬の存在下で腫瘍細胞をインキュベートし、上述した方法を用いて細胞溶解を検出することを含む。
【００２８】
あるいは、この方法を使用して化学物質の正常細胞への作用を評価することができる。そのような情報はかかる化合物の毒性を判定する助けになると考えられ、それ故当該方法はインビトロでの毒物学において有用である。
【００２９】
当該方法はまた診断においても使用でき、例えば、患者がポリオのような溶解を引き起こすウイルス感染を生じている疑いがある場合に使用できる。
【００３０】
この場合には、ウイルス感染を起こしている疑いのある患者からの、血清サンプルのようなサンプルを培養中の細胞に加える。生じた細胞培養における溶解細胞の検出は、患者のウイルス感染の存在を示唆するであろう。
【００３１】
しかし、当該方法は、サンプル中の真核細胞の状態をモニターするように改変することもできる。この場合には、上記に概説したような試験条件下でインキュベートしておいた真核細胞のサンプルを、それらを溶解する予備段階に供する。これは、エネルギ−源の適用を含めた既知の様々な方法によって実施できるが、好都合には洗浄剤のような溶解剤の添加を含みうる。ひとたびサンプル中の細胞が溶解すれば、ＡＴＰの量を検出し、これを使用して細胞中に存在するアデニレートキナーゼの量を定量する。細胞のアデニレートキナーゼ含量はその細胞質量に等しいと考えられ、これは細胞が正常に成長及び／又は分裂するかどうかの指標である。それ故、この実施態様は細胞の状態を判定するために使用できる。本出願においては、細胞の「状態」は、細胞の健常性、そして特にそれらが正常に成長し、分裂するかどうかを表わす。
【００３２】
前述したように、細胞培養をインキュベートする試験条件は、例えば成長因子活性に関して物質をスクリーニングする際の、化学物質（有機又は無機）のような作用物質、生化学的又は生物学的作用物質の添加を含む。しかし、温度、ｐＨ、圧、照射又は特定の気体環境のような環境要因が細胞の状態に及ぼす影響も、この方法を用いて検討することができる。
【００３３】
さらなる実施態様では、本発明の方法は、例えば尿又は乳のような、健常な個人においては細胞不含である体液のサンプル中の真核細胞の存在を検出するために使用できる。本発明の方法は、これらの液体中の少数の細胞であってもその検出を可能にし、それ故乳腺炎のような疾患の早期診断の可能性を提供する。この場合にも、液体のサンプルを、サンプル中の細胞を溶解してその内容物を放出させる予備段階に供する。
【００３４】
本発明の特定実施態様では、ルシフェラーゼ／ルシフェリンのようなシグナル生成ルミノメトリ−試薬をインキュベーションの開始時に、好ましくはＡＤＰ及びマグネシウムイオンソースと同時に、また好ましくはそれらと混合して、サンプルに加える。
【００３５】
あらゆる増幅キナーゼと同様に、本発明のアッセイの感受性は試薬の純度によって制限される。この場合には、重要な夾雑物はＡＤＰ基質中のＡＴＰ及びルシフェラーゼ製剤中のアデニレートキナーゼのような酵素であると考えられ、特にこれらが、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて安定化されている場合に当てはまる。細胞溶解に関する感受性の高いアッセイとして使用するためには、各々の試薬の純度を、検定する物質及びアッセイにおいて試薬が反応する物質に関してできるだけ高くする必要がある。
【００３６】
ＷＯ ９４／１７２０２号及びＷＯ ９６／０２６６５号に述べられているように、高純度の市販のＡＤＰ（純度＞９９．５％）を、好ましくはカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した後初めて使用する。適当なカラムクロマトグラフィー法の例も記述されている。２×１０^−５を上限とするモル％ＡＴＰを含むＡＤＰを入手するための方法が述べられている。
【００３７】
ＡＤＰ基質からＡＴＰを除去するためのさらなる方法は、ルシフェラーゼ又はアピラーゼのようなＡＴＰを特異的に分解する酵素を使用する。そのような酵素はまた、クロマトグラフィーで精製したＡＤＰをさらに精製するためにも使用でき、あるいはその代わりに酵素によって精製したＡＤＰをカラムクロマトグラフィーによって処理することもできる。アピラーゼはＡＤＰアーゼでもあることが認められているが、一部のアピラーゼはＡＴＰに対してより活性であり、ＡＤＰがはるかに高いレベルで存在するので、これは有意の問題を提起しない。
【００３８】
ルシフェラーゼ製剤並びにこれらの製剤において安定剤として使用されることがあるＢＳＡからアデニレートキナーゼのようなやっかいな混入酵素を排除するための様々な方法がＷＯ ９４／１７２０２号及びＷＯ ９６／０２２６５号に述べられている。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー又は望ましくない酵素が分解するように単にルシフェラーゼを数ヵ月間又は数年間放置しておくことを含む。
【００３９】
アデニレートキナーゼのような混入酵素を含まない又は実質的に含まないルシフェラーゼのような酵素を生成する方法が、共同審査中の国際特許願第ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３０４号に述べられている。要するに、この工程に従えば、組換えＤＮＡテクノロジーを用いてルシフェラーゼ酵素が生成される。細菌細胞のような宿主細胞を、所望するルシフェラーゼ酵素及び同時に宿主細胞が増殖できるように機能する突然変異体形態の混入酵素を発現するように形質転換する。しかし、アデニレートキナーゼのような混入酵素の突然変異体形態は、特定の条件下で、例えばルシフェラーゼが安定なままである温度下で不安定であるように設計される。ひとたびルシフェラーゼが宿主細胞培養から回収されれば、混入酵素を変性するために、ルシフェラーゼを混入酵素が不安定となる温度のような条件に十分な期間供する。
【００４０】
適切には、本発明の方法において使用する反応条件は、ＷＯ ９４／１７２０２号及びＷＯ ９６／０２６６５号に述べられているものと概ね同様である。適切には、ＡＤＰの濃度が０．００５ｍＭから１ｍＭの間、好ましくは０．０８ｍＭ以上になるようにＡＤＰを加える。変換段階の混合物におけるＡＤＰの特に好ましい量は約０．１ｍＭである。
【００４１】
適切には、培養中のマグネシウムイオンの濃度は少なくとも１ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ又はそれ以上、最も好ましくは１０ｍＭ又はそれ以上、例えば１０〜３０ｍＭである。マグネシウムイオン枯渇剤、例えばＥＤＴＡやリン酸緩衝液のようなキレ−ト化剤／金属イオン封鎖剤を含むアッセイ又は細胞培養において試薬を使用する場合には、より高い濃度が好ましく、良好な変換速度を維持するためには過剰のマグネシウムイオンが存在することが好ましいであろう。
【００４２】
マグネシウムイオンは、何らかのマグネシウム塩の形態、好ましくは酢酸マグネシウムの形態で提供されうる。
【００４３】
ルシフェラーゼは、好ましくは抽出剤とは別に保存する。
【００４４】
Ｍｇ^２＋イオンは混入アデニレートキナーゼによるＡＤＰの枯渇を促進するので、使用時まではそれらを一緒にした溶液の状態にしないことが好ましい；これを防ぐためにＥＤＴＡのようなキレ−ト化剤をＡＤＰに含めることができる。好ましくは使用の直前に又はＡＤＰ変換段階でマグネシウムとＡＤＰを一緒にする。試薬を一緒に保存する場合には、ＡＤＰが早期にＡＴＰに変換するのを避けるため、凍結乾燥形態で保存することが好ましい。
【００４５】
ＡＤＰとルシフェラーゼ／ルシフェリンを単一試薬として投与するときには、試薬のｐＨを両方の酵素に適切であるように調整することが好ましい。これにより、ＡＤＰがＡＴＰに変換しつつある間も計数を続けることが可能になる。適切なｐＨ値は、サンプル中の既知の細胞数と既知の溶解剤を使用して常套的実験によって決定しうる。サンプル、ＡＤＰ及びマグネシウムイオンソースは、アデニレートキナーゼ反応に適したｐＨを与える緩衝液中で混合することができる；その他の試薬は必要ない。それ故、５．５から８．５のｐＨを与えるどのような緩衝液も使用でき、至適ｐＨはｐＨ６−７、好ましくはｐＨ６．５である。適切な緩衝液の例は、Ｔｒｉｓ及びリン酸緩衝液を含む。最も適切には、本発明の方法を実施するための準備として、サンプルをそのような緩衝液中に収集する及び／又は希釈する。
【００４６】
すべての段階が完了した後、すなわちＡＤＰのＡＴＰへの変換とその後のルシフェラーゼのルシフェリンへの作用後に混合物から発せられる光を、ルシフェラーゼとルシフェリンあるいは基本的な段階を進行させることができる他の試薬の添加と同時に又はその直後に、光検出器内のサンプル容量の存在、例えばルミノメ−タ−管によって測定することができる。
【００４７】
本発明のさらなる局面では、本発明の方法を実施するための試験キットが提供される。本発明の試験キットは、本発明の方法に必要な基本的試薬、すなわちアデノシン二リン酸をルシフェラーゼとルシフェリン及び細胞培地と共に含む。またマグネシウムイオンソースも含みうる。キットは適切には単一包装の形態であり、好ましくは本発明の方法をどのようにして実施するかについての指示を含む；試薬は容器に入れて提供され、直接使用又は希釈後の使用に適した強度である。リン酸緩衝液も含みうる。
【００４８】
本発明の方法を実施するための装置は、ＷＯ ９４／１７２０２号及びＷＯ ９６／０２６６５号に述べられているものと同様である。しかしこの場合には、サンプル保持手段が、適切にはインキュベーション容器、マイクロタイタープレート又はスライドを含む。これを、試験条件以外の原因からの細胞死によって偽陽性が生じることがないように、細胞培養を細胞が活発に成長し、分裂する温度に確実に保持するため、加熱に供してもよい。
【００４９】
本発明の方法において使用する装置のその他の特徴は、ＡＤＰ、適宜にマグネシウムイオン及びルシフェラーゼやルシフェリンのような検出試薬を細胞培養に添加するための手段、並びに生成される光のようなシグナルを検出するための手段を含む。
【００５０】
当該装置は、典型的にはルシフェラーゼ及びルシフェリンを加えたときに懸濁液から発せられる光の量を測定するための手段を含み、任意に、発せられる光の量を示す検出手段のためのシグナルを受け取って、それから培養中の溶解細胞の存在の可能性と量を算定し、結果を表示するためのコンピュータプロセッサーとビジュアルディスプレイユニットを含む。その一部がブランクと非イオン性洗浄剤での実施を含む対照である、設定された一連の入力シグナルを考慮するようにプログラムするか、又はあらかじめ入力された標準、例えば温度を考慮するようにプログラムすることによって、そのような算定を容易にすることができる。

Claims (7)

1. （ｉ）細胞溶解を引き起こし得る試験条件に、真核細胞調製物を供し、
   （ｉｉ）アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を、細胞アデニレートキナーゼによってＡＤＰがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することができる条件下で当該調製物に加え、
   （ｉｉｉ）当該調製物においてＡＴＰを検出し、それをアデニレートキナーゼの存在、従って溶解細胞の存在に関連づけることを含む、
   細胞溶解を引き起こし得る試験条件下での真核細胞の完全性をモニターするための方法。
2. 上記試験条件が試薬の添加を含む、請求項１に記載の方法。
3. 上記試薬が、製薬適用のためにスクリーニングされる化合物である、請求項２に記載の方法。
4. 細胞調製物が培地中の腫瘍細胞系であり、試薬が抗癌適用を有する可能性がある、請求項３に記載の方法。
5. 前記試験条件が、温度、ｐＨ、圧、照射又は特定の気体環境の存在への暴露である、請求項１に記載の方法。
6. 溶解ウイルスによる細胞の感染を検出するために使用される、請求項１に記載の方法。
7. 毒性試験において使用される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。