JPH10502538A - 微生物学的試験方法および試薬 - Google Patents
微生物学的試験方法および試薬Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.サンプルに存在する微生物および/またはその細胞内物質の存在および/ま たは量を測定する方法において、そのサンプル中のアデニル酸キナーゼの量を、 サンプルをアデノシン二リン酸(ADP)と混合し、このADPからそのサンプ ルによって産生するアデノシン三リン酸(ATP)の量を測定し、そのようにし て産生したATPの量を微生物および/またはその細胞内物質の存在および/ま たは量と関連づけることにより推定し、ADPのATPへの変換は、ADPのA TPへの最大変換を可能とするのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在 下で行うことを特徴とする方法。 2.存在させるマグネシウムイオンの量を、ADP分子の全部が少なくとも1個 のマグネシウムイオンと結合できるように1モルのADPに対して1モルのマグ ネシウムを供給するのに十分であるようにすることを特徴とする請求項1に記載 の方法。 3.サンプルを水性懸濁物または溶液の形態で供給し、微生物および/またはそ の細胞内物質の推定は、ADPおよびマグネシウムイオンを、存在するアデニル 酸キナーゼによりADPが ATPに変換する条件下でサンプルに添加し、該サンプルを予め定めた時間イン キュベートして該変換を行い、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し 、サンプルから放出される光の量を測定し、それを微生物および/またはその細 胞内物質の存在および量と関連づけることにより行うことを特徴とする請求項1 または2に記載の方法。 4.サンプルと混合するADPの量が、混合物におけるADP濃度を0,005mM以 上とするのに十分であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の 方法。 5.ADPが0.08mM以上であることを特徴とする請求項4に記載の方法。 6.ADPが約0.1mMであることを特徴とする請求項4に記載の方法。 7.ADPがATPへ変換する際の懸濁物または溶液におけるマグネシウムイオ ンの濃度が1mM以上であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載 の方法。 8.懸濁物または溶液におけるマグネシウムイオンの濃度が10mM以上であること を特徴とする請求項7に記載の方法。 9.マグネシウムイオンが酢酸マグネシウムの形状で供給され ることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 10.ルシフェリン/ルシフェラーゼ発光試薬を、ADPおよびマグネシウムイ オン源との単一試薬としてインキュベーション開始時にサンプルに添加すること を特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 11.マグネシウムイオン源およびADPを使用前は乾燥形態または別々の溶液 で保存し、使用直前またはADP変換ステップで一緒にするか、水溶液にするこ とを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 12.マグネシウムイオン源およびサンプルを、ADPを添加する前に混合する ことを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 13.サンプルをマグネシウムイオン源を含む溶液に採集するか該溶液で希釈す ることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14.ADPのATPへの変換を、pH5.5〜8.5で行うことを特徴とする請求項 1〜13のいずれか一項に記載の方法。 15.ADP中のATPモル%が0.001%未満であることを特徴とする請求項1 〜14のいずれか一項に記載の方法。 16.ADP中のATPモル%が2×10-8以下であることを特 徴とする請求項15に記載の方法。 17.ADPが混入するアデニル酸キナーゼにより早まってATPに変換するの を防ぐために、ADPをキレート剤の存在下で保存することを特徴とする請求項 15に記載の方法。 18.ルシフェラーゼ/ルシフェリン試薬中のアデニル酸キナーゼ含量が10-7U/ ml未満であることを特徴とする請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。 19.ルシフェラーゼ/ルシフェリン試薬が、化学的に処理されてそのアデニル 酸キナーゼ活性を消散させたウシ血清アルブミンを含むことを特徴とする請求項 18に記載の方法。 20.サンプルを、微生物細胞を破砕し、そのアデニル酸キナーゼをADPおよ びマグネシウムイオンにさらす抽出剤で処理することを特徴とする請求項1〜1 9のいずれか一項に記載の方法。 21.細胞が菌類胞子または体細胞であり、抽出剤が非イオン洗剤を含むことを 特徴とする請求項20に記載の方法。 22.細胞全部を検出しおよび/または定量するものであり、抽出剤が陽イオン 洗剤を含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。 23.抽出剤がさらに界面活性剤を含むことを特徴とする請求項22に記載の方 法。 24.細胞が細菌細胞であり、非イオン洗剤によって放出されるATPを陽イオ ン洗剤および界面活性剤によって放出されるATPから差し引いた残りが細菌細 胞数に関係することを特徴とする請求項20に記載の方法。 25.ADPおよびマグネシウムイオン源を、ADPのATPへの変換が生じる ように微生物のアデニル酸キナーゼをこれらにさらすための抽出剤とともに含む 、微生物および/または細胞物質を検出および/または定量するためのテストキ ット。 26.さらにルシフェラーゼおよびルシフェリンを、ATPの存在下で光を放出 することができる生物発光試薬の形態で含むことを特徴とする請求項25に記載 のテストキット。 27.マグネシウムイオン源をサンプルの採集または希釈溶液として供給するこ とを特徴とする請求項26に記載のテストキット。 28.採集または希釈緩衝液が酢酸マグネシウムを含むことを特徴とする請求項 27に記載のテストキット。 29.ADPが洗剤および/または界面活性剤抽出剤と一緒に なっていることを特徴とする請求項26〜28のいずれか一項に記載のテストキ ット。 30.ADP、マグネシウムイオンおよび生物発光試薬が3個の別々の容器で供 給されることを特徴とする請求項26〜29のいずれか一項に記載のテストキッ ト。 31.試薬全部を単一の凍結乾燥試薬として供給することを特徴とする請求項2 6〜29のいずれか一項に記載のテストキット。 32.ADPの純度がATPに関して99,999モル%より高いことを特徴とする請 求項25〜31のいずれか一項に記載のテストキット。 33.アデニル酸キナーゼ活性が10-7U/ml未満である生物発光試薬を含むことを 特徴とする請求項25〜32のいずれか一項に記載のテストキット。 34.生物発光試薬が、化学的に処理されてアデニル酸キナーゼ活性を消散させ たウシ血清アルブミンを含むことを特徴とする請求項32に記載のテストキット 。 35.ATPに関する純度が99.999%より高いADPを含む試薬。 36.さらに、混入したアデニル酸キナーゼによるADPのATPへの変換を防 ぐのに十分な量のキレート剤を含むことを特徴とする請求項35に記載の試薬。 37.キレート剤がEDTAを含むことを特徴とする請求項36に記載の試薬。
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