JP3856467B2 - 微生物学的試験方法および試薬 - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Description
本発明は、微生物の検出およびアッセイ方法、該方法に使用するための試薬ならびに該方法を行うための必須試薬を含むテストキットに関する。
全ての生物は、化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用しており、これは、ＡＴＰによって推進されるルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を使用してアッセイすることが知られている。この酵素反応によって発する光は、発光測定器を使用して測定することができ、これは、存在するＡＴＰ量に関係する。微生物数の指標としてのＡＴＰの有用性は1960年代中頃から公知であり（ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), Stanleyら編；Blackwell Scientific Publications, London, pages 1-10参照）、その主は利点は、速度および感度である。このアッセイ様式を使用すると、簡単なサンプルはものの数分で分析することができ、一方、複雑なサンプルは通常はほんの30分でよく、検出能は10-12モル／リットルＡＴＰまで可能である。しかし、速度および実行の容易さは保持したまま、微生物またはその含量を検出する際の感度がさらに高い方法が必要である。
本発明者は、ＡＴＰに基づくアッセイの速度および感度が、アッセイの標的をＡＴＰからそれを発生する酵素、特にアデニル酸キナーゼに変更することによりかなり高められることを確認した。アデニル酸キナーゼは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換される際に全生物が使用する酵素である。本発明の好ましい方法、試薬およびキットを使用するとにより、ＡＴＰよりもむしろこの酵素が標的となり、細胞内マーカーのアデニル酸キナーゼを少なくとも10-20モルまで検出することができる。
ルシフェラーゼ／ルシフェリン系を使用するアデニル酸キナーゼのアッセイは公知である（Brolinら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1 (1979) 163-169およびShutenkoら、Biotekhnologiya, No 4, (1988) 542-547参照）。これは、その活性を測定することを目的とするものであり、ある種の哺乳類および植物の組織の研究に適用されている（例えば、Rodionovaら、Fiziologiya Rastenii (1978) 25, 4, p731-734参照）。しかし、微生物の検出およびアッセイのための該アッセイ系の使用は示唆されていないし、そうすることの利点、すなわち高められた感度が得られることは、酵素自体を研究する人々には問題とされることはなかった。
アデニル酸キナーゼはＡＤＰまたはＡＴＰよりも少量で存在するが、それを微生物に対する生物学的マーカーとして使用すると感度が高められ、それが産生するＡＴＰによりその存在を測定すると、利用できる典型的な増幅は400,000である。すなわち、10分のインキュベーションで、存在する酵素１モル毎に400,000モルのＡＤＰがＡＴＰに変換される。すなわち、アデニル酸キナーゼが触媒する反応の基質または生成物を測定することにより、10-20モルまでもの検出が可能である。
本出願人による同時係属中のＰＣＴ出願WO 94/17202は、サンプルにおけるＡＤＰからＡＴＰへの変換能からサンプル中の微生物を推定し、それを微生物またはその細胞内物質の存在と関連づける一般的方法に関する。該出願が例として挙げている方法では、２分子のＡＤＰと各アデニル酸キナーゼ活性部位との反応に必要なマグネシウムイオンは試薬としては添加しないが、存在する細菌細胞によって、また、他の試薬における不純物として供給されている。該方法を使用してその実施例で検出された細胞数は約102であることが示されたが、統計的により有効な性質の結果からは103以上で得られ、発光測定器による計数と細胞数との間には直線関係が得られた。
本発明は、アデニル酸キナーゼ活性を最適化した方法で測定する改善された方法に関し、該方法では、マグネシウムイオンがＡＤＰ変換反応に供給され、使用する試薬はアデニル酸キナーゼを除去すべく処理して純度を高くし、それによって、検出することができる微生物数を、200μlのサンプルにつき百の位ではなく十の位まで可能とし、細胞とＡＴＰにより誘発される光との間の直線関係による読み取りは、10個の細胞まで可能である。
本発明の第一の態様では、サンプルに存在する微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量を測定するための方法を提供し、該方法は、サンプル中のアデニル酸キナーゼの量を、それをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）と混合し、このＡＤＰから該サンプルによって産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量を測定し、そうして産生したＡＴＰの量をアデニル酸キナーゼならびに微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量と関連づけることにより測定し、ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、ＡＤＰのＡＴＰへの最大変換を可能とするのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在下で行うことを特徴とする。存在するマグネシウムの量は、好ましくは、全てのＡＤＰ分子が少なくとも１個のマグネシウムイオンと結合することができるように、ＡＤＰ１モルに対して１モルのマグネシウムが与えられるのに十分であるようにする。
本発明のこの発明の好ましい態様では、サンプルを水性懸濁物または溶液の形態で提供し、サンプル中のアデニル酸キナーゼ、すなわち微生物および／またはその細胞内物質の推定は、存在するアデニル酸キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換する条件下でＡＤＰおよびマグネシウムイオンをサンプルに添加し、そのサンプルを予め定めた時間インキュベートして該変換を行い、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、サンプルから放出される光の量を測定し、それをアデニル酸キナーゼの存在および量と関連づけることにより行う。
サンプルと混合するＡＤＰの量は、好ましくは、混合物中のＡＤＰ濃度を0.005mM以上、より好ましくは0.01mM以上、最も好ましくは、0.08mM以上とするの十分な量である。変換工程の混合物における特に好ましいＡＤＰの量は、約0.1mMである。
使用すべき試薬がマグネシウムイオン除去剤、例えばＥＤＴＡおよびリン酸塩緩衝液などのキレート／封鎖剤を含む場合、最適な変換を受けるのに十分なマグネシウムイオンをＡＤＰに供給するために、十分量のマグネシウムイオンを存在させるのが好ましいと認識される。上記した好ましい濃度のＡＤＰの場合、ＡＤＰのＡＴＰへの変換の際の懸濁物または溶液中のマグネシウムイオンの好ましい濃度は、１mM以上、より好ましくは５mM以上、最も好ましくは10mM以上である。マグネシウムイオンは、マグネシウム塩の形態で、好ましくは酢酸マグネシウムとして供給することができる。
本発明のさらに好ましい態様では、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光測定試薬を、好ましくはＡＤＰおよびマグネシウムイオン源を含む単一試薬として、インキュベーション開始時にサンプルに添加する。ルシフェラーゼは、好ましくは、抽出剤とは別に保存する。
ＡＤＰのＡＴＰへの変換開始時に全ての試薬を含み、および／または別個の工程であるルシフェリン／ルシフェラーゼ添加の後に発光測定器による計数を続ける本発明の態様では、マグネシウムを、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬によって提供することができる。しかし、ＥＤＴＡおよびリン酸塩によるマグネシウムイオンの結合のため、マグネシウムイオンの量は、予め実験または計算することにより、明確に確認する必要がある。当業者であれば、所定のＡＤＰ、サンプルおよびルシフェリン／ルシフェラーゼ混合物に添加すべきマグネシウム塩の最適量は、既知量の細菌、例えば大腸菌（E. coli)を含むサンプルを使用する通常の実験を行い、それにより最大の信号を得ることにより、容易に求めることができることが分かる。下記図３は、下記実施例で使用する混合物に添加すべき酢酸マグネシウムの最適量を示す。
Ｍｇ2+イオンは、汚染物のアデニル酸キナーゼによるＡＤＰの消耗を容易にするので、それらは使用前には一緒にしないのが好ましい。これを避けるために、ＥＤＴＡなどのキレート剤をＡＤＰに入れてもよい。好ましくは、マグネシウムおよびＡＤＰは、使用直前またはＡＤＰ変換工程の際に一緒に入れる。試薬を一緒にしておく場合は、ＡＤＰのＡＴＰへの早すぎる変換を防ぐために、凍結乾燥の状態で保存するのが好ましい。
上述したように、他のアッセイを使用することもできるが、ＡＴＰは、好ましくは、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を使用して検出し、サンプル中のＡＴＰの量を示す光学的に検出可能な信号を得る。ルシフェリン／ルシフェラーゼ調製物およびそれをＡＴＰアッセイにおいて使用する方法は当業者には周知であり、市販されている（例えば、Brolinら）。典型的な組成物は、例えば、0.1〜10mg/lのルシフェラーゼ、15〜1000μモル／lのＤ−ルシフェリン、並びにＭｇＣｌ2（2.5〜25ミリモル）、ＥＤＴＡ、ＢＳＡおよびｐＨ７の緩衝液（例えば、EP 054676参照）などの試薬を含む。
本明細書に記載したアデニル酸キナーゼ試験法で使用する単一試験に対しては、ＡＤＰをＡＴＰに変換しながら計数が継続できるように、ｐＨを、両方の酵素に対して最適であるように、すなわち妥協の値に調節するのが好ましい。これは、サンプルに既知数の細菌を使用する通常の実験により求めることができる。
サンプル、ＡＤＰおよびマグネシウムイオン源は、アデニル酸キナーゼ反応に適したｐＨを付与する緩衝液で混合することができる。他の試薬は不要である。すなわち、5.5〜8.5のｐＨを付与する緩衝液を使用することができ、最適ｐＨは６〜７の間であり、好ましくはｐＨ6.5である。適する緩衝液の例としては、トリスおよびリン酸塩緩衝液が挙げられる。本発明方法を行うのに備えて、サンプルは、該緩衝液に集めるか、および／または希釈するのが最も適する。
いずれかの増幅アッセイと同様に、本発明のアデニル酸キナーゼアッセイは、試薬の純度によって制限される。この場合、重要な汚染物質は、ＡＤＰ基質におけるＡＴＰおよびルシフェラーゼ調製物におけるアデニル酸キナーゼである。微生物の高感度アッセイとして使用する場合、特に微生物が潜在的に有害であり、低い数値での検出を必要とする場合、各試薬の純度は、そのアッセイでそれと反応するはずの基質に関してできる限り高いことが必要である。
最初の問題を処理するために、好ましくは、高純度の市販ＡＤＰ（＞99.5％純度）をカラムクロマトグラフィーでさらに精製した後、使用する。これは、たとえ少量でもＡＴＰが混ざっていると、バックグランドの示度を高くするのには十分であるため、望ましい。例えば、ジエチルアミノエチルセルロースカラムおよび0.02mMの塩酸溶離液を使用して、ＡＴＰを実質的に分離することができる程度にＡＤＰよりもかなりゆっくりカラムから溶離する。他のクロマトグラフィー媒体および溶離液の組み合わせも使用して同様の効果を得ることもできる。例えば、Nucleosil ３(RTm)およびNucleosil ５(RTm)などのNucleosil（登録商標(RTm))カラム充填材（Technicol, Stockport Cheshire UK製）を使用し、0.06ＭのＫＨ2ＰＯ4：メタノール（77:23v/v）（ｐＨ６）を５mMの硫酸水素テトラブチルアンモニウムとともに使用するＨＰＬＣがある。ＡＤＰ対ＡＴＰの比が高い画分は使用のために保持し、純度は、アデニル酸キナーゼ作用によるＡＤＰレベルの測定、およびアデニル酸キナーゼがない場合はＡＴＰ汚染レベルの測定の後に、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬が媒介する生物発光によって評価する。
20mMのリン酸カリウム（ｐＨ4.6）と平衡させた好ましいEconopaq Q (RTm)強陰イオン変換ゲルカートリッジ（Biorad-RTm）を使用し、400mMまでの段階的濃度のＫＰiで溶離することにより、ＡＤＰは強く保持され、コヒーレントピークとして溶離され、ＡＴＰはその後で溶離されることが分かった。このようにして、ＡＴＰモル％の上限が２×10-8であるＡＤＰが得られた。本出願人が文献から知った最も純粋なＡＤＰは、0.001％のＡＴＰ（Shutenkoら、前出、参照）であり、すなわち、本発明は、本発明方法で使用するための、ＡＴＰが0.001モル％未満、より好ましくは２×10-8モル％以下であるＡＤＰを提供する。
ＡＤＰ基質からＡＴＰを除去するための別の方法は、ＡＴＰを特異的に分解する酵素（ルシフェラーゼまたはアピラーゼなど）を使用する。該酵素は、クロマトグラフィーにより精製したＡＤＰをさらに精製するために使用することができ、あるいは、酵素により精製したＡＤＰをカラムクロマトグラフィーにより処理してもよい。なお、アピラーゼはＡＤＰアーゼでもあるが、いくつかはＡＴＰに対してより活性であり、ＡＤＰはかなり高いレベルで存在するので、これはあまり問題ではない。
第二の問題に関して、必須の「ハウスキーピング」酵素であるアデニル酸キナーゼは、実質的に全生物に存在し、一般的には、ルシフェラーゼ調製物中に存在する。ほんの少量の混入であるかもしれないが、目的がサンプル中の極微量のアデニル酸キナーゼの測定であるため、ルシフェラーゼにおけるその存在は制限因子であると考えられる。実際、本出願人は、１単位（Ｕ）の活性を0.5mMのＡＤＰおよび4.5mMのＭｇ2+の存在下、ｐＨ7.8、20℃で１μモルのＡＤＰを１μモルのＡＴＰに変換する酵素の量として定義すると、市販のルシフェラーゼは、10-7U/ml以上のアデニル酸キナーゼ活性を含む可能性があるが、その基質であるルシフェリンは、活性があったとしても、非常に少ないことを確認した。さらに、ルシフェラーゼ試薬は、安定剤、通常はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質で安定化するのが普通であり、この市販製剤は、本出願人によって、かなりのアデニル酸キナーゼ活性を有することが確認された。
ルシフェラーゼおよびアデニル酸キナーゼの分子量はかなり異なり、各々、61kDおよび21kDである。さらに、ルシフェラーゼは膜結合タンパク質であり、従って、比較的疎水性であるが、アデニル酸キナーゼは可溶性酵素として生じる。すなわち、アデニル酸キナーゼは、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはその両方によってルシフェラーゼ調製物から除去することができる。あるいは、またはこの他に、ルシフェラーゼのアデニル酸キナーゼ汚染の問題は、汚染アデニル酸キナーゼがかなりの影響を及ぼすための時間を持たないように、測定を行う直前、または行うときに、生物発光試薬（ルシフェラーゼおよびルシフェリン）を添加することにより回避することができる。
ルシフェラーゼを精製するのに適する方法は、多孔性の低いゲル（例えば、Sephadex G-25 (RTm)）によるカラムクロマトグラフィー分画（NielsenとRasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22 (1968) p1757-1762参照；一連のSephadex(RTm)およびSepharose(RTm)カラム（例えば、Blue Sepharose）および／またはＳＤＳ電気泳動（Devineら、Biochimica et Biophysica Acta 1172 (1993) 121-132参照）またはある一定の期間、高められた室温での老化（ageing）を使用する。
ウシ血清アルブミンなどの試薬からアデニル酸キナーゼ活性を除去するためには、同様に、カラムクロマトグラフィーの使用が可能である。これに関して成功したさらに別の処理は、ルシフェラーゼを安定化するための能力は保持されるが、アデニル酸キナーゼ活性は総じて低下し、あるいは消耗されるようにＢＳＡを化学処理するものである。タンパク質の酵素活性の消耗に対するどの従来の化学的処理も、この目的に等しく適用することができる。あるいは、非タンパク質ルシフェラーゼ安定剤、例えばグリセロールは、ＢＳＡの補足または代わりとして使用することができる。
例えば、本出願人は、市販のＢＳＡのアデニル酸キナーゼ活性を、単に酸またはアルカリ性ｐＨで熱処理することにより、元の活性の２％未満に低下させることができることを確認した。一つの適する有効な処理は、ＢＳＡをｐＨ5.6またはｐＨ10、50℃で24時間加熱するものである。アデニル酸キナーゼのないＢＳＡのさらに別の供給源は、SigmaおよびBDHから市販されている、化学的に処理された試薬アセチル化ＢＳＡである。当業者であれば理解されるように、他の化学的に処理されたＢＳＡも適する。
標的微生物に関連するアデニル酸キナーゼ全てが、本発明のＡＤＰ、マグネシウムイオンおよびルシフェラーゼ／ルシフェリンアッセイ試薬に利用できるようにするためには、細胞内物質が放出され、さもなくば、試薬にさらされるように、微生物を破砕することが必要である。そのような破砕は、超音波発生機などの機械的手段を使用して、所望により低温ショックまたはリゾチームなどの試薬とともに浸透圧ショック法の使用により、またはその便利な洗剤の使用により行われると考えられる。そのような洗剤は市販されており、通常は、「抽出剤」と言う。典型的な抽出剤としては、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）などの一般的な陽イオン洗剤、ならびにBiotrace(RTm)XM抽出剤（Biotrace, Bridgend UK製）、Celcis UK陽イオン抽出剤およびLumac NRM(RTm)（Lumac BV, Holland製のヌクレオチド放出試薬）などの専売試薬が挙げられる。ＣＴＡＢを使用する場合、通常の調製剤は、0.01〜１％ＣＴＡＢ水溶液を含む（例えば0.2％）が、他の濃度も、当業者であれば考えつくと考えられる。
すなわち、微生物を含むことが疑われるアッセイサンプルにＡＤＰおよびルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を添加する前に、破壊剤の使用により微生物を破砕して、その細胞内物質が発光測定試薬に接触できるようにするのが好ましい。標的細胞を菌類胞子などの細胞から区別することを望む場合、二つの別々のアッセイを行うことが可能である。一方は、これらの胞子および多細胞の動物「体」細胞のみを破砕することができる非イオン洗剤（例えば、Triton TX-100(RTm)）により処理し、他方は、全ての細胞を破砕するための上記で詳述した陽イオン洗剤の「抽出剤」により処理するアッセイである。これらのアッセイは、アピラーゼなどのＡＴＰアーゼを洗剤／ルシフェラーゼ／測定サイクル間、すなわち、間に濾過工程を有する第一のサイクル工程において非イオン洗剤を使用する一方のサイクルおよび陽イオン洗剤を使用する他方のサイクルの間で添加する場合、同一のサンプルに対して行うことが可能である。
ルシフェラーゼ／ルシフェリン系に対する抽出物の影響は重要であることが知られており（例えば、Simpsonら、(1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2) pp97-106参照）、陽イオン洗剤は反応を可能にするが、ルシフェラーゼを徐々に不活性化することが知られており、陰イオン洗剤は反応を阻害し、非イオンおよび両イオン洗剤は広範囲にわたって増強することが知られている。0.15％の陽イオン洗剤および0.25％の第三ジアミン界面活性剤の混合物（Celcis, Cambridge, UK製）は、本発明の目的には十分であることが分かったが、同一溶液に共存する場合、アデニル酸キナーゼおよびルシフェラーゼ活性の最適混合物を生じる他の「抽出剤」のスクリーニングは、当業者であれば問題ないであろう。
全ての必須工程、すなわちＡＤＰのＡＴＰへの変換および続くルシフェラーゼのルシフェリンに対する作用が完了した後に混合物から発する光は、光検出器内で例えば発光測定管によるサンプル体積の滞留によって、ルシフェラーゼおよびルシフェリンまたは必須工程を促進することができる他の試薬を添加した直後、あるいは添加と同時に測定することができる。
本発明の第二の態様では、本発明方法に必要な必須試薬、すなわち、アデノシン二リン酸、マグネシウムイオン源ならびに好ましくはルシフェラーゼおよびルシフェリンを含むテストキットを提供する。好ましくは、該キットは、これらの試薬全てを含み、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは単一の試薬溶液として供給し、アッセイしようとする標的細胞の破砕に適する洗剤試薬をそのキットに含む。通常、微生物のアッセイに対しては、陽イオン洗剤のみが必要であるが、菌の胞子および体細胞の存在がかなりありそうな場合は、さらに非イオン洗剤を含めて、それらの数を評価してもよい。キットは、単一パッケージの形状であり、好ましくは、本発明方法を実施する方法に関する使用説明書を含む。試薬は容器に入れ、直接の使用または希釈後の使用に適する濃度である。
マグネシウムイオンは、ＡＤＰのＡＴＰへの変換(conversion)が始まる前にこれを添加すべき場合は、ルシフェラーゼ／ルシフェリンとともに供給するのが適しているが、その試薬のＥＤＴＡまたはリン酸塩に結合する量よりも過剰にすべきであり、アデニル酸キナーゼおよびルシフェラーゼの両方の要求量を受け入れるように最適化すべきである。微生物の検出の場合、マグネシウムイオンは、好ましくは、サンプル採集／希釈緩衝液とともに供給するが、特定用途の場合は、他の様式が好ましい可能性がある。最も便利なのは、マグネシウムイオンをサンプル採集または希釈緩衝液とともに供給し、ＡＤＰは洗剤／界面活性剤抽出剤および所望によりＥＤＴＡなどの安定剤とともに供給し、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは一緒にして供給し、こうして、３試薬のテストキットを提供する。あるいは、これらの試薬は、それらが使用前に相互作用して、例えばＡＤＰの分解(degradation)を引き起こすことがないように凍結乾燥した単一の試薬として供給してもよい。
本発明の好ましいテストキットは、純度が99.999％より高いＡＤＰ試薬、およびＢＳＡを含みアデニル酸キナーゼ活性は実質的にないルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を含む。あるいは、キットの使用説明書および／またはそれらの相対濃度において示される使用するルシフェラーゼ／ルシフェリン比は、ルシフェラーゼが十分速くルシフェリン基質に作用して、最初の光放出が終わった後にルシフェラーゼ結合アデニル酸キナーゼがＡＴＰを産生することができるようにする。すなわち、微生物由来のアデニル酸キナーゼは、迅速な動力学反応によって示され、汚染物ＡＴＰはグロー（glow）によって示される。
好ましい精製試薬は、上記方法によって提供することができる。なお、ルシフェラーゼ中のアデニル酸キナーゼ活性は、ルシフェラーゼを数カ月または数年放置することにより消散させることもできる。
次に、本発明の方法、装置、試薬およびキットの例を、下記実施例および図を参照して説明するが、下記実施例および図は本発明を限定するものではない。本発明のさらに別の態様は、これらに照らしてみれば、当業者には明らかである。
図面の説明
図１は、本発明の改善されたアッセイを使用し、ルシフェリン／ルシフェラーゼ添加の前に１分および５分インキュベートすることによる、発光測定器の信号の対数(log)を200μlのサンプルにおける大腸菌の数の対数(log)に対してプロットした図である。
図２は、マグネシウムの非存在下で、発光測定器の信号の対数(log)を大腸菌の細胞数の対数(log)に対してプロットした図である。
図３は、ｐＨ7.5およびｐＨ8.0における一定数のP. aeruginosaに由来する発光測定器の信号に対するマグネシウムイオン濃度の影響を示す図であり、マグネシウムを添加しない場合に対して10倍増加したことを示す。
実施例１：精製アデノシン二リン酸試薬の調製
20mMのリン酸カリウム（ｐＨ4.6）で平衡化し、５mlの１mMＡＤＰ（2.1mg）をロードした５mlのEconopac Qカートリッジ(RTm)（Biorad-RTm）を使用して市販の高純度（＞99.95％）ＡＤＰ(Sigma)を、液体クロマトグラフィーでさらに精製した。溶離は、400mMまでの段階的ＫＰi濃度により行った。ＡＤＰは強く保持されており、約340mMのＫＰiのピークとして溶離された。系にポンプ（５ml／分）およびグラジエントミキサーをセットし、全部で200mlに50〜１Ｍの勾配のＫＰiを供給し、５mlの画分を集めた。ＡＤＰが画分12と17との間に鋭いピークとして溶離されるとともに、ＡＴＰがその勾配の終わりに現れ始めた。残りのＡＴＰは、１Ｍまでの〔ＫＰi〕段階で溶離された。このカラムからの最も純粋なＡＤＰ画分は、ＡＴＰが２×10-8モル％未満であった。
実施例２：アデニル酸キナーゼを含まないルシフェラーゼ試薬の調製
アデニル酸キナーゼ活性を、乾燥状態での12カ月間にわたる高い室温（約30℃）での数カ月を含む老化(aging）により、市販のルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Biotrace HM(RTm)）から消散させた。
実施例３：キナーゼを含まないルシフェラーゼ試薬の別の調製
市販のルシフェラーゼを、上記したBlue Sepharose(RTm)を使用し、Devineら(1993)の方法によるカラムクロマトグラフィーを使用して精製する。
実施例４：アデニル酸キナーゼを含まないＢＳＡの調製
Sigma Fraction V（RIA Grade, Cat. No. A-7888）ＢＳＡを、200mlの滅菌水中で１％w/vとし、最初のｐＨを5.6とした。この50mlのサンプル２つを100ml容のDuranビンに入れ、残りは、5MＮａＯＨを使用してｐＨ10とし、２つのDuranの各々に50ml入れた。微生物の増殖を防ぐための保存剤として、チメロサールを最終濃度0.02％にして添加し、そのびんを37℃または50℃で24時間インキュベートした後、各々のｐＨを５ＭのＨＣｌまたは５ＭのＮａＯＨの適する方で7.6に再調整した。アデニル酸キナーゼ活性の測定を、上記で調製した100μlのＢＳＡサンプルを100μlの30mM酢酸マグネシウム溶液と混合し、得られた混合物を発光測定器の3.5ml容発光測定管に入れ、実施例１で調製した100μlのＡＤＰ溶液ならびにカラムクロマトグラフィーおよび化学的に処理したＢＳＡの使用によりアデニル酸キナーゼ活性を含まないように調製した100μlのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Celcis, Cambridge UK）を添加することにより行った。５秒後に、10秒間にわたる光の放出を測定してコンピューターに記録し、10秒間の読み取りを全部で10連続行ってＡＴＰ産生速度を求めた。分析は、二重に行った。検定は、10ng/ml（91 femtomole）のＡＴＰ水溶液５μlから放出される光の測定を４回行うことにより行った。平均の信号は、2950／femtomoleであった。
結果：37℃でインキュベートしたＢＳＡサンプルは透明なままであったが、50℃の場合は沈殿を生じ、それは、ｐＨ10ではわずかであり、ｐＨ5.6では非常に多かった。ｐＨ10および50℃ではわずかな変色があった。これらのサンプルに残っているアデニル酸キナーゼ活性を下記表１に、発光測定器の計数／分によって表す。
ｐＨ10および50℃のサンプルは、２週間後ですら変色の増加により使用できなくなったので、より長期間の場合は、さらに温和な不活性化を使用するか、あるいは、どんな期間でも保存しようとする場合は、直ちに凍結乾燥するのが好ましい。37℃のサンプルは、この方法では変わらなかったので、インキュベーション時間を延ばすことによりアデニル酸キナーゼ活性のないＢＳＡを安定にするための良好な範囲である。Biotrace HM(RTm)試薬が、40℃での保存の後、乾燥状態でその活性を失ったという事実は、その可能性を示すものである。
実施例５：ＢＳＡを含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の調製
ルシフェリン／ルシフェラーゼの市販調製物は、通常、ＢＳＡを必要なものとして含む。上記実施例４で述べたように化学的に処理した。またはアセチル化ＢＳＡとして市販されているＢＳＡ（例えば、BDHまたはSigma）を、アデニル酸キナーゼ活性が10-9Uアッセイ体積（すなわち、300μl）未満であるCelcis LDRルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬を与えるような他の標準的なCelcis試薬とともに通常の割合でアデニル酸キナーゼを含まないルシフェラーゼと混合した。
実施例６：本発明のテストキット
本発明のテストキットは、下記容器から成る。
（ｉ）サンプルを採集／希釈するための15mMの酢酸マグネシウム溶液を保持する容器；
（ii）0.2mMのＥＤＴＡならびに、0.15％の陽イオン洗剤および0.25％の三級ジアミン界面活性剤の混合抽出剤をさらに含む、リン酸カリウム緩衝溶液（7.5mM、ｐＨ6.5）における0.3mM濃度の実施例１で調製した精製ＡＤＰ溶液（ＡＴＰに関して＞99.99999998％純粋）を保持する容器；
（iii)アデニル酸キナーゼが10-8U/100μl未満である、ルシフェリン／ルシフェラーゼLDR（Celcis, Cambridge, UK）生物発光試薬を保持する容器。
所望により、該パッケージは、非イオン洗剤溶液（Triton X-100(RTm)0.2％またはそれと同等のもの）の容器、および／またはサンプルに対する非イオン洗剤の作用により放出されるＡＴＰを破壊して陽イオン洗剤の添加による再アッセイに適するようにするためのアピラーゼなどのＡＴＰアーゼを保持する容器を含む。
実施例７：本発明の方法を使用する既知量の大腸菌のアッセイ
200μlのリン酸緩衝塩水（ｐＨ7.4）につき約2.2×107個の微生物を含む１週齢の大腸菌培養物をストックとして使用し、マグネシウムイオンを含む採集／希釈試薬（実施例６の（ｉ））で順次10倍希釈して、200μlのサンプルにつき107〜0.1個の微生物を含むサンプルを作った。
各200μlのサンプルを3.5ml容の発光測定管に添加し、100μlのＡＤＰ／抽出剤試薬（実施例６の（ii））を添加して、全体積300μlの混合物を室温で１〜５分インキュベートした。インキュベーションが終了すると、100μlの改良Celcis LDR生物試薬（上記実施例６の（iii)）を添加し、放出される光の最初の10秒間測定した後、10秒間隔で１分間測定し、Biotrace M3 (RTm)発光測定器を使用して累積様式で光の増加を求めた。最後の測定値から最初の信号値を差し引いて、１分間当たりの信号（カウント）を得た。
本発明方法の効果は、図１を参照することにより示すことができる。図１は、大腸菌と、ＡＤＰとともに５分インキュベートした後のサンプル混合物によって放出された光との間の統計的に有効な直線的応答が、１サンプル当たり10個の生物に対して得られ、100個以上の生物に対しては１分のインキュベーションで上向きとなり、どちらの場合も、検出限界は約10個の微生物である。これは、１分のインキュベーションの後の100個の生物による相違がほんの26cpmであり、1000個の場合は67cpmであり、直線的応答は1000個以上の細胞に対してのみ得られるPCT出願公開WO 94/17202の方法と比較して非常に有利である。本発明方法での１サンプルに対する1000個の細胞による信号の増加は、比較すると、１分後に数千cpmとなる。
理解されるように、サンプルにおける未知量の微生物に対するアッセイを本発明方法を使用して行うために、検量線を、図１および２に示すように（例えば、対数値として）既知数の微生物を発生測定器のカウントに対してプロットすることにより作成し、未知数の微生物（０個の生物を含む）を含むサンプルのカウント数を同じプロトコールを使用して誘導し、そのサンプルの微生物数を、その検量線上の同じカウント数に対応するものとして推定することができる。
当業者であれば理解されるように、特定の微生物（例えば、細菌）に存在するアデニル酸キナーゼの量は、他の微生物とは異なる可能性がある。例えば、酵母は、その大きさのために、細菌よりも多くのアデニル酸キナーゼを含み、実際、個々の酵母はこの方法によって検出することができる。すなわち、所与の微生物に対しては特定の検量線が必要であり、同じ微生物でも異なる状態（例えば、弱められた、ｐＨストレスのある、または酸素ストレスのある生物）に対してはそのような検量線を作成する必要があると考えられる。しかし、既存のＡＴＰに基づく方法に対する本発明方法のさらに別の利点は、アデニル酸キナーゼ含量が、細胞代謝により消耗されるかなり変化し得るＡＴＰ含量よりも細胞数とより密接に関係するということである。
全ての生物は、化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用しており、これは、ＡＴＰによって推進されるルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を使用してアッセイすることが知られている。この酵素反応によって発する光は、発光測定器を使用して測定することができ、これは、存在するＡＴＰ量に関係する。微生物数の指標としてのＡＴＰの有用性は1960年代中頃から公知であり（ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), Stanleyら編；Blackwell Scientific Publications, London, pages 1-10参照）、その主は利点は、速度および感度である。このアッセイ様式を使用すると、簡単なサンプルはものの数分で分析することができ、一方、複雑なサンプルは通常はほんの30分でよく、検出能は10-12モル／リットルＡＴＰまで可能である。しかし、速度および実行の容易さは保持したまま、微生物またはその含量を検出する際の感度がさらに高い方法が必要である。
本発明者は、ＡＴＰに基づくアッセイの速度および感度が、アッセイの標的をＡＴＰからそれを発生する酵素、特にアデニル酸キナーゼに変更することによりかなり高められることを確認した。アデニル酸キナーゼは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換される際に全生物が使用する酵素である。本発明の好ましい方法、試薬およびキットを使用するとにより、ＡＴＰよりもむしろこの酵素が標的となり、細胞内マーカーのアデニル酸キナーゼを少なくとも10-20モルまで検出することができる。
ルシフェラーゼ／ルシフェリン系を使用するアデニル酸キナーゼのアッセイは公知である（Brolinら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1 (1979) 163-169およびShutenkoら、Biotekhnologiya, No 4, (1988) 542-547参照）。これは、その活性を測定することを目的とするものであり、ある種の哺乳類および植物の組織の研究に適用されている（例えば、Rodionovaら、Fiziologiya Rastenii (1978) 25, 4, p731-734参照）。しかし、微生物の検出およびアッセイのための該アッセイ系の使用は示唆されていないし、そうすることの利点、すなわち高められた感度が得られることは、酵素自体を研究する人々には問題とされることはなかった。
アデニル酸キナーゼはＡＤＰまたはＡＴＰよりも少量で存在するが、それを微生物に対する生物学的マーカーとして使用すると感度が高められ、それが産生するＡＴＰによりその存在を測定すると、利用できる典型的な増幅は400,000である。すなわち、10分のインキュベーションで、存在する酵素１モル毎に400,000モルのＡＤＰがＡＴＰに変換される。すなわち、アデニル酸キナーゼが触媒する反応の基質または生成物を測定することにより、10-20モルまでもの検出が可能である。
本出願人による同時係属中のＰＣＴ出願WO 94/17202は、サンプルにおけるＡＤＰからＡＴＰへの変換能からサンプル中の微生物を推定し、それを微生物またはその細胞内物質の存在と関連づける一般的方法に関する。該出願が例として挙げている方法では、２分子のＡＤＰと各アデニル酸キナーゼ活性部位との反応に必要なマグネシウムイオンは試薬としては添加しないが、存在する細菌細胞によって、また、他の試薬における不純物として供給されている。該方法を使用してその実施例で検出された細胞数は約102であることが示されたが、統計的により有効な性質の結果からは103以上で得られ、発光測定器による計数と細胞数との間には直線関係が得られた。
本発明は、アデニル酸キナーゼ活性を最適化した方法で測定する改善された方法に関し、該方法では、マグネシウムイオンがＡＤＰ変換反応に供給され、使用する試薬はアデニル酸キナーゼを除去すべく処理して純度を高くし、それによって、検出することができる微生物数を、200μlのサンプルにつき百の位ではなく十の位まで可能とし、細胞とＡＴＰにより誘発される光との間の直線関係による読み取りは、10個の細胞まで可能である。
本発明の第一の態様では、サンプルに存在する微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量を測定するための方法を提供し、該方法は、サンプル中のアデニル酸キナーゼの量を、それをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）と混合し、このＡＤＰから該サンプルによって産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量を測定し、そうして産生したＡＴＰの量をアデニル酸キナーゼならびに微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量と関連づけることにより測定し、ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、ＡＤＰのＡＴＰへの最大変換を可能とするのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在下で行うことを特徴とする。存在するマグネシウムの量は、好ましくは、全てのＡＤＰ分子が少なくとも１個のマグネシウムイオンと結合することができるように、ＡＤＰ１モルに対して１モルのマグネシウムが与えられるのに十分であるようにする。
本発明のこの発明の好ましい態様では、サンプルを水性懸濁物または溶液の形態で提供し、サンプル中のアデニル酸キナーゼ、すなわち微生物および／またはその細胞内物質の推定は、存在するアデニル酸キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換する条件下でＡＤＰおよびマグネシウムイオンをサンプルに添加し、そのサンプルを予め定めた時間インキュベートして該変換を行い、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、サンプルから放出される光の量を測定し、それをアデニル酸キナーゼの存在および量と関連づけることにより行う。
サンプルと混合するＡＤＰの量は、好ましくは、混合物中のＡＤＰ濃度を0.005mM以上、より好ましくは0.01mM以上、最も好ましくは、0.08mM以上とするの十分な量である。変換工程の混合物における特に好ましいＡＤＰの量は、約0.1mMである。
使用すべき試薬がマグネシウムイオン除去剤、例えばＥＤＴＡおよびリン酸塩緩衝液などのキレート／封鎖剤を含む場合、最適な変換を受けるのに十分なマグネシウムイオンをＡＤＰに供給するために、十分量のマグネシウムイオンを存在させるのが好ましいと認識される。上記した好ましい濃度のＡＤＰの場合、ＡＤＰのＡＴＰへの変換の際の懸濁物または溶液中のマグネシウムイオンの好ましい濃度は、１mM以上、より好ましくは５mM以上、最も好ましくは10mM以上である。マグネシウムイオンは、マグネシウム塩の形態で、好ましくは酢酸マグネシウムとして供給することができる。
本発明のさらに好ましい態様では、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光測定試薬を、好ましくはＡＤＰおよびマグネシウムイオン源を含む単一試薬として、インキュベーション開始時にサンプルに添加する。ルシフェラーゼは、好ましくは、抽出剤とは別に保存する。
ＡＤＰのＡＴＰへの変換開始時に全ての試薬を含み、および／または別個の工程であるルシフェリン／ルシフェラーゼ添加の後に発光測定器による計数を続ける本発明の態様では、マグネシウムを、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬によって提供することができる。しかし、ＥＤＴＡおよびリン酸塩によるマグネシウムイオンの結合のため、マグネシウムイオンの量は、予め実験または計算することにより、明確に確認する必要がある。当業者であれば、所定のＡＤＰ、サンプルおよびルシフェリン／ルシフェラーゼ混合物に添加すべきマグネシウム塩の最適量は、既知量の細菌、例えば大腸菌（E. coli)を含むサンプルを使用する通常の実験を行い、それにより最大の信号を得ることにより、容易に求めることができることが分かる。下記図３は、下記実施例で使用する混合物に添加すべき酢酸マグネシウムの最適量を示す。
Ｍｇ2+イオンは、汚染物のアデニル酸キナーゼによるＡＤＰの消耗を容易にするので、それらは使用前には一緒にしないのが好ましい。これを避けるために、ＥＤＴＡなどのキレート剤をＡＤＰに入れてもよい。好ましくは、マグネシウムおよびＡＤＰは、使用直前またはＡＤＰ変換工程の際に一緒に入れる。試薬を一緒にしておく場合は、ＡＤＰのＡＴＰへの早すぎる変換を防ぐために、凍結乾燥の状態で保存するのが好ましい。
上述したように、他のアッセイを使用することもできるが、ＡＴＰは、好ましくは、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を使用して検出し、サンプル中のＡＴＰの量を示す光学的に検出可能な信号を得る。ルシフェリン／ルシフェラーゼ調製物およびそれをＡＴＰアッセイにおいて使用する方法は当業者には周知であり、市販されている（例えば、Brolinら）。典型的な組成物は、例えば、0.1〜10mg/lのルシフェラーゼ、15〜1000μモル／lのＤ−ルシフェリン、並びにＭｇＣｌ2（2.5〜25ミリモル）、ＥＤＴＡ、ＢＳＡおよびｐＨ７の緩衝液（例えば、EP 054676参照）などの試薬を含む。
本明細書に記載したアデニル酸キナーゼ試験法で使用する単一試験に対しては、ＡＤＰをＡＴＰに変換しながら計数が継続できるように、ｐＨを、両方の酵素に対して最適であるように、すなわち妥協の値に調節するのが好ましい。これは、サンプルに既知数の細菌を使用する通常の実験により求めることができる。
サンプル、ＡＤＰおよびマグネシウムイオン源は、アデニル酸キナーゼ反応に適したｐＨを付与する緩衝液で混合することができる。他の試薬は不要である。すなわち、5.5〜8.5のｐＨを付与する緩衝液を使用することができ、最適ｐＨは６〜７の間であり、好ましくはｐＨ6.5である。適する緩衝液の例としては、トリスおよびリン酸塩緩衝液が挙げられる。本発明方法を行うのに備えて、サンプルは、該緩衝液に集めるか、および／または希釈するのが最も適する。
いずれかの増幅アッセイと同様に、本発明のアデニル酸キナーゼアッセイは、試薬の純度によって制限される。この場合、重要な汚染物質は、ＡＤＰ基質におけるＡＴＰおよびルシフェラーゼ調製物におけるアデニル酸キナーゼである。微生物の高感度アッセイとして使用する場合、特に微生物が潜在的に有害であり、低い数値での検出を必要とする場合、各試薬の純度は、そのアッセイでそれと反応するはずの基質に関してできる限り高いことが必要である。
最初の問題を処理するために、好ましくは、高純度の市販ＡＤＰ（＞99.5％純度）をカラムクロマトグラフィーでさらに精製した後、使用する。これは、たとえ少量でもＡＴＰが混ざっていると、バックグランドの示度を高くするのには十分であるため、望ましい。例えば、ジエチルアミノエチルセルロースカラムおよび0.02mMの塩酸溶離液を使用して、ＡＴＰを実質的に分離することができる程度にＡＤＰよりもかなりゆっくりカラムから溶離する。他のクロマトグラフィー媒体および溶離液の組み合わせも使用して同様の効果を得ることもできる。例えば、Nucleosil ３(RTm)およびNucleosil ５(RTm)などのNucleosil（登録商標(RTm))カラム充填材（Technicol, Stockport Cheshire UK製）を使用し、0.06ＭのＫＨ2ＰＯ4：メタノール（77:23v/v）（ｐＨ６）を５mMの硫酸水素テトラブチルアンモニウムとともに使用するＨＰＬＣがある。ＡＤＰ対ＡＴＰの比が高い画分は使用のために保持し、純度は、アデニル酸キナーゼ作用によるＡＤＰレベルの測定、およびアデニル酸キナーゼがない場合はＡＴＰ汚染レベルの測定の後に、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬が媒介する生物発光によって評価する。
20mMのリン酸カリウム（ｐＨ4.6）と平衡させた好ましいEconopaq Q (RTm)強陰イオン変換ゲルカートリッジ（Biorad-RTm）を使用し、400mMまでの段階的濃度のＫＰiで溶離することにより、ＡＤＰは強く保持され、コヒーレントピークとして溶離され、ＡＴＰはその後で溶離されることが分かった。このようにして、ＡＴＰモル％の上限が２×10-8であるＡＤＰが得られた。本出願人が文献から知った最も純粋なＡＤＰは、0.001％のＡＴＰ（Shutenkoら、前出、参照）であり、すなわち、本発明は、本発明方法で使用するための、ＡＴＰが0.001モル％未満、より好ましくは２×10-8モル％以下であるＡＤＰを提供する。
ＡＤＰ基質からＡＴＰを除去するための別の方法は、ＡＴＰを特異的に分解する酵素（ルシフェラーゼまたはアピラーゼなど）を使用する。該酵素は、クロマトグラフィーにより精製したＡＤＰをさらに精製するために使用することができ、あるいは、酵素により精製したＡＤＰをカラムクロマトグラフィーにより処理してもよい。なお、アピラーゼはＡＤＰアーゼでもあるが、いくつかはＡＴＰに対してより活性であり、ＡＤＰはかなり高いレベルで存在するので、これはあまり問題ではない。
第二の問題に関して、必須の「ハウスキーピング」酵素であるアデニル酸キナーゼは、実質的に全生物に存在し、一般的には、ルシフェラーゼ調製物中に存在する。ほんの少量の混入であるかもしれないが、目的がサンプル中の極微量のアデニル酸キナーゼの測定であるため、ルシフェラーゼにおけるその存在は制限因子であると考えられる。実際、本出願人は、１単位（Ｕ）の活性を0.5mMのＡＤＰおよび4.5mMのＭｇ2+の存在下、ｐＨ7.8、20℃で１μモルのＡＤＰを１μモルのＡＴＰに変換する酵素の量として定義すると、市販のルシフェラーゼは、10-7U/ml以上のアデニル酸キナーゼ活性を含む可能性があるが、その基質であるルシフェリンは、活性があったとしても、非常に少ないことを確認した。さらに、ルシフェラーゼ試薬は、安定剤、通常はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質で安定化するのが普通であり、この市販製剤は、本出願人によって、かなりのアデニル酸キナーゼ活性を有することが確認された。
ルシフェラーゼおよびアデニル酸キナーゼの分子量はかなり異なり、各々、61kDおよび21kDである。さらに、ルシフェラーゼは膜結合タンパク質であり、従って、比較的疎水性であるが、アデニル酸キナーゼは可溶性酵素として生じる。すなわち、アデニル酸キナーゼは、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはその両方によってルシフェラーゼ調製物から除去することができる。あるいは、またはこの他に、ルシフェラーゼのアデニル酸キナーゼ汚染の問題は、汚染アデニル酸キナーゼがかなりの影響を及ぼすための時間を持たないように、測定を行う直前、または行うときに、生物発光試薬（ルシフェラーゼおよびルシフェリン）を添加することにより回避することができる。
ルシフェラーゼを精製するのに適する方法は、多孔性の低いゲル（例えば、Sephadex G-25 (RTm)）によるカラムクロマトグラフィー分画（NielsenとRasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22 (1968) p1757-1762参照；一連のSephadex(RTm)およびSepharose(RTm)カラム（例えば、Blue Sepharose）および／またはＳＤＳ電気泳動（Devineら、Biochimica et Biophysica Acta 1172 (1993) 121-132参照）またはある一定の期間、高められた室温での老化（ageing）を使用する。
ウシ血清アルブミンなどの試薬からアデニル酸キナーゼ活性を除去するためには、同様に、カラムクロマトグラフィーの使用が可能である。これに関して成功したさらに別の処理は、ルシフェラーゼを安定化するための能力は保持されるが、アデニル酸キナーゼ活性は総じて低下し、あるいは消耗されるようにＢＳＡを化学処理するものである。タンパク質の酵素活性の消耗に対するどの従来の化学的処理も、この目的に等しく適用することができる。あるいは、非タンパク質ルシフェラーゼ安定剤、例えばグリセロールは、ＢＳＡの補足または代わりとして使用することができる。
例えば、本出願人は、市販のＢＳＡのアデニル酸キナーゼ活性を、単に酸またはアルカリ性ｐＨで熱処理することにより、元の活性の２％未満に低下させることができることを確認した。一つの適する有効な処理は、ＢＳＡをｐＨ5.6またはｐＨ10、50℃で24時間加熱するものである。アデニル酸キナーゼのないＢＳＡのさらに別の供給源は、SigmaおよびBDHから市販されている、化学的に処理された試薬アセチル化ＢＳＡである。当業者であれば理解されるように、他の化学的に処理されたＢＳＡも適する。
標的微生物に関連するアデニル酸キナーゼ全てが、本発明のＡＤＰ、マグネシウムイオンおよびルシフェラーゼ／ルシフェリンアッセイ試薬に利用できるようにするためには、細胞内物質が放出され、さもなくば、試薬にさらされるように、微生物を破砕することが必要である。そのような破砕は、超音波発生機などの機械的手段を使用して、所望により低温ショックまたはリゾチームなどの試薬とともに浸透圧ショック法の使用により、またはその便利な洗剤の使用により行われると考えられる。そのような洗剤は市販されており、通常は、「抽出剤」と言う。典型的な抽出剤としては、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）などの一般的な陽イオン洗剤、ならびにBiotrace(RTm)XM抽出剤（Biotrace, Bridgend UK製）、Celcis UK陽イオン抽出剤およびLumac NRM(RTm)（Lumac BV, Holland製のヌクレオチド放出試薬）などの専売試薬が挙げられる。ＣＴＡＢを使用する場合、通常の調製剤は、0.01〜１％ＣＴＡＢ水溶液を含む（例えば0.2％）が、他の濃度も、当業者であれば考えつくと考えられる。
すなわち、微生物を含むことが疑われるアッセイサンプルにＡＤＰおよびルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を添加する前に、破壊剤の使用により微生物を破砕して、その細胞内物質が発光測定試薬に接触できるようにするのが好ましい。標的細胞を菌類胞子などの細胞から区別することを望む場合、二つの別々のアッセイを行うことが可能である。一方は、これらの胞子および多細胞の動物「体」細胞のみを破砕することができる非イオン洗剤（例えば、Triton TX-100(RTm)）により処理し、他方は、全ての細胞を破砕するための上記で詳述した陽イオン洗剤の「抽出剤」により処理するアッセイである。これらのアッセイは、アピラーゼなどのＡＴＰアーゼを洗剤／ルシフェラーゼ／測定サイクル間、すなわち、間に濾過工程を有する第一のサイクル工程において非イオン洗剤を使用する一方のサイクルおよび陽イオン洗剤を使用する他方のサイクルの間で添加する場合、同一のサンプルに対して行うことが可能である。
ルシフェラーゼ／ルシフェリン系に対する抽出物の影響は重要であることが知られており（例えば、Simpsonら、(1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2) pp97-106参照）、陽イオン洗剤は反応を可能にするが、ルシフェラーゼを徐々に不活性化することが知られており、陰イオン洗剤は反応を阻害し、非イオンおよび両イオン洗剤は広範囲にわたって増強することが知られている。0.15％の陽イオン洗剤および0.25％の第三ジアミン界面活性剤の混合物（Celcis, Cambridge, UK製）は、本発明の目的には十分であることが分かったが、同一溶液に共存する場合、アデニル酸キナーゼおよびルシフェラーゼ活性の最適混合物を生じる他の「抽出剤」のスクリーニングは、当業者であれば問題ないであろう。
全ての必須工程、すなわちＡＤＰのＡＴＰへの変換および続くルシフェラーゼのルシフェリンに対する作用が完了した後に混合物から発する光は、光検出器内で例えば発光測定管によるサンプル体積の滞留によって、ルシフェラーゼおよびルシフェリンまたは必須工程を促進することができる他の試薬を添加した直後、あるいは添加と同時に測定することができる。
本発明の第二の態様では、本発明方法に必要な必須試薬、すなわち、アデノシン二リン酸、マグネシウムイオン源ならびに好ましくはルシフェラーゼおよびルシフェリンを含むテストキットを提供する。好ましくは、該キットは、これらの試薬全てを含み、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは単一の試薬溶液として供給し、アッセイしようとする標的細胞の破砕に適する洗剤試薬をそのキットに含む。通常、微生物のアッセイに対しては、陽イオン洗剤のみが必要であるが、菌の胞子および体細胞の存在がかなりありそうな場合は、さらに非イオン洗剤を含めて、それらの数を評価してもよい。キットは、単一パッケージの形状であり、好ましくは、本発明方法を実施する方法に関する使用説明書を含む。試薬は容器に入れ、直接の使用または希釈後の使用に適する濃度である。
マグネシウムイオンは、ＡＤＰのＡＴＰへの変換(conversion)が始まる前にこれを添加すべき場合は、ルシフェラーゼ／ルシフェリンとともに供給するのが適しているが、その試薬のＥＤＴＡまたはリン酸塩に結合する量よりも過剰にすべきであり、アデニル酸キナーゼおよびルシフェラーゼの両方の要求量を受け入れるように最適化すべきである。微生物の検出の場合、マグネシウムイオンは、好ましくは、サンプル採集／希釈緩衝液とともに供給するが、特定用途の場合は、他の様式が好ましい可能性がある。最も便利なのは、マグネシウムイオンをサンプル採集または希釈緩衝液とともに供給し、ＡＤＰは洗剤／界面活性剤抽出剤および所望によりＥＤＴＡなどの安定剤とともに供給し、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは一緒にして供給し、こうして、３試薬のテストキットを提供する。あるいは、これらの試薬は、それらが使用前に相互作用して、例えばＡＤＰの分解(degradation)を引き起こすことがないように凍結乾燥した単一の試薬として供給してもよい。
本発明の好ましいテストキットは、純度が99.999％より高いＡＤＰ試薬、およびＢＳＡを含みアデニル酸キナーゼ活性は実質的にないルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を含む。あるいは、キットの使用説明書および／またはそれらの相対濃度において示される使用するルシフェラーゼ／ルシフェリン比は、ルシフェラーゼが十分速くルシフェリン基質に作用して、最初の光放出が終わった後にルシフェラーゼ結合アデニル酸キナーゼがＡＴＰを産生することができるようにする。すなわち、微生物由来のアデニル酸キナーゼは、迅速な動力学反応によって示され、汚染物ＡＴＰはグロー（glow）によって示される。
好ましい精製試薬は、上記方法によって提供することができる。なお、ルシフェラーゼ中のアデニル酸キナーゼ活性は、ルシフェラーゼを数カ月または数年放置することにより消散させることもできる。
次に、本発明の方法、装置、試薬およびキットの例を、下記実施例および図を参照して説明するが、下記実施例および図は本発明を限定するものではない。本発明のさらに別の態様は、これらに照らしてみれば、当業者には明らかである。
図面の説明
図１は、本発明の改善されたアッセイを使用し、ルシフェリン／ルシフェラーゼ添加の前に１分および５分インキュベートすることによる、発光測定器の信号の対数(log)を200μlのサンプルにおける大腸菌の数の対数(log)に対してプロットした図である。
図２は、マグネシウムの非存在下で、発光測定器の信号の対数(log)を大腸菌の細胞数の対数(log)に対してプロットした図である。
図３は、ｐＨ7.5およびｐＨ8.0における一定数のP. aeruginosaに由来する発光測定器の信号に対するマグネシウムイオン濃度の影響を示す図であり、マグネシウムを添加しない場合に対して10倍増加したことを示す。
実施例１：精製アデノシン二リン酸試薬の調製
20mMのリン酸カリウム（ｐＨ4.6）で平衡化し、５mlの１mMＡＤＰ（2.1mg）をロードした５mlのEconopac Qカートリッジ(RTm)（Biorad-RTm）を使用して市販の高純度（＞99.95％）ＡＤＰ(Sigma)を、液体クロマトグラフィーでさらに精製した。溶離は、400mMまでの段階的ＫＰi濃度により行った。ＡＤＰは強く保持されており、約340mMのＫＰiのピークとして溶離された。系にポンプ（５ml／分）およびグラジエントミキサーをセットし、全部で200mlに50〜１Ｍの勾配のＫＰiを供給し、５mlの画分を集めた。ＡＤＰが画分12と17との間に鋭いピークとして溶離されるとともに、ＡＴＰがその勾配の終わりに現れ始めた。残りのＡＴＰは、１Ｍまでの〔ＫＰi〕段階で溶離された。このカラムからの最も純粋なＡＤＰ画分は、ＡＴＰが２×10-8モル％未満であった。
実施例２：アデニル酸キナーゼを含まないルシフェラーゼ試薬の調製
アデニル酸キナーゼ活性を、乾燥状態での12カ月間にわたる高い室温（約30℃）での数カ月を含む老化(aging）により、市販のルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Biotrace HM(RTm)）から消散させた。
実施例３：キナーゼを含まないルシフェラーゼ試薬の別の調製
市販のルシフェラーゼを、上記したBlue Sepharose(RTm)を使用し、Devineら(1993)の方法によるカラムクロマトグラフィーを使用して精製する。
実施例４：アデニル酸キナーゼを含まないＢＳＡの調製
Sigma Fraction V（RIA Grade, Cat. No. A-7888）ＢＳＡを、200mlの滅菌水中で１％w/vとし、最初のｐＨを5.6とした。この50mlのサンプル２つを100ml容のDuranビンに入れ、残りは、5MＮａＯＨを使用してｐＨ10とし、２つのDuranの各々に50ml入れた。微生物の増殖を防ぐための保存剤として、チメロサールを最終濃度0.02％にして添加し、そのびんを37℃または50℃で24時間インキュベートした後、各々のｐＨを５ＭのＨＣｌまたは５ＭのＮａＯＨの適する方で7.6に再調整した。アデニル酸キナーゼ活性の測定を、上記で調製した100μlのＢＳＡサンプルを100μlの30mM酢酸マグネシウム溶液と混合し、得られた混合物を発光測定器の3.5ml容発光測定管に入れ、実施例１で調製した100μlのＡＤＰ溶液ならびにカラムクロマトグラフィーおよび化学的に処理したＢＳＡの使用によりアデニル酸キナーゼ活性を含まないように調製した100μlのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Celcis, Cambridge UK）を添加することにより行った。５秒後に、10秒間にわたる光の放出を測定してコンピューターに記録し、10秒間の読み取りを全部で10連続行ってＡＴＰ産生速度を求めた。分析は、二重に行った。検定は、10ng/ml（91 femtomole）のＡＴＰ水溶液５μlから放出される光の測定を４回行うことにより行った。平均の信号は、2950／femtomoleであった。
結果：37℃でインキュベートしたＢＳＡサンプルは透明なままであったが、50℃の場合は沈殿を生じ、それは、ｐＨ10ではわずかであり、ｐＨ5.6では非常に多かった。ｐＨ10および50℃ではわずかな変色があった。これらのサンプルに残っているアデニル酸キナーゼ活性を下記表１に、発光測定器の計数／分によって表す。
ｐＨ10および50℃のサンプルは、２週間後ですら変色の増加により使用できなくなったので、より長期間の場合は、さらに温和な不活性化を使用するか、あるいは、どんな期間でも保存しようとする場合は、直ちに凍結乾燥するのが好ましい。37℃のサンプルは、この方法では変わらなかったので、インキュベーション時間を延ばすことによりアデニル酸キナーゼ活性のないＢＳＡを安定にするための良好な範囲である。Biotrace HM(RTm)試薬が、40℃での保存の後、乾燥状態でその活性を失ったという事実は、その可能性を示すものである。
ルシフェリン／ルシフェラーゼの市販調製物は、通常、ＢＳＡを必要なものとして含む。上記実施例４で述べたように化学的に処理した。またはアセチル化ＢＳＡとして市販されているＢＳＡ（例えば、BDHまたはSigma）を、アデニル酸キナーゼ活性が10-9Uアッセイ体積（すなわち、300μl）未満であるCelcis LDRルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬を与えるような他の標準的なCelcis試薬とともに通常の割合でアデニル酸キナーゼを含まないルシフェラーゼと混合した。
実施例６：本発明のテストキット
本発明のテストキットは、下記容器から成る。
（ｉ）サンプルを採集／希釈するための15mMの酢酸マグネシウム溶液を保持する容器；
（ii）0.2mMのＥＤＴＡならびに、0.15％の陽イオン洗剤および0.25％の三級ジアミン界面活性剤の混合抽出剤をさらに含む、リン酸カリウム緩衝溶液（7.5mM、ｐＨ6.5）における0.3mM濃度の実施例１で調製した精製ＡＤＰ溶液（ＡＴＰに関して＞99.99999998％純粋）を保持する容器；
（iii)アデニル酸キナーゼが10-8U/100μl未満である、ルシフェリン／ルシフェラーゼLDR（Celcis, Cambridge, UK）生物発光試薬を保持する容器。
所望により、該パッケージは、非イオン洗剤溶液（Triton X-100(RTm)0.2％またはそれと同等のもの）の容器、および／またはサンプルに対する非イオン洗剤の作用により放出されるＡＴＰを破壊して陽イオン洗剤の添加による再アッセイに適するようにするためのアピラーゼなどのＡＴＰアーゼを保持する容器を含む。
実施例７：本発明の方法を使用する既知量の大腸菌のアッセイ
200μlのリン酸緩衝塩水（ｐＨ7.4）につき約2.2×107個の微生物を含む１週齢の大腸菌培養物をストックとして使用し、マグネシウムイオンを含む採集／希釈試薬（実施例６の（ｉ））で順次10倍希釈して、200μlのサンプルにつき107〜0.1個の微生物を含むサンプルを作った。
各200μlのサンプルを3.5ml容の発光測定管に添加し、100μlのＡＤＰ／抽出剤試薬（実施例６の（ii））を添加して、全体積300μlの混合物を室温で１〜５分インキュベートした。インキュベーションが終了すると、100μlの改良Celcis LDR生物試薬（上記実施例６の（iii)）を添加し、放出される光の最初の10秒間測定した後、10秒間隔で１分間測定し、Biotrace M3 (RTm)発光測定器を使用して累積様式で光の増加を求めた。最後の測定値から最初の信号値を差し引いて、１分間当たりの信号（カウント）を得た。
本発明方法の効果は、図１を参照することにより示すことができる。図１は、大腸菌と、ＡＤＰとともに５分インキュベートした後のサンプル混合物によって放出された光との間の統計的に有効な直線的応答が、１サンプル当たり10個の生物に対して得られ、100個以上の生物に対しては１分のインキュベーションで上向きとなり、どちらの場合も、検出限界は約10個の微生物である。これは、１分のインキュベーションの後の100個の生物による相違がほんの26cpmであり、1000個の場合は67cpmであり、直線的応答は1000個以上の細胞に対してのみ得られるPCT出願公開WO 94/17202の方法と比較して非常に有利である。本発明方法での１サンプルに対する1000個の細胞による信号の増加は、比較すると、１分後に数千cpmとなる。
理解されるように、サンプルにおける未知量の微生物に対するアッセイを本発明方法を使用して行うために、検量線を、図１および２に示すように（例えば、対数値として）既知数の微生物を発生測定器のカウントに対してプロットすることにより作成し、未知数の微生物（０個の生物を含む）を含むサンプルのカウント数を同じプロトコールを使用して誘導し、そのサンプルの微生物数を、その検量線上の同じカウント数に対応するものとして推定することができる。
当業者であれば理解されるように、特定の微生物（例えば、細菌）に存在するアデニル酸キナーゼの量は、他の微生物とは異なる可能性がある。例えば、酵母は、その大きさのために、細菌よりも多くのアデニル酸キナーゼを含み、実際、個々の酵母はこの方法によって検出することができる。すなわち、所与の微生物に対しては特定の検量線が必要であり、同じ微生物でも異なる状態（例えば、弱められた、ｐＨストレスのある、または酸素ストレスのある生物）に対してはそのような検量線を作成する必要があると考えられる。しかし、既存のＡＴＰに基づく方法に対する本発明方法のさらに別の利点は、アデニル酸キナーゼ含量が、細胞代謝により消耗されるかなり変化し得るＡＴＰ含量よりも細胞数とより密接に関係するということである。
Claims (41)
- サンプル中に存在する微生物細胞および／またはその全細胞内物質の存在および／または量を測定する方法において、そのサンプル中のアデニル酸キナーゼの量を、サンプルをマグネシウムイオンの存在下でアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）と混合し、このＡＤＰからそのサンプルによって産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量を測定し、そのようにして産生したＡＴＰの量をアデニル酸キナーゼの存在および／または量と関連づけ、かくして微生物細胞および／またはその全細胞内物質の存在および／または量と関連づけることにより推定することを特徴とする方法。
- マグネシウムイオン源を試薬として添加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- サンプルを水性懸濁物または溶液の形態で供給し、微生物細胞および／またはその全細胞内物質の推定は、存在するアデニル酸キナーゼによりＡＤＰがＡＴＰに変換される条件下でＡＤＰをサンプルに添加し、該サンプルを予め定めた時間インキュベートして該変換を行い、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、サンプルから放出される光の量を測定し、それを微生物細胞および／またはその全細胞内物質の存在および量と関連づけることにより行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
- 混合物中のＡＤＰ濃度が０．００５ｍＭより多い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- ＡＤＰが０．０８ｍＭより多いことを特徴とする請求項４に記載の方法。
- ＡＤＰ濃度が０．１ｍＭであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- ＡＤＰからＡＴＰへ変換する際の懸濁物または溶液中のマグネシウムイオンの濃度が１ｍＭ以上であることを特徴とする請求項１〜６いずれか一項に記載の方法。
- 懸濁物または溶液中のマグネシウムイオンの濃度が１０ｍＭ以上であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- マグネシウムイオンが酢酸マグネシウムの形態で供給されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬を、ＡＤＰおよびマグネシウムイオン源と共に単一試薬としてインキュベーション開始時にサンプルに添加することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- マグネシウムイオン源およびＡＤＰを使用前は乾燥形態または別々の溶液で保存し、使用直前またはＡＤＰ変換ステップで一緒にするか水溶液にすることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- マグネシウムイオン源およびサンプルを、ＡＤＰを添加する前に混合することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルを、マグネシウムイオン源を含む溶液中に採集するか該溶液で希釈することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- ＡＤＰのＡＴＰへの変換を、ｐＨ５．５〜８．５で行うことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- ＡＤＰ中のＡＴＰモル％が０．００１％未満であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- ＡＤＰ中のＡＴＰモル％が２×１０-8以下であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- ＡＤＰが混入するアデニル酸キナーゼにより早まってＡＴＰに変換されるのを防ぐために、ＡＤＰをキレート剤の存在下で保存することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬中のアデニル酸キナーゼ含量が１０-7Ｕ／ｍｌ未満であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
- ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬が、化学的に処理されてそのアデニル酸キナーゼ活性を消散させたウシ血清アルブミンを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- サンプルを、微生物細胞を破砕してそのアデニル酸キナーゼを放出させる抽出剤で処理することを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が菌類胞子または体細胞であり、抽出剤が非イオン性洗剤からなることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 細胞全部を検出しおよび／または定量するものであり、抽出剤が陽イオン性洗剤からなることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 抽出剤がさらに界面活性剤を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
- 細胞が細菌細胞であり、非イオン性洗剤によって放出されるＡＴＰを陽イオン性洗剤および界面活性剤によって放出されるＡＴＰから差し引いた残りが細菌細胞数に関係することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- ＡＤＰと、ＡＤＰのＡＴＰへの変換が生じるように微生物のアデニル酸キナーゼをこれらにさらすための抽出剤とマグネシウムイオン源とを含んでなる、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法により微生物細胞および／またはその全細胞内物質を検出および／または定量するためのテストキット。
- さらにマグネシウムイオン源を含むことを特徴とする請求項２５に記載のテストキット。
- マグネシウムイオン源がサンプルの採集または希釈溶液として提供されることを特徴とする請求項２６に記載のテストキット。
- 採集または希釈緩衝液が酢酸マグネシウムを含むことを特徴とする請求項２７に記載のテストキット。
- さらに、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを、ＡＴＰの存在下で光を放出することができる生物発光試薬の形態で含むことを特徴とする請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のテストキット。
- ＡＤＰが洗剤および／または界面活性剤抽出剤と一緒になっていることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のテストキット。
- ＡＤＰ、マグネシウムイオン源および生物発光試薬が３個の別々の容器で提供されることを特徴とする請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のテストキット。
- 試薬全部が単一の凍結乾燥試薬として提供されることを特徴とする請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のテストキット。
- ＡＤＰの純度がＡＴＰに関して９９．９９９モル％より高いことを特徴とする請求項２５〜３２のいずれか一項に記載のテストキット。
- アデニル酸キナーゼ活性が１０-7Ｕ／ｍｌ未満である生物発光試薬を含むことを特徴とする請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のテストキット。
- 生物発光試薬が、化学的に処理されてアデニル酸キナーゼ活性を消散させたウシ血清アルブミンからなることを特徴とする請求項３２に記載のテストキット。
- ＡＴＰに関する純度が９９．９９９％より高いＡＤＰを含む試薬を含む請求項２５〜３２のいずれか一項に記載のテストキット。
- さらに、混入したアデニル酸キナーゼによるＡＤＰのＡＴＰへの変換を防ぐのに十分な量のキレート剤を含むことを特徴とする請求項３６に記載のテストキット。
- キレート剤がＥＤＴＡからなることを特徴とする請求項３７に記載のテストキット。
- ＡＴＰに関する純度が９９．９９９％より高いＡＤＰを含む、請求項１に記載の方法に使用するための試薬。
- さらに、混入したアデニル酸キナーゼによるＡＤＰのＡＴＰへの変換を防ぐのに十分な量のキレート剤を含むことを特徴とする請求項３９に記載の試薬。
- キレート剤がＥＤＴＡからなることを特徴とする請求項４０に記載の試薬。
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