NO318646B1

NO318646B1 - Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor

Info

Publication number: NO318646B1
Application number: NO19970105A
Authority: NO
Inventors: David James Squirrell
Original assignee: Secr Defence Brit
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2005-04-25
Also published as: GB2303919A; DE69430327T2; DE69430327D1; JP3856467B2; GB9627142D0; EP0788553B1; DK0788553T3; NZ268405A; AU7130594A; CA2194457C; EP0788553A1; HU220855B1; HUT76563A; CA2194457A1; WO1996002665A1; NO970105D0; NO970105L; ES2171457T3; AU698916B2; GB2303919B

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikrorganismer og/eller deres intracellulære materiale tilstede i en prøve, reagens for anvendelse i slik fremgangsmåte og testkit som omfatter essensielle reagenser for å gjennomføre fremgangsmåten.

Alle levende organismer anvender adenosintrifosfat (ATP) som en kilde for kjemisk energi og det er kjent å analysere denne ved anvendelse av den ATP-drevne luciferase/luciferin-reaksjonen. Lys dannet ved denne enzymatiske reaksjon kan måles ved anvendelse av et luminometer og relateres til mengden tilstedeværende ATP. Anvendbarheten av ATP som en indeks på mikrobetall har vært kjent siden midten av 1960-årene (se ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology

(1989), Stanley et al.: Blackwell Scientific Publications, London, se sider 1-10), og den viktigste fordel dermed er hastighet og sensitivitet. Anvendelse av dette analyseformat bevirker at enkle prøver kan analyseres i løpet av minutter mens komplekse prøver rutinemessig kun tar en halv time med en deteksjonsevne helt ned til IO"<12> mol/l ATP. Der er imidlertid et behov for metoder som tilveiebringer ytterligere sensitivitet i forbindelse med å detektere mikroorganismer eller deres innhold idet man bibeholder hastighet og enkelhet med hensyn til utførelse.

Man har nå funnet at hastighet og sensitivitet til den ATP-baserte metode kan økes signifikant ved å flytte målet for analysen fra ATP til et enzym som danner dette, særlig adenylatkinase. Adenylatkinase er et enzym som anvendes av alle organismer for omdannelse av adenosindifosfat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP). Targetiseringen av dette enzym fremfor ATP, ved anvendelse av den foretrukne fremgangsmåte, reagenser og kit i henhold til oppfinnelsen, tillater deteksjon helt ned til minst IO"<20> mol intracellulær markør adenylatkinase.

Det er kjent å analysere adenylatkinase ved anvendelse av luciferase/luciferinsystemet (se Brolin et al., Journal of

Biochemical and Biophysical Methods l (1979), 163-169, og Shutenko et al., Bioteknologiya, nr. 4 (1988), 542-547) for det formål å bestemme dens aktivitet og dette er blitt anvendt for å studere bestemte pattedyr- og plantevev (f.eks. se Rodionova et al., Fiziologiya Rastenii (1978) 25, 4, side 731-734) . Anvendelsen av et slikt analysesystem for deteksjon og analyse av mikroorganismer er imidlertid ikke blitt foreslått og fordelene med å gjøre dette, dvs økt sensitivitet som således tilveiebringes, har ikke vært relevant for dem som studerer selve enzymet.

Skjønt adenylatkinase er tilstede i mindre mengder enn ADP eller ATP, tilveiebringer anvendelsen derav som en biologisk markør for mikroorganismer økt sensitivitet med en typisk tilgjengelig amplifikasjon på 400.000 ved å måle tilstedeværelsen derav gjennom det ATP som den produserer, dvs at for hvert mol enzym tilstede blir 400.000 mol ADP omdannet til ATP i løpet av ti minutters inkubasjon. Således vil estimering av enzymet ved å måle substratet eller produktet av reaksjonen som det katalyserer tillate deteksjon helt ned til IO"<20> mol.

Søkerens samtidige PCT-søknad WO94/17202 vedrører den gene-relle metode for estimering av mikroorganismer i en prøve ut fra prøvens evne til å omdanne ADP til ATP, og hvor man relaterer dette til tilstedeværelsen av mikroorganismer eller deres intracellulære materialer. Søknaden eksemplifiserer metoden hvor magnesiumioner, som er nødvendige for reaksjonen av to molekyler ADP med hvert adenylatkinase aktivt sete, ikke tilsettes som et reagens men tilveiebringes ved tilstedeværende bakterieceller og som en forurensning i de andre reagenser. Antallet celler som detekteres i eksemplene ved anvendelse av en slik teknikk viste seg å være omtrent 10<2>, idet resultater av en mere statistisk valid natur oppnås ved IO<3> eller mer, idet en lineær sammenheng mellom luminometritellinger og celletall således kan oppnås.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret teknikk hvor adenylatkinaseaktivitet måles på en optimalisert måte ved anvendelse av reaksjonsbetingelser hvor magnesiumioner tilføres ADP-omdannelsesreaksjonen, og hvor de reagenser som anvendes er behandlet for å bringe adenylatkinase til høyere grader av renhet hvorved antallet av mikroorganismer som kan detekteres er i størrelsesorden titalls istedet for hundre-talls pr. 200 fil prøve, og avlesninger med lineær sammenheng mellom celler og ATP-avledet lys er mulig helt ned til ti celler.

De ovennevnte fordeler kan oppnås med fremgangsmåten, testkitet samt reagenset ifølge den foreliggende oppfinnelsen slik de er definert med de i kravene anførte trekk.

I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikroorganismer og/eller deres intracellulære material tilstede i en prøve, som er kjennetegnet ved at mengden adenylatkinase i prøven estimeres ved å blande den med adenosindifosfat (ADP) og en kilde av magnesiumioner, tilsatt som et reagens, bestemme mengden av adenosintrifosfat (ATP) som dannes i prøven fra dette ADP, og relatere mengden av ATP som således er dannet til tilstedeværelsen og/eller mengden av adenylatkinase og til mikroorganismer og/eller deres intracellulære material. Magnesiumioner er passende tilsatt i en molar konsentrasjon som er tilstrekkelig til å tillate maksimal omdannelse av ADP til ATP. Mengden av magnesium som er tilsatt er foretrukket slik at der er tilstrekkelig til å gi ett mol magnesium for ett mol ADP slik at alle ADP-molekylene kan være forbundet med minst ett magnesiumion.

I foretrukne utførelsesformer av dette aspekt av oppfinnelsen er prøven tilveiebragt i form av en vandig suspensjon eller oppløsning og estimeringen av adenylatkinase, og således mikroorganismer og/eller intracellulært material i prøven, gjennomføres ved å tilsette ADP og magnesiumioner til prøven under betingelser hvorved enhver adenylatkinase tilstede vil omdanne ADP til ATP, inkubasjon av prøven i en forhåndsbestemt periode for å bevirke slik omdannelse, tilsette luciferase- og luciferinmidler, bestemme mengden lys som emitteres fra prøven og relatere denne til tilstedeværelse og mengde adenylatkinase.

Mengden ADP hvormed prøven blandes er foretrukket tilstrekkelig til å gi en ADP-konsentrasjon i blandingen ut over 0,005 mM, mere foretrukket ut over 0,01 mM og mest foretrukket ut over 0,08 mM. En særlig foretrukket mengde ADP i blandingen er omtrent 0,01 mM.

Der det anvendes reagenser som inneholder magnesiumion-uttømmende midler, f.eks. chelaterende/sekvestrerende midler slik som EDTA og fosfatbuffere, vil det, for å forsyne ADP med tilstrekkelig magnesiumioner for at det skal gjennomgå optimal omdannelse, være foretrukket at et overskudd av magnesiumioner er tilstede. For de foretrukne konsentrasjoner av ADP som er angitt i det foregående, er den foretrukne konsentrasjon av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen under omdannelsen av ADP til ATP 1 mM eller mere, ytterligere foretrukket 5 mM eller mere, og mest foretrukket 10 mM eller mere. Magnesiumionene kan tilveiebringes i form av et hvilket som helst magnesiumsalt, foretrukket som magnesiumacetat.

En ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilsetter luciferin/luciferaseluminometri-reagenser til prøven ved begynnelsen av inkubasjonen, foretrukket som et enkelt reagens med ADP og magnesiumionkilden. Luciferase lagres foretrukket separat fra ekstraktant.

I utførelsesformer av oppfinnelsen hvor alle reagensene er inkludert ved starten av omdannelsen av ADP til ATP på denne måte, og/eller hvor luminometertelling fortsettes etter luciferin/luciferasetilsetning hvor dette er et separat trinn, kan magnesium tilveiebringes ved luciferin/luciferase-reagenset. På grunn av bindingen av magnesiumioner ved EDTA og fosfat er det imidlertid nødvendig at mengden magnesiumioner sikres positivt ved forutgående forsøk eller beregning. Fagkyndige vil innse at den optimale mengde magnesiumsalt som skal tilsettes til et gitt ADP, prøve og luciferin/lucifer-aseblanding lett vil kunne bestemmes med rutineforsøk ved anvendelse av en prøve som inneholder en kjent mengde bakterier, f.eks. E. coli hvorved maksimale signaler oppnås. Fig. 3 gir en indikasjon på den optimale mengde magnesiumacetat som tilsettes til en blanding anvendt i eksemplene i det etterfølgende.

Idet Mg<2+->ioner forenkler ADP-deplesjon som skyldes kontaminerende adenylatkinase, er det foretrukket at de ikke holdes sammen i oppløsning før anvendelse, idet chelaterende middel som EDTA kan inkluderes i ADP for å forhindre dette. Magnesium og ADP bringes foretrukket sammen like før bruk eller i ADP-omdannelsestrinnet. Der hvor reagensene holdes sammen er det foretrukket at de holdes i frysetørket form for å unngå enhver for tidlig ADP-omdannelse til ATP.

Som angitt i det foregående, skjønt andre analyser kan anvendes, detekteres ATP foretrukket ved anvendelse av luciferin/luciferasesystemet som tilveiebringer et foto-metrisk detekterbart signal som er en indikasjon på mengden ATP i prøven. Luciferin/luciferasepreparater og metoder for deres anvendelse i analyse av ATP vil være kjent for fagkyndige på området og er kommersielt tilgjengelige (f.eks. se Brolin et al.). En typisk blanding inneholder f.eks. 0,1 til 10 mg/l lucif erase, 15 til 1000 fimol/ 1 D-luciferin og midler som MgCl2 (2,5 - 25 mmol), EDTA, BSA og pH 7 buffer (se f.eks. EP 054676).

For enkeltreagensbruk med adenylatkinasetestmetoder som beskrevet heri er det foretrukket at pH justeres til den verdi som er optimal for begge enzymer, dvs et kompromiss, slik at telling vil kunne fortsette mens ADP omdannes til ATP. Dette kan bestemmes ved rutineforsøk ved anvendelse av et kjent bakterietall i en prøve.

Prøven, ADP og magnesiumionkilden kan blandes i enhver buffer som tilveiebringer en pH som er egnet for adenylatkinasereak-sjonen, idet ingen andre reagenser er nødvendige. Således vil enhver buffer som tilveiebringer en pH mellom 5,5 og 8,5 kunne anvendes, idet den optimale pH ligger mellom pH 6 og 7, foretrukket pH 6,5. Eksempler på passende buffere inkluderer Tris og fosfatbuffere. Mest passende samles prøven og/eller fortynnes i en slik buffer med henblikk på gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Som med enhver amplifisert analyse, er sensitiviteten av adenylatkinaseanalysen i henhold til oppfinnelsen begrenset ved renheten til reagensene. I dette tilfellet er de signi-fikante kontaminanter ATP i ADP-substratet og adenylatkinase i luciferasepreparatet. For anvendelse som en sensitiv analyse for mikroorganismer, særlig hvor disse eventuelt kan være skadelige og hvor det er nødvendig å detektere dem i et lavt antall, er det nødvendig at renheten til hvert av reagensene er så høy som mulig når det gjelder substansen hvormed det skal reagere i analysen.

Idet man ser på det første problemet, blir kommersiell ADP med høy renhet (>99,5 % renhet) foretrukket anvendt etter rensning ved kolonnekromatografi. Dette er ønskelig fordi selv små mengder kontaminerende ATP kan være tilstrekkelig til å gi en høy bakgrunnsavlesning. Ved anvendelse av en dietylaminoetylcellulosekolonne og 0,02 mM saltsyreeluerings-middel, vil f.eks. ATP eluere saktere fra kolonnen enn ADP i en slik grad at det muliggjør substansiell separasjon. Andre kromatografimedier og elueringsmiddelkombinasjoner kan også anvendes til å gi en lignende effekt, f.eks. HPLC ved anvendelse av Nucleosil (registrert varemerke-RTM) kolonne-pakkingsmaterial (tilgjengelig fra Technicol, Stockport, Cheshire, UK), som Nucleosil 3 (RTM) og Nucleosil 5 (RTM), ved anvendelse av 0,06 M KH2P04:metanol i et 77:33 forhold v/v ved pH 6 med 5 mM tetrabutylammoniumhydrogensulfat. Fraksjoner med høye ADP til ATP-forhold beholdes for anvendelse og renhet bestemmes ved luciferin/luciferase-reagensmeditert bioluminescens etter adenylatkinasevirkning for å måle ADP-nivåer og uten adenylatkinase for å måle ATP-kontaminerende nivåer.

Ved anvendelse av en foretrukket Econopaq Q (RTM) sterk anionbyttergelpatron (Biorad-RTM) ekvilibrert med 20 mM kaliumfosfat ved pH 4,6 og eluering med KP^konsentrasjons-trinn opp til 400 mM, ble ADP funnet til å være sterkt retinert og eluerte som en koherent topp, hvor ATP eluerte deretter. På denne måte var ADP med en mol% ATP øvre grense på 2 x 10<*8> oppnåelig. Det reneste ADP som søkerne kjenner til fra litteraturen er 0,001 % (se Shutenko et al., nevnt i det foregående) og det tilveiebringes således ADP for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som har mindre enn 0,001 mol% ATP, mere foretrukket 2 x 10"<8> mol% eller lavere.

En ytterligere metode for å fjerne ATP fra ADP-substratet anvender enzymer som spesifikt nedbryter ATP, som luciferase eller apyrase. Slike enzymer kan også anvendes for å ytterligere rense kromatografisk renset ADP, eller alternativt kan enzymatisk renset ADP behandles ved kolonnekromatografi. Det skal bemerkes at apyrase også er en ADPase, men da noen er mere aktive på ATP og da ADP er tilstede ved mye høyere nivåer, er dette ikke noe signifikant problem.

Med hensyn til det andre problemet, er adenylatkinase, som et essensielt "housekeeping" enzym, tilstede i stort sett alle organismer og er generelt tilstede i luciferasepreparater. Det kan kun være en mindre kontaminant, men siden målet er å måle svært lave adenylatkinasenivåer i prøver, kan dets tilstedeværelse i luciferasen være en begrensende faktor. Søkerne har faktisk bestemt at, ved å definere en enhet (U) aktivitet som den mengde enzym som omdanner 1 //mol ADP til l ( imol ATP pr. minutt i nærvær av 0,5 mM ADP og 4,5 mM Mg<2+ >ved pH 7,8 og ved 20°C, kan kommersielle luciferaser inneholde IO"<7> U/ml eller mere adenylatkinseaktivitet mens luciferin, dens substrat, omfatter svært liten, om noen, aktivitet. Videre er det vanlig å stabilisere luciferasereagenser med en stabilisator, vanligvis et protein som bovint serumalbumin (BSA), og kommersielle preparater av dette er blitt bestemt av søkerne til å ha signifikant adenylatkinaseaktivitet.

Molekylvektene til luciferase- og adenylatkinase er svært forskjellige, henholdsvis 61 kD og 21 kD. Videre er luciferase et membranbundet protein og derfor relativt hydrofobt, mens adenylatkinase forekommer som et oppløselig enzym. Det er således mulig å fjerne adenylatkinase fra luciferasepreparater ved f.eks. størrelsesekskluderings-kromatografi, revers fasekromatografi eller begge. Alternativt eller i tillegg til dette kan problemet med adenylat-kinasekontaminering av luciferase unngås ved å tilsette de bioluminescerende reagenser (luciferase og luciferin) like før eller mens målinger utføres slik at enhver kontaminerende adenylatkinase ikke har tid til å gi en signifikant effekt.

Passende metoder for å rense luciferase anvender kolonnekromatografifraksjonering med en lavporøsitetsgel, f.eks. Sephadex G-25 (RTM) (se Nielsen og Rasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22 (1968), side 1757-1762), anvendelse av Sephadex (RTM) og Sepharose (RTM) kolonner (f.eks. Blue Sepharose) i serier og/eller SDS elektroforese (se Devine et al., Biochimica et Biophysica Acta 1172 (1993), side 121-132) eller aldring i en periode ved økt omgivelsestemperatur.

For å fjerne adenylatkinaseaktivitet fra midler som bovint serumalbumin er det likeledes mulig å anvende kolonnekroma-tograf i. En ytterligere behandling som har vist seg å være vellykket i denne forbindelse er kjemisk behandling av BSA slik at dets evne til å stabilisere luciferase bibeholdes, men hvor adenylatkinaseaktivitet reduseres eller fjernes helt. Enhver konvensjonell kjemisk behandling for deplesjonen av enzymatisk aktivitet fra proteiner kan likeledes anvendes for dette formål. Alternativt kan en ikke-protein luciferasestabilisator, f.eks. glyserol, anvendes som et supplement eller som en erstatning for BSA.

Søkerne har f.eks. funnet at kommersielt tilgjengelig BSA kan ha sin adenylatkinaseaktivitet redusert til under 2 % av den opprinnelige aktivitet eller mindre ved kun varmebehandling ved sur eller alkalisk pH. En passende effektiv behandling oppvarmer BSA ved pH 5,6 eller pH 10 ved 50°C i 24 timer. En ytterligere kilde av adenylatkinase-fri BSA er det kjemisk behandlede reagens acetylert-BSA, tilgjengelig fra Sigma og BDH. Fagkyndige på området vil vite at andre kjemisk behandlede BSAer også kan være egnet.

For å gjøre all adenylatkinasen assosiert med en targetmikro-organisme tilgjengelig for ADP, mangesiumionene og luciferase/luciferin analysereagensene i henhold til oppfinnelsen, vil det være nødvendig å nedbryte dem slik at intracellulært material frigis eller på annen måte eksponeres for reagensene. Slik nedbrytning vil kunne gjennomføres ved anvendelse av mekaniske midler som en ultralydgenerator, ved anvendelse av osmotisk sjokk eventuelt sammen med kuldesjokk eller slike midler som lysozym eller, mere passende, ved anvendelse av detergenter. Slike detergenter er kommersielt tilgjengelige og omtales vanligvis som "ekstraktanter". Typiske ekstraktanter inkluderer generiske kationiske detergenter som CTAB (cetyltrimetylammioniumbromid), og merkebeskyttede midler som Biotrace XM (RTM) ekstraktant (tilgjengelig fra Biotrace, Bridgend, UK), Celcis UK kationiske ekstraktanter og Lumac NRM (RTM) (nukleotid-frigivende middel tilgjengelig fra Lumac BV, Holland). Ved anvendelse av CTAB vil et passende preparat omfatte fra 0,01 til 1 % CTAB i vann, f.eks. 0,2 %, men andre konsentrasjoner vil klart fremgå for den fagkyndige på området.

Før tilsetning av ADP og luciferase/luciferinreagenset eller reagensene til en analyseprøve som antas å inneholde mikroorganismer, er det således foretrukket å bryte ned disse for å gjøre deres intracellulære innhold tilgjengelig for lumino-metrireagenser ved anvendelse av et middel for slik nedbrytning. Dersom det er ønskelig å skjelne mellom targetceller og celler slik som dem av soppsporer, er det mulig å utføre to separate analyser hvorav en behandles med en ikke-ionisk target som kun kan nedbryte disse sporer og multicellulære "somatiske" animalske celler (f.eks. Triton TX-100-RTM), og hvor den andre utføres med kationiske detergent "ekstraktanter" som er angitt detaljert i det foregående for å nedbryte alle celler. Det er mulig å gjennomføre disse analyser på den samme prøve dersom en ATPase som apyrase tilsettes mellom detergent/luciferase/målesyklusene, idet en syklus anvender ikke-ionisk og den andre kationisk detergent i et første syklustrinn med filtreringstrinn derimellom.

Effekten av ekstraktant på luciferase/luciferinsystemet er kjent til å være av viktighet {se f.eks. Simpson et al.

(1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2), side 97-106), idet kationiske detergenter er kjent for å potensere reaksjonen men gi gradvis inaktivering av luciferase, anionisk detergent er kjent for å inhibere reaksjonen, og ikke-ioniske og zwitterioniske detergenter er kjent for å potensere over et stort område. En blanding av 0,15 % kationisk detergent sammen med 0,2 5 % tertiært diaminsurfaktant (oppnådd fra Celcis, Cambridge, UK) ble funnet til å være tilfreds-stillende for de foreliggende formål, men de fagkyndige på området vil ikke ha noen problemer med å screene for andre "ekstraktanter" som gir en optimal blanding av adenylatkinase- og luciferaseaktivitet når de er tilstede samtidig i den samme oppløsning.

Lyset som avgis fra blandingen etter alle de essensielle trinn er komplett, dvs ADP-omdannelse til ATP og påfølgende virkning av luciferase på luciferin kan måles ved residens av prøvevolumet, f.eks. luminometerrør, i en lysdetektor umiddelbart etter eller samtidig med tilsetning av luciferase og luciferin eller andre midler som muliggjør en fortsettelse av de essensielle trinn.

I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et testkit som omfatter de essensielle reagenser som er nødvendige for fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, dvs adenosindifosfat, og en kilde for magnesiumioner sammen med en ekstraktant. Kitet inneholder foretrukket luciferase og luciferin. Kitet inkluderer foretrukket alle disse reagenser, med luciferase og luciferin tilveiebragt som en enkel reagensløsning, med et detergentreagens i kitet som er egnet for å nedbryte targetcellene for hvilke analysen er tilsiktet. Ved analyse av mikroorganismer er vanligvis kun kationisk detergent nødvendig, mens, dersom det er soppsporer og somatiske celler som sannsynligvis er viktige, da kan et ytterligere ikke-ionisk detergentreagens inkluderes for å bestemme deres antall. Kitet er i form av en enkel pakning som foretrukket inneholder instruksjoner vedrørende hvordan man utfører fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, idet reagensene tilveiebringes i beholdere og med en styrke som er egnet for direkte anvendelse eller anvendelse etter fortynning.

Det kan være passende å tilveiebringe magnesiumionene sammen med luciferase/luciferinreagenset dersom tilsetningen derav er før ADP til ATP-omdannelsen har startet, men de bør da være i overskudd i forhold til det som er bundet til EDTA eller fosfat i dette reagenset, og bør være optimalisert til å akkommodere både adenylatkinase- og luciferasekrav. For mikrobiell deteksjon er magnesiumioner foretrukket tilveiebragt med en prøvesamlings/fortynningsbuffer, men andre formater kan være foretrukket for spesielle anvendelser.

Mest passende er magnesiumionene tilveiebragt sammen med en prøvesamlings- eller fortynningsbuffer, ADP er tilveiebragt med detergent/surfaktantekstraktanter og eventuelt med en stabilisator som EDTA, og luciferase og luciferin er tilveiebragt sammen, idet man således får et tre-reagens testkit. Alternativt kan disse midler være tilveiebragt i form av et enkelt reagens som er frysetørket slik at de ikke interagerer til å gi nedbrytning av f.eks. ADP før anvendelse.

Et foretrukket testkit i henhold til oppfinnelsen inneholder ADP-reagens som har en renhet som er større enn 99,999 %, og et luciferase/luciferinreagens, inkluderende BSA, som hoved-sakelig ikke omfatter adenylatkinaseaktivitet. Alternativt er luciferase/luciferinforholdet som anvendes, som reflektert i kitinstruksjonene for bruk og/eller i deres relative konsentrasjoner, slik at luciferasen kan virke på luciferinsub-stratet tilstrekkelig hurtig slik at enhver luciferase-assosiert adenylatkinase produserer ATP etter at den initiale emisjon er avsluttet. Således vil mikroorganismeavledet adenylatkinase være indikert ved en flash-kinetisk reaksjon og kontaminerende ATP ved en gløding.

De foretrukne rensede reagenser kan tilveiebringes ved metoder som er beskrevet i det foregående. Det skal bemerkes at adenylatkinaseaktivitet i luciferase også kan fjernes ved å etterlate luciferasen for henstand i en periode på måneder eller år.

Oppfinnelsen skal nå illustreres nærmere ved hjelp av de etterfølgende eksempler og figurer.

Figurer:

Fig. 1 plotter log luminometersignal mot log antall E. coli i en 2 00 ^1 prøve ved anvendelse av den forbedrede analysemetode i henhold til oppfinnelsen ved anvendelse av en og fem minutters inkubasjoner før tilsetning av luciferin/luciferase. Fig. 2 plotter log luminometersignal mot log antall celler av

E. coli i fravær av magnesium.

Fig.3 viser effekten av magnesiumionkonsentrasjon på

luminometersignalet avledet fra et bestemt antall P. aeruginosa ved pH 7,5 og pH 8,0 som viser den ti ganger økning i forhold til tilfellet uten tilsatt magnesium.

Eksempel 1: Fremstilling av renset adenosindifosfatreagens Væskekromatografi ble anvendt for å ytterligere rense kommersiell ADP med høy renhet (>99,95 %) (Sigma) ved anvendelse av en 5 ml Econopac Q patron (RTM) (Biorad-RTM) ekvilibrert med 2 0 mM kaliumfosfat pH 4,6 og lastet med 5 ml l mM ADP

(2,1 mg) . Eluering ble utført ved KP^konsentrasjonstrinn opp til 400 mM hvorved ADP var sterkt tilbakeholdt og eluerte som en topp ved omtrent 34 0 mM KP±. Systemet ble oppstilt med en pumpe (5 ml/min) og en gradientblander, en gradient på fra 5 0 til 1 M KPi i totalt 2 00 ml ble frembragt og 5 ml

fraksjoner ble samlet. ADP eluerte som en skarp topp mellom fraksjoner 12 og 17 idet ATP begynte å vise seg på slutten av gradienten. Et trinn i [KP^ til l M eluerte det gjenværende

ATP. De reneste ADP-fraksjoner fra denne kolonne hadde mindre enn 2 x IO"<8> mol% ATP.

Eksempel 2: Fremstilling av adenylatkinase-frie

luciferasereagenser

Adenylatkinaseaktivitet ble fjernet fra kommersielt tilgjengelige luciferin/luciferasereagenser {Biotrace HM-RTM) ved aldring, inkluderende flere måneder ved høy omgivelsestemperatur (omtrent 30°C) over en periode på tolv måneder i tørr tilstand.

Eksempel 3: Alternativ fremstilling av kinase-frie

luciferasereagenser

Kommersielt tilgjengelig luciferase renses ved anvendelse av kolonnekromatografi ved hjelp av metoden etter Devine et al.

(1993) ved anvendelse av Blue Sepharose (RTM) som omtalt i det foregående.

Eksempel 4: Fremstilling av adenylatkinase-fri BSA

Sigma Fraction V (RIA Grade, Cat. No. A-7888) BSA ble tilberedt ved 1 % vekt/volum i 200 ml sterilt vann til å gi en utgangs pH lik 5,6. To 50 ml prøver av dette ble innført i 100 ml Duran-flasker, resten ble bragt til pH 10 ved anvendelse av 5 M NaOH og 50 ml ble innført i hver av to Duran-flasker. Thimerosal ble tilsatt til en 0,02 % slutt-konsentrasjon som et konserveringsmiddel for å forhindre mikrovekst og flaskene ble inkubert ved 3 7°C eller 50°C i 24 timer før pH i hver ble justert på ny til 7.6 med 5 M HC1 eller 5 M NaOH som passende. Adenylatkinaseaktivitet ble målt ved å blande 100 ( il BSA-prøve som fremstilt i det foregående med 100 /il 3 0 mM magnesiumacetatoppløsning, den oppnådde blanding ble anbragt i et 3,5 ml luminometerrør i et luminometer, og 100 ( il ADP-oppløsning fremstilt som i eksempel l og 100 ( il lucif erin/lucif erasereagens (Celcis, Cambridge, UK) som var fremstilt uten adenylatkinaseaktivitet ved anvendelse av kolonnekromatografi og kjemisk behandlet BSA ble tilsatt. Etter en fem sekunders ventetid ble lysemisjon integrert i løpet av ti sekunder målt og registrert på en datamaskin og totalt ti fortløpende tisekunders avlesninger ble utført for å bestemme ATP-produksjonsraten, idet analysene ble utført in duplo. Kalibrering ble utført ved anvendelse av fire gjentatte målinger av lys emittert fra 5 fil 10 ng/ml {91 femtomol) ATP i vann: gjennomsnittlig signal 2 950 per femtomol.

Resultater: BSA-prøven inkubert ved 37°C forble klar mens dem ved 50°C dannet et presipitat som var betydelig ved pH 10 og svært omfattende ved pH 5,6. Ved pH 10 og 50°C var der en lett misfarging. Adenylatkinaseaktivitet tilbake i disse prøver er vist i den etterfølgende tabell 1, som representert ved luminometertellinger pr. minutt.

Det anbefales at enda mildere inaktiveringsformer anvendes, med lengre varighet, eller at BSA umiddelbart frysetørkes, dersom det skal lagres i noe lengre tid, da selv prøven med pH 10, 50°C, ble ubrukelig etter to uker på grunn av økt misfarging. 3 7°C prøvene tapte seg ikke på denne måte og betyr derfor en bedre mulighet for å redusere stabil adenylatkinase-fri BSA ved å øke inkubasjonstiden. Det faktum at Biotrace HM (RTM) middelet tapte sin aktivitet i tørr form etter lagring ved 40°C viser mulighetene her.

Eksempel 5: Fremstilling av luciferin/luciferasereagens med

BSA

Kommersielle preparater av luciferin/luciferase inneholder vanligvis BSA som en nødvendighet. BSA som er kjemisk behandlet som angitt i eksempel 4 i det foregående eller som er kommersielt tilgjengelig som acetylert BSA {f.eks. BDH eller Sigma) ble blandet med adenylatkinase-fri luciferase i normale mengdeandeler sammen med andre standard Celcis-midler til å gi et Celcis LDR luciferin/luciferase luminescens-reagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn 10"<9>U prøve-volum {dvs 3 00 fil) .

Eksempel 6: Testkit i henhold til oppfinnelsen

Et testkit i henhold til oppfinnelsen er tilveiebragt som utgjøres av følgende: (i) en beholder som inneholder 15 mM magnesium-acetatoppløsning for samling/fortynning av prøver, (ii) en beholder med renset ADP-oppløsning (>99,99999998 % ren med hensyn til ATP) fremstilt som beskrevet i eksempel 1 i en konsentrasjon på 0,3 mM i kaliumfosfat (7,5 mM pH 6,5) bufferoppløsning som ytterligere omfatter 0,2 mM EDTA og en blandet ekstraktant av 0,15 %

kationisk detergent og 0,25 % tertiær diaminsurfaktant, (iii) en beholder som inneholder luciferin/luciferase LDR (Celcis, Cambridge, UK) bioluminescensreagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn 10"<8>U/100 fil.

I pakningen er det eventuelt inkludert en beholder med ikke-ionisk detergentoppløsning (Triton X-100 (RTM), 0,2 % eller ekvivalent) og/eller en beholder som inneholder en ATPase som apyrase for nedbrytning av ATP frigitt ved virkningen av den ikke-ioniske detergent på en prøve som gjør den egnet for re-analyse ved tilsetning av den kationiske detergent.

Eksempel 7: Analyse av kjente mengder E. coli ved anvendelse

av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen

En en uke gammel E. coli kultur som inneholder omtrent

2,2 x IO<7> mikroorganismer pr. 200 fil fosfatbufret saltløsning med pH 7,4 ble anvendt som stamløsning og fortynnet i ti på-

følgende fortynninger med samlings/fortynningsreagenset inneholdende magnesiumioner ((i) i eksempel 6) til å gi prøver som strekker seg fra IO<7> til 0,1 mikroorganismer pr.

2 00 fil prøve.

Hver 200 fil prøve ble tilsatt til et 3,5 ml luminometerrør. 100 fil ADP/ekstraktantreagens ((ii) i eksempel 6) ble tilsatt og blandingen, totalt volum på 300 fil, ble inkubert ved rom-temperatur i ett eller fem minutter. Etter endt inkubasjon ble 10 0 fil modifisert Celcis LDR bioluminescensreagens, ( (iii) i ovennevnte eksempel 6), tilsatt og lyset som emitterte ble bestemt over et første ti sekunders intervall og deretter over ti sekunders intervaller i opp til ett minutt for å bestemme økningen i lys, på en kumulativ måte, ved anvendelse av et Biotrace M3 (RTM) luminometer. Den innledende signalverdi ble subtrahert fra den endelige avlesning for å oppnå et mål på signalet i tellinger pr. minutt.

Effektiviteten av den foreliggende fremgangsmåte vil fremgå under henvisning til fig. 1 hvor statistisk valid lineær respons mellom antall E. coli og lys emittert med prøve-blandingen etter fem minutters inkubasjon med ADP oppnås for ti organismer pr. prøve og mere, for 100 organismer og mere med en ett minutts inkubasjon, og en deteksjonsgrense på omtrent ti organismer er gitt i begge tilfeller. Dette faller svært gunstig ut ved en sammenligning med metoden ifølge WO94/17202 som gir en forskjell på kun 26 cpm etter en ett minutts inkubasjon med 100 organismer og 67 cpm med 1000, idet lineære responser kun oppnås med 1000 celler og derover. Til sammenligning gir 1000 celler pr. prøve i den foreliggende fremgangsmåte en signaløkning på flere tusen cpm etter ett minutt.

Det skal bemerkes at for å utføre en analyse for et ukjent antall mikroorganismer i en prøve ved anvendelse av den foreliggende fremgangsmåte, kan en kalibreringskurve tilveiebringes ved å plotte kjente antall mikroorganismer mot luminometertellinger som vist i fig. 1 og 2 (f.eks. som log-verdier), utlede et antall tellinger fra en prøve som inneholder det ukjente antall mikroorganismer (inkluderende null organismer) ved anvendelse av den samme prosedyre, og estimere antallet mikroorganismer i prøven til å være det som svarer til det samme antall tellinger på kurven.

Den fagkyndige på området vil se at mengden adenylatkinase tilstede i en spesiell mikroorganisme, f.eks. bakterier, kan variere sammenlignet med andre mikroorganismer. Gjær inneholder f.eks. mer adenylatkinase enn bakterier i kraft av deres størrelse, og enkelt-gjærceller kan faktisk detekteres ved denne metode. For en gitt mikroorganisme kan Båledes en spesiell kalibreringskurve være påkrevd, og det kan være nødvendig å tilveiebringe slike kurver for forskjellige tilstander i den samme mikroorganisme, f.eks. for svekkede, pH- eller oksygenstressede organismer. En ytterligere fordel med den foreliggende fremgangsmåte i forhold til den eksisterende ATP-baserte metodologi er at adenylatkinase-innholdet vil være mye mere i samsvar med celletallet enn det svært variable ATP-innhold som forbrukes ved celle-metabolisme.

Claims

1. Fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikrorganismer og/eller deres intracellulære materiale tilstede i en prøve, karakterisert ved at mengden av adenylatkinase i prøven estimeres ved å blande prøven med adenosindifosfat (ADP) og en kilde av magnesiumioner, tilsatt som et reagens, bestemme mengden av adenosintrifosfat (ATP) dannet i prøven fra dette ADP, og relatere mengden av ATP som således er dannet til tilstedeværelsen/eller mengden mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori magnesiumionene tilsettes i en molar konsentrasjon som er tilstrekkelig til å tillate maksimal omdannelse av ADP til ATP.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, hvori mengden av magnesiumioner som tilsettes er slik at der er tilstrekkelige magnesiumioner tilstede til å gi ett mol magnesium for ett mol ADP, slik at alle ADP-molekylene kan være forbundet med minst ett magnesiumion.

4. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, hvori prøven tilveiebringes i form av en vandig suspensjon eller oppløsning og estimeringen av mikroorganismer og/eller intracellulært materiale deri gjennomføres ved å tilsette ADP og magnesiumioner til prøven under betingelser hvorved eventuelt adenylatkinase tilstede vil omdanne ADP til ATP, prøven inkuberes i en forhåndsbestemt periode for å gjennomføre slik omdannelse, luciferase- og luciferinmidler tilsettes, mengden av lys emittert fra prøven bestemmes og denne relateres til tilstedeværelse og mengde av mikroorganismer og/eller intracellulært materiale.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, hvori mengden ADP hvormed prøven blandes er tilstrekkelig til å gi en ADP-konsentrasjon i blandingen ut over 0,005 mM.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, hvori ADP er mer enn 0,08 mM.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, hvori ADP-konsentrasjonen er omtrent 0,1 mM.

8. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori konsentrasjonen av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen under omdannelse av ADP til ATP er 1 mM eller mere.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, hvori konsentrasjonen av magnesiumioner i suspensjonen eller oppløsningen er 10 mM eller mere.

10. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionene tilveiebringes i form av magnesiumacetat.

11. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori luciferin/luciferaseluminescens-reagensene tilsettes til prøven ved begynnelsen av inkubasjonen som et enkelt reagens med ADP og magnesiumionkilden.

12. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionkiIden og ADP holdes i tørr form eller i separate oppløsninger før anvendelse og bringes sammen eller bringes til en vandig oppløsning umiddelbart før bruk eller i ADP-omdannelsestrinnet.

13 . Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori magnesiumionkilden og prøven blandes sammen før tilsetning av ADP.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, hvori prøven samles eller fortynnes i en oppløsning omfattende magnesiumionkilden.

15. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori omdannelsen av ADP til ATP gjennomføres ved en pH på mellom 5,5 og 8,5.

16. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori ADP har en molar% ATP på mindre enn 0,001 %.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, hvori ADP har en molar % ATP på 2 x IO"<8> eller lavere.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, hvori ADP lagres i nærvær av et chelaterende middel for å forhindre at kontaminerende adenylatkinase omdanner det til ATP for tidlig.

19. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori luciferase/luciferinreagenset har et adenylatkinaseinnhold på mindre enn 10"<7>U/ml.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, hvori luciferase/luciferinreagenset omfatter bovint serumalbumin som er blitt kjemisk behandlet for å fjerne dets adenylatkinaseaktivitet.

21. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori prøven behandles med en ekstraktant som nedbryter mikroorganismeceller og eksponerer deres adenylatkinase for ADP og magnesiumionene.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori cellene er soppsporer eller somatiske celler og ekstraktanten omfatter en ikke-ionisk detergent.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori alle celler skal detekteres og/eller kvantifiseres og ektraktanten omfatter en kationisk detergent.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, hvori ekstraktanten videre omfatter en surfaktant.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvori cellene er bakterieceller hvor ATP frigitt ved ikke-ionisk detergent subtraheres fra ATP frigitt ved kationisk detergent og surfaktant, og hvor resten er relatert til bakteriecelleantall.

26. Testkit for deteksjon og/eller kvantifisering av mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale ved hjelp av en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 -25, karakterisert ved at kitet omfatter ADP og en kilde for magnesiumioner sammen med en ekstraktant for å eksponere mikroorganisme-adenylatkinase for disse slik at omdannelsen av ADP til ATP finner sted.

27. Testkit som angitt i krav 26, som ytterligere omfatter luciferase og luciferin i form av et bioluminiscensreagens i stand til å emittere lys i nærvær av ATP.

28. Testkit som angitt i krav 27, hvori kilden for magnesiumioner er tilveiebragt som en prøvesamlings- eller prøvefortynningsoppløsning.

29. Testkit som angitt i krav 28, hvori bufferen for samling eller fortynning omfatter magnesiumacetat.

30. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-29, hvori ADP er sammen med detergent- og/eller surfaktantekstraktant.

31. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-30, hvori ADP, magnesiumionkilden og bioluminescensreagenset er tilveiebragt i tre separate beholdere.

32. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 27-30, hvori alle midlene er tilveiebragt som et enkelt frysetørket reagens.

33. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 26-32, hvori ADP har en renhet som er større enn 99,999 mol% med hensyn til ATP.

34. Testkit som angitt i ett eller flere av kravene 26-33, som omfatter et bioluminescensreagens med adenylatkinaseaktivitet mindre enn IO"<7>U/ml.

35. Testkit som angitt i krav 33, hvori bioluminescensreagenset omfatter bovint serumalbumin som er blitt kjemisk behandlet for å fjerne dets adenylatkinaseaktivitet.

36. Reagens for anvendelse ved deteksjon og/eller kvantifisering av mikroorganismer og/eller deres intracellulære materiale ved hjelp av en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene l til 25, karakterisert ved at det omfatter ADP med en renhet, med hensyn til ATP, som er større enn 99,999 %.

37. Reagens som angitt i krav 36, som ytterligere omfatter et chelaterende middel i tilstrekkelig mengde til å forhindre at kontaminerende adenylatkinase omdanner ADP til ATP.

38. Reagens som angitt i krav 37, hvori det chelaterende middel omfatter EDTA.