NO318646B1 - Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor - Google Patents
Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor Download PDFInfo
- Publication number
- NO318646B1 NO318646B1 NO19970105A NO970105A NO318646B1 NO 318646 B1 NO318646 B1 NO 318646B1 NO 19970105 A NO19970105 A NO 19970105A NO 970105 A NO970105 A NO 970105A NO 318646 B1 NO318646 B1 NO 318646B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- adp
- atp
- stated
- sample
- adenylate kinase
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 title abstract 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 96
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims abstract description 72
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims abstract description 61
- 102000002281 Adenylate kinase Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108020000543 Adenylate kinase Proteins 0.000 claims abstract description 60
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims abstract description 38
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 38
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 23
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 7
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims description 6
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 5
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000004985 diamines Chemical group 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005293 duran Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 229960001596 famotidine Drugs 0.000 description 2
- SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikrorganismer og/eller deres intracellulære materiale tilstede i en prøve, reagens for anvendelse i slik fremgangsmåte og testkit som omfatter essensielle reagenser for å gjennomføre fremgangsmåten.
Alle levende organismer anvender adenosintrifosfat (ATP) som en kilde for kjemisk energi og det er kjent å analysere denne ved anvendelse av den ATP-drevne luciferase/luciferin-reaksjonen. Lys dannet ved denne enzymatiske reaksjon kan måles ved anvendelse av et luminometer og relateres til mengden tilstedeværende ATP. Anvendbarheten av ATP som en indeks på mikrobetall har vært kjent siden midten av 1960-årene (se ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology
(1989), Stanley et al.: Blackwell Scientific Publications, London, se sider 1-10), og den viktigste fordel dermed er hastighet og sensitivitet. Anvendelse av dette analyseformat bevirker at enkle prøver kan analyseres i løpet av minutter mens komplekse prøver rutinemessig kun tar en halv time med en deteksjonsevne helt ned til IO"<12> mol/l ATP. Der er imidlertid et behov for metoder som tilveiebringer ytterligere sensitivitet i forbindelse med å detektere mikroorganismer eller deres innhold idet man bibeholder hastighet og enkelhet med hensyn til utførelse.
Man har nå funnet at hastighet og sensitivitet til den ATP-baserte metode kan økes signifikant ved å flytte målet for analysen fra ATP til et enzym som danner dette, særlig adenylatkinase. Adenylatkinase er et enzym som anvendes av alle organismer for omdannelse av adenosindifosfat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP). Targetiseringen av dette enzym fremfor ATP, ved anvendelse av den foretrukne fremgangsmåte, reagenser og kit i henhold til oppfinnelsen, tillater deteksjon helt ned til minst IO"<20> mol intracellulær markør adenylatkinase.
Det er kjent å analysere adenylatkinase ved anvendelse av luciferase/luciferinsystemet (se Brolin et al., Journal of
Biochemical and Biophysical Methods l (1979), 163-169, og Shutenko et al., Bioteknologiya, nr. 4 (1988), 542-547) for det formål å bestemme dens aktivitet og dette er blitt anvendt for å studere bestemte pattedyr- og plantevev (f.eks. se Rodionova et al., Fiziologiya Rastenii (1978) 25, 4, side 731-734) . Anvendelsen av et slikt analysesystem for deteksjon og analyse av mikroorganismer er imidlertid ikke blitt foreslått og fordelene med å gjøre dette, dvs økt sensitivitet som således tilveiebringes, har ikke vært relevant for dem som studerer selve enzymet.
Skjønt adenylatkinase er tilstede i mindre mengder enn ADP eller ATP, tilveiebringer anvendelsen derav som en biologisk markør for mikroorganismer økt sensitivitet med en typisk tilgjengelig amplifikasjon på 400.000 ved å måle tilstedeværelsen derav gjennom det ATP som den produserer, dvs at for hvert mol enzym tilstede blir 400.000 mol ADP omdannet til ATP i løpet av ti minutters inkubasjon. Således vil estimering av enzymet ved å måle substratet eller produktet av reaksjonen som det katalyserer tillate deteksjon helt ned til IO"<20> mol.
Søkerens samtidige PCT-søknad WO94/17202 vedrører den gene-relle metode for estimering av mikroorganismer i en prøve ut fra prøvens evne til å omdanne ADP til ATP, og hvor man relaterer dette til tilstedeværelsen av mikroorganismer eller deres intracellulære materialer. Søknaden eksemplifiserer metoden hvor magnesiumioner, som er nødvendige for reaksjonen av to molekyler ADP med hvert adenylatkinase aktivt sete, ikke tilsettes som et reagens men tilveiebringes ved tilstedeværende bakterieceller og som en forurensning i de andre reagenser. Antallet celler som detekteres i eksemplene ved anvendelse av en slik teknikk viste seg å være omtrent 10<2>, idet resultater av en mere statistisk valid natur oppnås ved IO<3> eller mer, idet en lineær sammenheng mellom luminometritellinger og celletall således kan oppnås.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret teknikk hvor adenylatkinaseaktivitet måles på en optimalisert måte ved anvendelse av reaksjonsbetingelser hvor magnesiumioner tilføres ADP-omdannelsesreaksjonen, og hvor de reagenser som anvendes er behandlet for å bringe adenylatkinase til høyere grader av renhet hvorved antallet av mikroorganismer som kan detekteres er i størrelsesorden titalls istedet for hundre-talls pr. 200 fil prøve, og avlesninger med lineær sammenheng mellom celler og ATP-avledet lys er mulig helt ned til ti celler.
De ovennevnte fordeler kan oppnås med fremgangsmåten, testkitet samt reagenset ifølge den foreliggende oppfinnelsen slik de er definert med de i kravene anførte trekk.
I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikroorganismer og/eller deres intracellulære material tilstede i en prøve, som er kjennetegnet ved at mengden adenylatkinase i prøven estimeres ved å blande den med adenosindifosfat (ADP) og en kilde av magnesiumioner, tilsatt som et reagens, bestemme mengden av adenosintrifosfat (ATP) som dannes i prøven fra dette ADP, og relatere mengden av ATP som således er dannet til tilstedeværelsen og/eller mengden av adenylatkinase og til mikroorganismer og/eller deres intracellulære material. Magnesiumioner er passende tilsatt i en molar konsentrasjon som er tilstrekkelig til å tillate maksimal omdannelse av ADP til ATP. Mengden av magnesium som er tilsatt er foretrukket slik at der er tilstrekkelig til å gi ett mol magnesium for ett mol ADP slik at alle ADP-molekylene kan være forbundet med minst ett magnesiumion.
I foretrukne utførelsesformer av dette aspekt av oppfinnelsen er prøven tilveiebragt i form av en vandig suspensjon eller oppløsning og estimeringen av adenylatkinase, og således mikroorganismer og/eller intracellulært material i prøven, gjennomføres ved å tilsette ADP og magnesiumioner til prøven under betingelser hvorved enhver adenylatkinase tilstede vil omdanne ADP til ATP, inkubasjon av prøven i en forhåndsbestemt periode for å bevirke slik omdannelse, tilsette luciferase- og luciferinmidler, bestemme mengden lys som emitteres fra prøven og relatere denne til tilstedeværelse og mengde adenylatkinase.
Mengden ADP hvormed prøven blandes er foretrukket tilstrekkelig til å gi en ADP-konsentrasjon i blandingen ut over 0,005 mM, mere foretrukket ut over 0,01 mM og mest foretrukket ut over 0,08 mM. En særlig foretrukket mengde ADP i blandingen er omtrent 0,01 mM.
Der det anvendes reagenser som inneholder magnesiumion-uttømmende midler, f.eks. chelaterende/sekvestrerende midler slik som EDTA og fosfatbuffere, vil det, for å forsyne ADP med tilstrekkelig magnesiumioner for at det skal gjennomgå optimal omdannelse, være foretrukket at et overskudd av magnesiumioner er tilstede. For de foretrukne konsentrasjoner av ADP som er angitt i det foregående, er den foretrukne konsentrasjon av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen under omdannelsen av ADP til ATP 1 mM eller mere, ytterligere foretrukket 5 mM eller mere, og mest foretrukket 10 mM eller mere. Magnesiumionene kan tilveiebringes i form av et hvilket som helst magnesiumsalt, foretrukket som magnesiumacetat.
En ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilsetter luciferin/luciferaseluminometri-reagenser til prøven ved begynnelsen av inkubasjonen, foretrukket som et enkelt reagens med ADP og magnesiumionkilden. Luciferase lagres foretrukket separat fra ekstraktant.
I utførelsesformer av oppfinnelsen hvor alle reagensene er inkludert ved starten av omdannelsen av ADP til ATP på denne måte, og/eller hvor luminometertelling fortsettes etter luciferin/luciferasetilsetning hvor dette er et separat trinn, kan magnesium tilveiebringes ved luciferin/luciferase-reagenset. På grunn av bindingen av magnesiumioner ved EDTA og fosfat er det imidlertid nødvendig at mengden magnesiumioner sikres positivt ved forutgående forsøk eller beregning. Fagkyndige vil innse at den optimale mengde magnesiumsalt som skal tilsettes til et gitt ADP, prøve og luciferin/lucifer-aseblanding lett vil kunne bestemmes med rutineforsøk ved anvendelse av en prøve som inneholder en kjent mengde bakterier, f.eks. E. coli hvorved maksimale signaler oppnås. Fig. 3 gir en indikasjon på den optimale mengde magnesiumacetat som tilsettes til en blanding anvendt i eksemplene i det etterfølgende.
Idet Mg<2+->ioner forenkler ADP-deplesjon som skyldes kontaminerende adenylatkinase, er det foretrukket at de ikke holdes sammen i oppløsning før anvendelse, idet chelaterende middel som EDTA kan inkluderes i ADP for å forhindre dette. Magnesium og ADP bringes foretrukket sammen like før bruk eller i ADP-omdannelsestrinnet. Der hvor reagensene holdes sammen er det foretrukket at de holdes i frysetørket form for å unngå enhver for tidlig ADP-omdannelse til ATP.
Som angitt i det foregående, skjønt andre analyser kan anvendes, detekteres ATP foretrukket ved anvendelse av luciferin/luciferasesystemet som tilveiebringer et foto-metrisk detekterbart signal som er en indikasjon på mengden ATP i prøven. Luciferin/luciferasepreparater og metoder for deres anvendelse i analyse av ATP vil være kjent for fagkyndige på området og er kommersielt tilgjengelige (f.eks. se Brolin et al.). En typisk blanding inneholder f.eks. 0,1 til 10 mg/l lucif erase, 15 til 1000 fimol/ 1 D-luciferin og midler som MgCl2 (2,5 - 25 mmol), EDTA, BSA og pH 7 buffer (se f.eks. EP 054676).
For enkeltreagensbruk med adenylatkinasetestmetoder som beskrevet heri er det foretrukket at pH justeres til den verdi som er optimal for begge enzymer, dvs et kompromiss, slik at telling vil kunne fortsette mens ADP omdannes til ATP. Dette kan bestemmes ved rutineforsøk ved anvendelse av et kjent bakterietall i en prøve.
Prøven, ADP og magnesiumionkilden kan blandes i enhver buffer som tilveiebringer en pH som er egnet for adenylatkinasereak-sjonen, idet ingen andre reagenser er nødvendige. Således vil enhver buffer som tilveiebringer en pH mellom 5,5 og 8,5 kunne anvendes, idet den optimale pH ligger mellom pH 6 og 7, foretrukket pH 6,5. Eksempler på passende buffere inkluderer Tris og fosfatbuffere. Mest passende samles prøven og/eller fortynnes i en slik buffer med henblikk på gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Som med enhver amplifisert analyse, er sensitiviteten av adenylatkinaseanalysen i henhold til oppfinnelsen begrenset ved renheten til reagensene. I dette tilfellet er de signi-fikante kontaminanter ATP i ADP-substratet og adenylatkinase i luciferasepreparatet. For anvendelse som en sensitiv analyse for mikroorganismer, særlig hvor disse eventuelt kan være skadelige og hvor det er nødvendig å detektere dem i et lavt antall, er det nødvendig at renheten til hvert av reagensene er så høy som mulig når det gjelder substansen hvormed det skal reagere i analysen.
Idet man ser på det første problemet, blir kommersiell ADP med høy renhet (>99,5 % renhet) foretrukket anvendt etter rensning ved kolonnekromatografi. Dette er ønskelig fordi selv små mengder kontaminerende ATP kan være tilstrekkelig til å gi en høy bakgrunnsavlesning. Ved anvendelse av en dietylaminoetylcellulosekolonne og 0,02 mM saltsyreeluerings-middel, vil f.eks. ATP eluere saktere fra kolonnen enn ADP i en slik grad at det muliggjør substansiell separasjon. Andre kromatografimedier og elueringsmiddelkombinasjoner kan også anvendes til å gi en lignende effekt, f.eks. HPLC ved anvendelse av Nucleosil (registrert varemerke-RTM) kolonne-pakkingsmaterial (tilgjengelig fra Technicol, Stockport, Cheshire, UK), som Nucleosil 3 (RTM) og Nucleosil 5 (RTM), ved anvendelse av 0,06 M KH2P04:metanol i et 77:33 forhold v/v ved pH 6 med 5 mM tetrabutylammoniumhydrogensulfat. Fraksjoner med høye ADP til ATP-forhold beholdes for anvendelse og renhet bestemmes ved luciferin/luciferase-reagensmeditert bioluminescens etter adenylatkinasevirkning for å måle ADP-nivåer og uten adenylatkinase for å måle ATP-kontaminerende nivåer.
Ved anvendelse av en foretrukket Econopaq Q (RTM) sterk anionbyttergelpatron (Biorad-RTM) ekvilibrert med 20 mM kaliumfosfat ved pH 4,6 og eluering med KP^konsentrasjons-trinn opp til 400 mM, ble ADP funnet til å være sterkt retinert og eluerte som en koherent topp, hvor ATP eluerte deretter. På denne måte var ADP med en mol% ATP øvre grense på 2 x 10<*8> oppnåelig. Det reneste ADP som søkerne kjenner til fra litteraturen er 0,001 % (se Shutenko et al., nevnt i det foregående) og det tilveiebringes således ADP for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som har mindre enn 0,001 mol% ATP, mere foretrukket 2 x 10"<8> mol% eller lavere.
En ytterligere metode for å fjerne ATP fra ADP-substratet anvender enzymer som spesifikt nedbryter ATP, som luciferase eller apyrase. Slike enzymer kan også anvendes for å ytterligere rense kromatografisk renset ADP, eller alternativt kan enzymatisk renset ADP behandles ved kolonnekromatografi. Det skal bemerkes at apyrase også er en ADPase, men da noen er mere aktive på ATP og da ADP er tilstede ved mye høyere nivåer, er dette ikke noe signifikant problem.
Med hensyn til det andre problemet, er adenylatkinase, som et essensielt "housekeeping" enzym, tilstede i stort sett alle organismer og er generelt tilstede i luciferasepreparater. Det kan kun være en mindre kontaminant, men siden målet er å måle svært lave adenylatkinasenivåer i prøver, kan dets tilstedeværelse i luciferasen være en begrensende faktor. Søkerne har faktisk bestemt at, ved å definere en enhet (U) aktivitet som den mengde enzym som omdanner 1 //mol ADP til l ( imol ATP pr. minutt i nærvær av 0,5 mM ADP og 4,5 mM Mg<2+ >ved pH 7,8 og ved 20°C, kan kommersielle luciferaser inneholde IO"<7> U/ml eller mere adenylatkinseaktivitet mens luciferin, dens substrat, omfatter svært liten, om noen, aktivitet. Videre er det vanlig å stabilisere luciferasereagenser med en stabilisator, vanligvis et protein som bovint serumalbumin (BSA), og kommersielle preparater av dette er blitt bestemt av søkerne til å ha signifikant adenylatkinaseaktivitet.
Molekylvektene til luciferase- og adenylatkinase er svært forskjellige, henholdsvis 61 kD og 21 kD. Videre er luciferase et membranbundet protein og derfor relativt hydrofobt, mens adenylatkinase forekommer som et oppløselig enzym. Det er således mulig å fjerne adenylatkinase fra luciferasepreparater ved f.eks. størrelsesekskluderings-kromatografi, revers fasekromatografi eller begge. Alternativt eller i tillegg til dette kan problemet med adenylat-kinasekontaminering av luciferase unngås ved å tilsette de bioluminescerende reagenser (luciferase og luciferin) like før eller mens målinger utføres slik at enhver kontaminerende adenylatkinase ikke har tid til å gi en signifikant effekt.
Passende metoder for å rense luciferase anvender kolonnekromatografifraksjonering med en lavporøsitetsgel, f.eks. Sephadex G-25 (RTM) (se Nielsen og Rasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22 (1968), side 1757-1762), anvendelse av Sephadex (RTM) og Sepharose (RTM) kolonner (f.eks. Blue Sepharose) i serier og/eller SDS elektroforese (se Devine et al., Biochimica et Biophysica Acta 1172 (1993), side 121-132) eller aldring i en periode ved økt omgivelsestemperatur.
For å fjerne adenylatkinaseaktivitet fra midler som bovint serumalbumin er det likeledes mulig å anvende kolonnekroma-tograf i. En ytterligere behandling som har vist seg å være vellykket i denne forbindelse er kjemisk behandling av BSA slik at dets evne til å stabilisere luciferase bibeholdes, men hvor adenylatkinaseaktivitet reduseres eller fjernes helt. Enhver konvensjonell kjemisk behandling for deplesjonen av enzymatisk aktivitet fra proteiner kan likeledes anvendes for dette formål. Alternativt kan en ikke-protein luciferasestabilisator, f.eks. glyserol, anvendes som et supplement eller som en erstatning for BSA.
Søkerne har f.eks. funnet at kommersielt tilgjengelig BSA kan ha sin adenylatkinaseaktivitet redusert til under 2 % av den opprinnelige aktivitet eller mindre ved kun varmebehandling ved sur eller alkalisk pH. En passende effektiv behandling oppvarmer BSA ved pH 5,6 eller pH 10 ved 50°C i 24 timer. En ytterligere kilde av adenylatkinase-fri BSA er det kjemisk behandlede reagens acetylert-BSA, tilgjengelig fra Sigma og BDH. Fagkyndige på området vil vite at andre kjemisk behandlede BSAer også kan være egnet.
For å gjøre all adenylatkinasen assosiert med en targetmikro-organisme tilgjengelig for ADP, mangesiumionene og luciferase/luciferin analysereagensene i henhold til oppfinnelsen, vil det være nødvendig å nedbryte dem slik at intracellulært material frigis eller på annen måte eksponeres for reagensene. Slik nedbrytning vil kunne gjennomføres ved anvendelse av mekaniske midler som en ultralydgenerator, ved anvendelse av osmotisk sjokk eventuelt sammen med kuldesjokk eller slike midler som lysozym eller, mere passende, ved anvendelse av detergenter. Slike detergenter er kommersielt tilgjengelige og omtales vanligvis som "ekstraktanter". Typiske ekstraktanter inkluderer generiske kationiske detergenter som CTAB (cetyltrimetylammioniumbromid), og merkebeskyttede midler som Biotrace XM (RTM) ekstraktant (tilgjengelig fra Biotrace, Bridgend, UK), Celcis UK kationiske ekstraktanter og Lumac NRM (RTM) (nukleotid-frigivende middel tilgjengelig fra Lumac BV, Holland). Ved anvendelse av CTAB vil et passende preparat omfatte fra 0,01 til 1 % CTAB i vann, f.eks. 0,2 %, men andre konsentrasjoner vil klart fremgå for den fagkyndige på området.
Før tilsetning av ADP og luciferase/luciferinreagenset eller reagensene til en analyseprøve som antas å inneholde mikroorganismer, er det således foretrukket å bryte ned disse for å gjøre deres intracellulære innhold tilgjengelig for lumino-metrireagenser ved anvendelse av et middel for slik nedbrytning. Dersom det er ønskelig å skjelne mellom targetceller og celler slik som dem av soppsporer, er det mulig å utføre to separate analyser hvorav en behandles med en ikke-ionisk target som kun kan nedbryte disse sporer og multicellulære "somatiske" animalske celler (f.eks. Triton TX-100-RTM), og hvor den andre utføres med kationiske detergent "ekstraktanter" som er angitt detaljert i det foregående for å nedbryte alle celler. Det er mulig å gjennomføre disse analyser på den samme prøve dersom en ATPase som apyrase tilsettes mellom detergent/luciferase/målesyklusene, idet en syklus anvender ikke-ionisk og den andre kationisk detergent i et første syklustrinn med filtreringstrinn derimellom.
Effekten av ekstraktant på luciferase/luciferinsystemet er kjent til å være av viktighet {se f.eks. Simpson et al.
(1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2), side 97-106), idet kationiske detergenter er kjent for å potensere reaksjonen men gi gradvis inaktivering av luciferase, anionisk detergent er kjent for å inhibere reaksjonen, og ikke-ioniske og zwitterioniske detergenter er kjent for å potensere over et stort område. En blanding av 0,15 % kationisk detergent sammen med 0,2 5 % tertiært diaminsurfaktant (oppnådd fra Celcis, Cambridge, UK) ble funnet til å være tilfreds-stillende for de foreliggende formål, men de fagkyndige på området vil ikke ha noen problemer med å screene for andre "ekstraktanter" som gir en optimal blanding av adenylatkinase- og luciferaseaktivitet når de er tilstede samtidig i den samme oppløsning.
Lyset som avgis fra blandingen etter alle de essensielle trinn er komplett, dvs ADP-omdannelse til ATP og påfølgende virkning av luciferase på luciferin kan måles ved residens av prøvevolumet, f.eks. luminometerrør, i en lysdetektor umiddelbart etter eller samtidig med tilsetning av luciferase og luciferin eller andre midler som muliggjør en fortsettelse av de essensielle trinn.
I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et testkit som omfatter de essensielle reagenser som er nødvendige for fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, dvs adenosindifosfat, og en kilde for magnesiumioner sammen med en ekstraktant. Kitet inneholder foretrukket luciferase og luciferin. Kitet inkluderer foretrukket alle disse reagenser, med luciferase og luciferin tilveiebragt som en enkel reagensløsning, med et detergentreagens i kitet som er egnet for å nedbryte targetcellene for hvilke analysen er tilsiktet. Ved analyse av mikroorganismer er vanligvis kun kationisk detergent nødvendig, mens, dersom det er soppsporer og somatiske celler som sannsynligvis er viktige, da kan et ytterligere ikke-ionisk detergentreagens inkluderes for å bestemme deres antall. Kitet er i form av en enkel pakning som foretrukket inneholder instruksjoner vedrørende hvordan man utfører fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, idet reagensene tilveiebringes i beholdere og med en styrke som er egnet for direkte anvendelse eller anvendelse etter fortynning.
Det kan være passende å tilveiebringe magnesiumionene sammen med luciferase/luciferinreagenset dersom tilsetningen derav er før ADP til ATP-omdannelsen har startet, men de bør da være i overskudd i forhold til det som er bundet til EDTA eller fosfat i dette reagenset, og bør være optimalisert til å akkommodere både adenylatkinase- og luciferasekrav. For mikrobiell deteksjon er magnesiumioner foretrukket tilveiebragt med en prøvesamlings/fortynningsbuffer, men andre formater kan være foretrukket for spesielle anvendelser.
Mest passende er magnesiumionene tilveiebragt sammen med en prøvesamlings- eller fortynningsbuffer, ADP er tilveiebragt med detergent/surfaktantekstraktanter og eventuelt med en stabilisator som EDTA, og luciferase og luciferin er tilveiebragt sammen, idet man således får et tre-reagens testkit. Alternativt kan disse midler være tilveiebragt i form av et enkelt reagens som er frysetørket slik at de ikke interagerer til å gi nedbrytning av f.eks. ADP før anvendelse.
Et foretrukket testkit i henhold til oppfinnelsen inneholder ADP-reagens som har en renhet som er større enn 99,999 %, og et luciferase/luciferinreagens, inkluderende BSA, som hoved-sakelig ikke omfatter adenylatkinaseaktivitet. Alternativt er luciferase/luciferinforholdet som anvendes, som reflektert i kitinstruksjonene for bruk og/eller i deres relative konsentrasjoner, slik at luciferasen kan virke på luciferinsub-stratet tilstrekkelig hurtig slik at enhver luciferase-assosiert adenylatkinase produserer ATP etter at den initiale emisjon er avsluttet. Således vil mikroorganismeavledet adenylatkinase være indikert ved en flash-kinetisk reaksjon og kontaminerende ATP ved en gløding.
De foretrukne rensede reagenser kan tilveiebringes ved metoder som er beskrevet i det foregående. Det skal bemerkes at adenylatkinaseaktivitet i luciferase også kan fjernes ved å etterlate luciferasen for henstand i en periode på måneder eller år.
Oppfinnelsen skal nå illustreres nærmere ved hjelp av de etterfølgende eksempler og figurer.
Figurer:
Fig. 1 plotter log luminometersignal mot log antall E. coli i en 2 00 ^1 prøve ved anvendelse av den forbedrede analysemetode i henhold til oppfinnelsen ved anvendelse av en og fem minutters inkubasjoner før tilsetning av luciferin/luciferase. Fig. 2 plotter log luminometersignal mot log antall celler av
E. coli i fravær av magnesium.
Fig.3 viser effekten av magnesiumionkonsentrasjon på
luminometersignalet avledet fra et bestemt antall P. aeruginosa ved pH 7,5 og pH 8,0 som viser den ti ganger økning i forhold til tilfellet uten tilsatt magnesium.
Eksempel 1: Fremstilling av renset adenosindifosfatreagens Væskekromatografi ble anvendt for å ytterligere rense kommersiell ADP med høy renhet (>99,95 %) (Sigma) ved anvendelse av en 5 ml Econopac Q patron (RTM) (Biorad-RTM) ekvilibrert med 2 0 mM kaliumfosfat pH 4,6 og lastet med 5 ml l mM ADP
(2,1 mg) . Eluering ble utført ved KP^konsentrasjonstrinn opp til 400 mM hvorved ADP var sterkt tilbakeholdt og eluerte som en topp ved omtrent 34 0 mM KP±. Systemet ble oppstilt med en pumpe (5 ml/min) og en gradientblander, en gradient på fra 5 0 til 1 M KPi i totalt 2 00 ml ble frembragt og 5 ml
fraksjoner ble samlet. ADP eluerte som en skarp topp mellom fraksjoner 12 og 17 idet ATP begynte å vise seg på slutten av gradienten. Et trinn i [KP^ til l M eluerte det gjenværende
ATP. De reneste ADP-fraksjoner fra denne kolonne hadde mindre enn 2 x IO"<8> mol% ATP.
Eksempel 2: Fremstilling av adenylatkinase-frie
luciferasereagenser
Adenylatkinaseaktivitet ble fjernet fra kommersielt tilgjengelige luciferin/luciferasereagenser {Biotrace HM-RTM) ved aldring, inkluderende flere måneder ved høy omgivelsestemperatur (omtrent 30°C) over en periode på tolv måneder i tørr tilstand.
Eksempel 3: Alternativ fremstilling av kinase-frie
luciferasereagenser
Kommersielt tilgjengelig luciferase renses ved anvendelse av kolonnekromatografi ved hjelp av metoden etter Devine et al.
(1993) ved anvendelse av Blue Sepharose (RTM) som omtalt i det foregående.
Eksempel 4: Fremstilling av adenylatkinase-fri BSA
Sigma Fraction V (RIA Grade, Cat. No. A-7888) BSA ble tilberedt ved 1 % vekt/volum i 200 ml sterilt vann til å gi en utgangs pH lik 5,6. To 50 ml prøver av dette ble innført i 100 ml Duran-flasker, resten ble bragt til pH 10 ved anvendelse av 5 M NaOH og 50 ml ble innført i hver av to Duran-flasker. Thimerosal ble tilsatt til en 0,02 % slutt-konsentrasjon som et konserveringsmiddel for å forhindre mikrovekst og flaskene ble inkubert ved 3 7°C eller 50°C i 24 timer før pH i hver ble justert på ny til 7.6 med 5 M HC1 eller 5 M NaOH som passende. Adenylatkinaseaktivitet ble målt ved å blande 100 ( il BSA-prøve som fremstilt i det foregående med 100 /il 3 0 mM magnesiumacetatoppløsning, den oppnådde blanding ble anbragt i et 3,5 ml luminometerrør i et luminometer, og 100 ( il ADP-oppløsning fremstilt som i eksempel l og 100 ( il lucif erin/lucif erasereagens (Celcis, Cambridge, UK) som var fremstilt uten adenylatkinaseaktivitet ved anvendelse av kolonnekromatografi og kjemisk behandlet BSA ble tilsatt. Etter en fem sekunders ventetid ble lysemisjon integrert i løpet av ti sekunder målt og registrert på en datamaskin og totalt ti fortløpende tisekunders avlesninger ble utført for å bestemme ATP-produksjonsraten, idet analysene ble utført in duplo. Kalibrering ble utført ved anvendelse av fire gjentatte målinger av lys emittert fra 5 fil 10 ng/ml {91 femtomol) ATP i vann: gjennomsnittlig signal 2 950 per femtomol.
Resultater: BSA-prøven inkubert ved 37°C forble klar mens dem ved 50°C dannet et presipitat som var betydelig ved pH 10 og svært omfattende ved pH 5,6. Ved pH 10 og 50°C var der en lett misfarging. Adenylatkinaseaktivitet tilbake i disse prøver er vist i den etterfølgende tabell 1, som representert ved luminometertellinger pr. minutt.
Det anbefales at enda mildere inaktiveringsformer anvendes, med lengre varighet, eller at BSA umiddelbart frysetørkes, dersom det skal lagres i noe lengre tid, da selv prøven med pH 10, 50°C, ble ubrukelig etter to uker på grunn av økt misfarging. 3 7°C prøvene tapte seg ikke på denne måte og betyr derfor en bedre mulighet for å redusere stabil adenylatkinase-fri BSA ved å øke inkubasjonstiden. Det faktum at Biotrace HM (RTM) middelet tapte sin aktivitet i tørr form etter lagring ved 40°C viser mulighetene her.
Eksempel 5: Fremstilling av luciferin/luciferasereagens med
BSA
Kommersielle preparater av luciferin/luciferase inneholder vanligvis BSA som en nødvendighet. BSA som er kjemisk behandlet som angitt i eksempel 4 i det foregående eller som er kommersielt tilgjengelig som acetylert BSA {f.eks. BDH eller Sigma) ble blandet med adenylatkinase-fri luciferase i normale mengdeandeler sammen med andre standard Celcis-midler til å gi et Celcis LDR luciferin/luciferase luminescens-reagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn 10"<9>U prøve-volum {dvs 3 00 fil) .
Eksempel 6: Testkit i henhold til oppfinnelsen
Et testkit i henhold til oppfinnelsen er tilveiebragt som utgjøres av følgende: (i) en beholder som inneholder 15 mM magnesium-acetatoppløsning for samling/fortynning av prøver, (ii) en beholder med renset ADP-oppløsning (>99,99999998 % ren med hensyn til ATP) fremstilt som beskrevet i eksempel 1 i en konsentrasjon på 0,3 mM i kaliumfosfat (7,5 mM pH 6,5) bufferoppløsning som ytterligere omfatter 0,2 mM EDTA og en blandet ekstraktant av 0,15 %
kationisk detergent og 0,25 % tertiær diaminsurfaktant, (iii) en beholder som inneholder luciferin/luciferase LDR (Celcis, Cambridge, UK) bioluminescensreagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn 10"<8>U/100 fil.
I pakningen er det eventuelt inkludert en beholder med ikke-ionisk detergentoppløsning (Triton X-100 (RTM), 0,2 % eller ekvivalent) og/eller en beholder som inneholder en ATPase som apyrase for nedbrytning av ATP frigitt ved virkningen av den ikke-ioniske detergent på en prøve som gjør den egnet for re-analyse ved tilsetning av den kationiske detergent.
Eksempel 7: Analyse av kjente mengder E. coli ved anvendelse
av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen
En en uke gammel E. coli kultur som inneholder omtrent
2,2 x IO<7> mikroorganismer pr. 200 fil fosfatbufret saltløsning med pH 7,4 ble anvendt som stamløsning og fortynnet i ti på-
følgende fortynninger med samlings/fortynningsreagenset inneholdende magnesiumioner ((i) i eksempel 6) til å gi prøver som strekker seg fra IO<7> til 0,1 mikroorganismer pr.
2 00 fil prøve.
Hver 200 fil prøve ble tilsatt til et 3,5 ml luminometerrør. 100 fil ADP/ekstraktantreagens ((ii) i eksempel 6) ble tilsatt og blandingen, totalt volum på 300 fil, ble inkubert ved rom-temperatur i ett eller fem minutter. Etter endt inkubasjon ble 10 0 fil modifisert Celcis LDR bioluminescensreagens, ( (iii) i ovennevnte eksempel 6), tilsatt og lyset som emitterte ble bestemt over et første ti sekunders intervall og deretter over ti sekunders intervaller i opp til ett minutt for å bestemme økningen i lys, på en kumulativ måte, ved anvendelse av et Biotrace M3 (RTM) luminometer. Den innledende signalverdi ble subtrahert fra den endelige avlesning for å oppnå et mål på signalet i tellinger pr. minutt.
Effektiviteten av den foreliggende fremgangsmåte vil fremgå under henvisning til fig. 1 hvor statistisk valid lineær respons mellom antall E. coli og lys emittert med prøve-blandingen etter fem minutters inkubasjon med ADP oppnås for ti organismer pr. prøve og mere, for 100 organismer og mere med en ett minutts inkubasjon, og en deteksjonsgrense på omtrent ti organismer er gitt i begge tilfeller. Dette faller svært gunstig ut ved en sammenligning med metoden ifølge WO94/17202 som gir en forskjell på kun 26 cpm etter en ett minutts inkubasjon med 100 organismer og 67 cpm med 1000, idet lineære responser kun oppnås med 1000 celler og derover. Til sammenligning gir 1000 celler pr. prøve i den foreliggende fremgangsmåte en signaløkning på flere tusen cpm etter ett minutt.
Det skal bemerkes at for å utføre en analyse for et ukjent antall mikroorganismer i en prøve ved anvendelse av den foreliggende fremgangsmåte, kan en kalibreringskurve tilveiebringes ved å plotte kjente antall mikroorganismer mot luminometertellinger som vist i fig. 1 og 2 (f.eks. som log-verdier), utlede et antall tellinger fra en prøve som inneholder det ukjente antall mikroorganismer (inkluderende null organismer) ved anvendelse av den samme prosedyre, og estimere antallet mikroorganismer i prøven til å være det som svarer til det samme antall tellinger på kurven.
Den fagkyndige på området vil se at mengden adenylatkinase tilstede i en spesiell mikroorganisme, f.eks. bakterier, kan variere sammenlignet med andre mikroorganismer. Gjær inneholder f.eks. mer adenylatkinase enn bakterier i kraft av deres størrelse, og enkelt-gjærceller kan faktisk detekteres ved denne metode. For en gitt mikroorganisme kan Båledes en spesiell kalibreringskurve være påkrevd, og det kan være nødvendig å tilveiebringe slike kurver for forskjellige tilstander i den samme mikroorganisme, f.eks. for svekkede, pH- eller oksygenstressede organismer. En ytterligere fordel med den foreliggende fremgangsmåte i forhold til den eksisterende ATP-baserte metodologi er at adenylatkinase-innholdet vil være mye mere i samsvar med celletallet enn det svært variable ATP-innhold som forbrukes ved celle-metabolisme.
Claims (38)
1. Fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikrorganismer og/eller deres intracellulære materiale tilstede i en prøve,
karakterisert ved at mengden av adenylatkinase i prøven estimeres ved å blande prøven med adenosindifosfat (ADP) og en kilde av magnesiumioner, tilsatt som et reagens, bestemme mengden av adenosintrifosfat (ATP) dannet i prøven fra dette ADP, og relatere mengden av ATP som således er dannet til tilstedeværelsen/eller mengden mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori magnesiumionene tilsettes i en molar konsentrasjon som er tilstrekkelig til å tillate maksimal omdannelse av ADP til ATP.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, hvori mengden av magnesiumioner som tilsettes er slik at der er tilstrekkelige magnesiumioner tilstede til å gi ett mol magnesium for ett mol ADP, slik at alle ADP-molekylene kan være forbundet med minst ett magnesiumion.
4. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, hvori prøven tilveiebringes i form av en vandig suspensjon eller oppløsning og estimeringen av mikroorganismer og/eller intracellulært materiale deri gjennomføres ved å tilsette ADP og magnesiumioner til prøven under betingelser hvorved eventuelt adenylatkinase tilstede vil omdanne ADP til ATP, prøven inkuberes i en forhåndsbestemt periode for å gjennomføre slik omdannelse, luciferase- og luciferinmidler tilsettes, mengden av lys emittert fra prøven bestemmes og denne relateres til tilstedeværelse og mengde av mikroorganismer og/eller intracellulært materiale.
5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, hvori mengden ADP hvormed prøven blandes er tilstrekkelig til å gi en ADP-konsentrasjon i blandingen ut over 0,005 mM.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, hvori ADP er mer enn 0,08 mM.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, hvori ADP-konsentrasjonen er omtrent 0,1 mM.
8. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori konsentrasjonen av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen under omdannelse av ADP til ATP er 1 mM eller mere.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, hvori konsentrasjonen av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen er 10 mM eller mere.
10. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionene tilveiebringes i form av magnesiumacetat.
11. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori luciferin/luciferaseluminescens-reagensene tilsettes til prøven ved begynnelsen av inkubasjonen som et enkelt reagens med ADP og magnesiumionkilden.
12. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionkiIden og ADP holdes i tørr form eller i separate oppløsninger før anvendelse og bringes sammen eller bringes til en vandig oppløsning umiddelbart før bruk eller i ADP-omdannelsestrinnet.
13 . Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionkilden og prøven blandes sammen før tilsetning av ADP.
14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, hvori prøven samles eller fortynnes i en oppløsning omfattende magnesiumionkilden.
15. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori omdannelsen av ADP til ATP gjennomføres ved en pH på mellom 5,5 og 8,5.
16. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori ADP har en molar% ATP på mindre enn 0,001 %.
17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, hvori ADP har en molar % ATP på 2 x IO"<8> eller lavere.
18. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, hvori ADP lagres i nærvær av et chelaterende middel for å forhindre at kontaminerende adenylatkinase omdanner det til ATP for tidlig.
19. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori luciferase/luciferinreagenset har et adenylatkinaseinnhold på mindre enn 10"<7>U/ml.
20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, hvori luciferase/luciferinreagenset omfatter bovint serumalbumin som er blitt kjemisk behandlet for å fjerne dets adenylatkinaseaktivitet.
21. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori prøven behandles med en ekstraktant som nedbryter mikroorganismeceller og eksponerer deres adenylatkinase for ADP og magnesiumionene.
22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori cellene er soppsporer eller somatiske celler og ekstraktanten omfatter en ikke-ionisk detergent.
23. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori alle celler skal detekteres og/eller kvantifiseres og ektraktanten omfatter en kationisk detergent.
24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, hvori ekstraktanten videre omfatter en surfaktant.
25. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori cellene er bakterieceller hvor ATP frigitt ved ikke-ionisk detergent subtraheres fra ATP frigitt ved kationisk detergent og surfaktant, og hvor resten er relatert til bakteriecelleantall.
26. Testkit for deteksjon og/eller kvantifisering av mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale ved hjelp av en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 -25, karakterisert ved at kitet omfatter ADP og en kilde for magnesiumioner sammen med en ekstraktant for å eksponere mikroorganisme-adenylatkinase for disse slik at omdannelsen av ADP til ATP finner sted.
27. Testkit som angitt i krav 26, som ytterligere omfatter luciferase og luciferin i form av et bioluminiscensreagens i stand til å emittere lys i nærvær av ATP.
28. Testkit som angitt i krav 27, hvori kilden for magnesiumioner er tilveiebragt som en prøvesamlings- eller prøvefortynningsoppløsning.
29. Testkit som angitt i krav 28, hvori bufferen for samling eller fortynning omfatter magnesiumacetat.
30. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-29, hvori ADP er sammen med detergent- og/eller surfaktantekstraktant.
31. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-30, hvori ADP, magnesiumionkilden og bioluminescensreagenset er tilveiebragt i tre separate beholdere.
32. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-30, hvori alle midlene er tilveiebragt som et enkelt frysetørket reagens.
33. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 26-32, hvori ADP har en renhet som er større enn 99,999 mol% med hensyn til ATP.
34. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 26-33, som omfatter et bioluminescensreagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn IO"<7>U/ml.
35. Testkit som angitt i krav 33, hvori bioluminescensreagenset omfatter bovint serumalbumin som er blitt kjemisk behandlet for å fjerne dets adenylatkinaseaktivitet.
36. Reagens for anvendelse ved deteksjon og/eller kvantifisering av mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale ved hjelp av en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene l til 25, karakterisert ved at det omfatter ADP med en renhet, med hensyn til ATP, som er større enn 99,999 %.
37. Reagens som angitt i krav 36, som ytterligere omfatter et chelaterende middel i tilstrekkelig mengde til å forhindre at kontaminerende adenylatkinase omdanner ADP til ATP.
38. Reagens som angitt i krav 37, hvori det chelaterende middel omfatter EDTA.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/GB1994/001513 WO1996002665A1 (en) | 1994-07-13 | 1994-07-13 | Microbiological test method and reagents |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO970105D0 NO970105D0 (no) | 1997-01-10 |
NO970105L NO970105L (no) | 1997-03-13 |
NO318646B1 true NO318646B1 (no) | 2005-04-25 |
Family
ID=10749377
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19970105A NO318646B1 (no) | 1994-07-13 | 1997-01-10 | Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0788553B1 (no) |
JP (1) | JP3856467B2 (no) |
AT (1) | ATE215608T1 (no) |
AU (1) | AU698916B2 (no) |
BR (1) | BR9408598A (no) |
CA (1) | CA2194457C (no) |
DE (1) | DE69430327T2 (no) |
DK (1) | DK0788553T3 (no) |
ES (1) | ES2171457T3 (no) |
GB (1) | GB2303919B (no) |
HU (1) | HU220855B1 (no) |
NO (1) | NO318646B1 (no) |
NZ (1) | NZ268405A (no) |
WO (1) | WO1996002665A1 (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9308411D0 (en) * | 1993-04-23 | 1993-06-09 | Celsis Ltd | Detection of biological material |
US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
GB2348702B (en) | 1998-01-21 | 2003-04-02 | Secr Defence | Antibiotic sensitivity testing |
GB9803156D0 (en) * | 1998-02-13 | 1998-04-08 | Celsis Int Plc | Assay |
GB9823468D0 (en) | 1998-10-28 | 1998-12-23 | Secr Defence | Novel enzyme |
GB9911095D0 (en) | 1999-05-13 | 1999-07-14 | Secr Defence | Microbiological test method and reagents |
GB9925161D0 (en) | 1999-10-26 | 1999-12-22 | Secr Defence | Novel enzyme |
GB0111275D0 (en) | 2001-05-09 | 2001-06-27 | Secr Defence | Analytical method and kit |
GB0122790D0 (en) | 2001-09-21 | 2001-11-14 | Secr Defence | Method of determining the presence of target bacteria |
GB0202421D0 (en) * | 2002-02-01 | 2002-03-20 | Celsis Internat Plc | Polyols in bioluminescence assays |
GB0508981D0 (en) | 2005-05-03 | 2005-06-08 | Acolyte Biomedica Ltd | Distinguishing cells in a sample |
GB0517005D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Analytical method and kit |
GB0915664D0 (en) | 2009-09-08 | 2009-10-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Reaction method |
MY161567A (en) | 2010-04-16 | 2017-04-28 | Zeus Scientific Inc | Methods for measuring enzyme activity useful in determining cell viability in non-purified samples |
US9284500B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-15 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Production of base oils from petrolatum |
JP6811173B2 (ja) | 2014-09-11 | 2021-01-13 | プロメガ コーポレイションPromega Corporation | 増強された発光を産生するために赤外発光基質を活用するルシフェラーゼ配列 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3933592A (en) * | 1965-02-17 | 1976-01-20 | Hazleton Laboratories, Incorporated | Method of detecting living microorganisms |
DE3047860A1 (de) * | 1980-12-18 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von hla-antigenen |
CH678065A5 (en) * | 1988-04-13 | 1991-07-31 | Hamilton Bonaduz Ag | Quantitative determn. of adenosine-tri:phosphate - by a bio-luminescent reaction capable of determining ATP in somatic and/or microbial cells |
GB9301118D0 (en) * | 1993-01-21 | 1993-03-10 | Secr Defence | Enzyme linked assays |
-
1994
- 1994-07-13 EP EP94920556A patent/EP0788553B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-13 WO PCT/GB1994/001513 patent/WO1996002665A1/en active IP Right Grant
- 1994-07-13 AT AT94920556T patent/ATE215608T1/de active
- 1994-07-13 DK DK94920556T patent/DK0788553T3/da active
- 1994-07-13 HU HU9700091A patent/HU220855B1/hu unknown
- 1994-07-13 JP JP50477196A patent/JP3856467B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-13 NZ NZ268405A patent/NZ268405A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-07-13 ES ES94920556T patent/ES2171457T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-13 BR BR9408598A patent/BR9408598A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-07-13 DE DE69430327T patent/DE69430327T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-13 AU AU71305/94A patent/AU698916B2/en not_active Expired
- 1994-07-13 GB GB9627142A patent/GB2303919B/en not_active Revoked
- 1994-07-13 CA CA002194457A patent/CA2194457C/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-10 NO NO19970105A patent/NO318646B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69430327D1 (de) | 2002-05-08 |
DE69430327T2 (de) | 2002-10-31 |
BR9408598A (pt) | 1997-11-18 |
NZ268405A (en) | 1997-12-19 |
DK0788553T3 (da) | 2002-06-17 |
GB9627142D0 (en) | 1997-02-19 |
ATE215608T1 (de) | 2002-04-15 |
NO970105D0 (no) | 1997-01-10 |
AU7130594A (en) | 1996-02-16 |
AU698916B2 (en) | 1998-11-12 |
GB2303919B (en) | 1998-08-26 |
EP0788553B1 (en) | 2002-04-03 |
CA2194457A1 (en) | 1996-02-01 |
WO1996002665A1 (en) | 1996-02-01 |
GB2303919A (en) | 1997-03-05 |
NO970105L (no) | 1997-03-13 |
EP0788553A1 (en) | 1997-08-13 |
ES2171457T3 (es) | 2002-09-16 |
JP3856467B2 (ja) | 2006-12-13 |
HU220855B1 (en) | 2002-06-29 |
CA2194457C (en) | 2009-05-12 |
JPH10502538A (ja) | 1998-03-10 |
HUT76563A (en) | 1997-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5648232A (en) | Microbiological best method and reagents | |
NO318646B1 (no) | Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor | |
Lundin | Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites | |
AU677627B2 (en) | Microbiological test method and reagents | |
EP0774011B1 (en) | Capture assays | |
AU773714B2 (en) | Cell assay, method and reagents | |
JPH07114715B2 (ja) | 有毒物質の生物検定法 | |
Bostick et al. | Methodologies for the determination of adenosine phosphates | |
CN110684822A (zh) | 一种基于丙酮酸激酶检测样品中微生物的方法及试剂盒 | |
Rakotonirainy et al. | Development of a new procedure based on the energy charge measurement using ATP bioluminescence assay for the detection of living mould from graphic documents | |
Girotti et al. | Applications of bioluminescence in analytical chemistry | |
Katsev | Utilities of luminous bacteria from the Black Sea | |
GB2132633A (en) | Enhancement of the sensitivity of viable microbial cell count by bioluminescent assay of ATP and its use for identification of microbes by means of a short incubation in nutrient media | |
NO315276B1 (no) | Mikrobiologisk fremgangsmåte, apparat for anvendelse derav samt testkit ogADP reagens | |
LAZAROVA et al. | REVIEW PAPER BIOFILM CHARACTERIZATION AND ACTIVITY ANALYSIS IN WATER AND WASTEWATER TREATMENT | |
Girotti et al. | 1. AN INTRODUCTION TO BIOLUMINESCENCE 247 2. ANALYTICAL APPLICATIONS OF THE MAIN BIOLUMINESCENT SYSTEMS 251 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |