JPH06500921A - ルシフェラーゼ組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ルシフェラーゼ組　び　゛ 改皿圀１ 本発明は全般的には生物発光に係わる。特に本発明は、甲虫ルシフェラーゼ活性 由来の優れた光生成方法及び該方法を実施するための組成物に係わる１本発明は 、所定の生物特異的反応の生産物または発生を定量化するためのリポータ−また はマーカーとしてルシフェラーゼを使用するアッセイ及び試験キットに特によく 適している。

見ユゑｌ１ 分子事象を定性的または定量的にモニターするためにリポータ−分子またはラベ ルを使用することは、医原診断のツ ため、工業環境において毒素及び他の物質を検出するため、並びに、生物学、生 物医学及び生化学における基礎及び応用研究のために使用されるアッセイにおい て十分に確立されている。このようなアッセイとしては、イムノアッセイ、核酸 プローブハイブリダイゼーションアッセイ、リポータ−分子の産生が特定のプロ モーターからの転写に起因するアッセイを挙げることができる。このようなアッ セイ系におけるリポータ−分子またはラベルとしては、放射性同位元素、蛍光物 質、酵素及び化学発光物質を挙げることができる。

問題の事象をモニターまたは測定するために化学発光物質が使用されるアッセイ 系のなかに、生物発光酵素ルシフェラーゼの活性を測定するものがある。しかし ながらルシフェラーゼアッセイの使用は、アッセイにおける発光の短時性及びパ ターンが原因となって、普及していない、甲虫ルシフェラーゼでは、この発光は 極めて急速にピーク強度に達し、即ち閃光が放たれ、次いでよりゆっくりと、し かし尚問題のあるほど急速に減衰してから、ピーク強度の約１０％程度の“定常 状態”に至って更にゆっくりと減衰する。

強い発光は短時間であるので、アッセイを実施する上で生物発光反応混合液を調 製するなめには、通常は酵素を基質溶液に迅速に注入するような特別の苦労を要 する作業を必要とする。“閃光”の間に発せられた光を測定する必要性は、実験 上の問題として残っている。今日のルミノメータ−をもってしてもこのような光 を正確に測定することは依然として困難である。

発光系はよく知られており、ある種の細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、無 想、多足頚、ハエ、菌類、螺出、甲殻類及び甲虫を含む多くの発光生物、特にＰ ｈｏｔｉｎｕｓ、Ｐｈｏｔｕｒｔｓ及びＬｕｃｉｏｌａ＠のホタル並びにＰ　ｒ ｏ　ｈｏｒｕｓ属のコメツキムシから単離されている。多くの上記生物において 、分子を高エネルギー状態に励起するために自由エネルギー交換が使用される酵 素触媒酸化還元が行われている。励起分子が自発的に基底状態に戻るとき、可視 光が発せられる。この発光は“生物発光”と称されている。

甲虫ルシフェラーゼ、特にホタル種Ｐｈｏｔｉｎｕｓｒａｌｉｓ由来のものは、 初期の研究から生物発光を理解するための範例の役目を果たしている。Ｐニー２ に二」２１ｉｓルシフエラーゼは、補欠分子団を持たないがまたは金属イオンに しっかり結合しており、５５０個のアミノ酸を有し、分子量が約６０，０００ダ ルトンの酵素である。

この酵素は、当分野では長年にわたって結晶形態で使用可能であった。生物発光 を生起するホタルルシフェラーゼの機構についての分子成分の研究から、Ｗ＃素 の基質はホタルルシフェリン、即ち多複素環式有機ＩＤ−（−）−２−（６゜− ヒドロキシ−２°−ベンゾチアゾリル）−Δ２−チアゾリンー４−カルボンＭ（ 以降は特に記載のない限り“ルシフェリン”と表記する）であることが判ってい る。

生物発光を与える甲虫ルシフェラーゼ触媒反応（以降は単に“甲虫ルシフェラー ゼ−ルシフェリン反応”と表記する）は、ホタルルシフェリン、アデノシン三リ ン酸（Ａ　Ｔ　Ｐ　）及び酸素分子を含む２段階プロセスとして記述されている 。

初期反応においては、反応： Ｅ＋ＬＨｚ＋ＡＴＰ＋Ｍｇ”→Ｅ　−Ｌ　Ｈ２Ａ　Ｍ　Ｐ　＋　Ｐ　Ｐ　。

〔式中、Ｅはルシフェラーゼであり、ＬＨ，はルシフェリンであり、Ｍｇ２゛は マグネシウムイオンであり、ＰＰ、はピロリン酸塩である。〕 で示されるように、ルシフェリンとＡＴＰが反応してルシフェリルアデニレート を形成し、無機ビロリン酸塩が放出される。ルシフェリルアデニレートＬＨ，− ＡＭＰはルシフェラーゼの触媒部位にしっかりと結合したままである。

この形態の酵素が酸素分子に暴露されると、酵素に結合していたルシフェリルア デニレートが酸化されて、電気的に励起された状態のオキジルシフェリン（Ｌ　 ＝　Ｏ）を生じる。

励起した酸化ルシフェリンは、反応： Ｅ　−Ｌ　Ｈｚ　ＡＭ　Ｐ　＋　０２−（Ｅ−Ｌ＝Ｏ・ＡＭ　Ｐ　）＊＋　２　 Ｈ’＋　Ｃ０２↓ Ｅ−Ｌ＝Ｏ・ＡＭＰ十光 で示されるように、基底状態に戻るときに光を発する。Ｗｉ化されていたルシフ ェリン１分子ごとに１つの光子が放出される。Ｍ化ルシフェリンの電気的励起状 態は、甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に特徴的な状態 であり、酸化ルシフェリンが基底状態に戻るときに発せられる光の色（即ちエネ ルギー）は、同じルシフェリンを有する異なる甲虫種が異なる色の光を発するこ とから、酵素によって決定される。

ルシフェラーゼ、Ｍ　ｇ　２　”及びルシフェリンを含む反応混合物にＡＴＰを 注入することにより発光が開始されるとき、全ての成分が飽和濃度に近いかまた は飽和濃度である場合、強度が急速に増大し、次いで最初の数秒間で急速に減少 し、次いで更に減衰するが、この減衰は数時間も継続することがある。この反応 速度の減少は、生産物阻害によるものと考えられている。

ルシフェラーゼは微小濃度のＡＴＰをアッセイする手段として使用されており、 １０−”モルはどの微量のＡＴＰを、高品質の酵素調製物を用いて検出すること ができる。

ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はＡＴＰに高度に特異的なものである１例え ば、デオキシＡＴＰは、ＡＴＰによって生成される光の２％未満しか生成しない し、他のヌクレオシド三リン酸は０．１％未満しか生成しない。

ＡＴＰ濃度を他の酵素の活性と組み合わせると、ルシフェラーゼは、かかる他の 酵素及び他の化合物に対する生化学リポータ−分子となり得る。

甲虫ルシフェラーゼを他のアッセイにリポータ−として使用し得る可能性は十分 にある。しかしながらこのような使用は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の 発光速度の問題によって制限されている。このような速度の問題がなければ、直 ちに使用可能な甲虫ルシフェラーゼは、例えば酵素がリポータ−として作用する ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓ ｓａｙｓ）や、酵素がリポータ−として作用する核酸プローブハイブリダイゼー ションアッセイのようなイムノアッセイのごとき用途に使用されるであろう。

甲虫の発光器官から直接単離される結晶質ルシフェラーゼを使用し得るほかに、 数種の甲虫のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（特に、Ｐ、　ｒａｌｉｓ（ ホタル）のルシフェラーゼ、Ｐ、ｌａ　ｔｏ　ｈｔｈａｌａｍｕｓ（コメツキム シ）の４種のルシフェラーゼアイソザイム、Ｌ、ｃｒｕｃｉａｔａ（ホタル）の ルシフェラーゼ及びり、１ａｔｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．ｂｉｏｌ 、７，７２５−７３７（１９８７）；Ｍａｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎｅ　７７．２６５　２７０（１９８９）：Ｗｏｏｄｅｔ　ａｌ、、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４４，７００−７０２（１９８９）、欧州特許出願公開第０　３５ ３　４６４号〕が使用可能である。更に、ルシフェラーゼを産生ずる任意の他の 甲虫種のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが、公知の技術（ｄｅ　Ｗｅｔ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１３３．３−１４（１９８６）；Ｗ ｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４，７００−７０２（１９８９） ）を使用して当業者には容易に入手可能である。

入手した甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを用いれば、該ｃＤＮＡを発 現するように形質転換した細菌（例えばＥ、ｃｏｌｉ）、酵母、培養哺乳動物細 胞などから単離することにより高度に純粋な形態のルシフェラーゼを大量に製造 することは当業者には全く容易なことである。最近では、タンパク質をコードす る核酸からタンパク質を製造するために使用可能となった種々の無細胞系を使用 して甲虫ルシフェラーゼを作製することもできる。

更に、甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡｔ入手できることと、ルシフェ ラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを迅速にスクリ ーニングできること（ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、土掻 及びＷｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、土掻参照〕から、当業者は、ルシフェラーゼ−ル シフェリン反応による生物発光を触媒する活性を保持する突然変異ルシフェラー ゼを、大量に且つ純粋な形態で製造及び入手し得る。このような突然変異ルシフ ェラーゼは、天然甲虫ルシフェラーゼの配列と１力所以上で異なるアミノ酸配列 を有する１本明細書中の“甲虫ルシフェラーゼなる用語は、甲虫に天然に存在す るルシフェラーゼのみならず、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒するこ とにより生物発光を提供する活性を保持する、天然ルシフェラーゼの突然変異体 をも含むと理解されたい。

甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを容易に入手し得ることで、このよう なｃＤＮＡの発現、結果的には該酵素の産生をかかる遺伝事象と組み合わせるこ とにより、転写及び翻訳に関係する遺伝事象をシグナル分析、モニターまたは測 定するのに使用されるアッセイに５ルシフエラーゼをリポータ−として使用する ことができる。

甲虫ルシフェラーゼをリポータ−分子として使用し得る可能性は益々重要となる と共にがなり変化している一方で、実際には、酵素によって生じる発光の短詩性 及びパターンがそれらの使用を制限している。甲虫ルシフェラーゼを用いてより 効率的な光生成、即ちより継続的でしがち高い速度で発光を行なうことにより、 甲虫ルシフェラーゼのリポータ−としての有用性を増強することが望まれる。

ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の速度及び閃光の間に放出される光を正確に 測定することの関連問題を解決するための、幾分普及している１つの方法は、閃 光が発生するのを防いだり、光生成を延長すると報告されている種々の酵素阻害 剤を使用することである。酵素阻害剤の１例としてヒ酸塩がある。ヒ酸塩は閃光 の強度（ｈｅｉｇｈｔ）を下げ、所与の量のＡＴＰに対する発光を延長する傾向 にあるが、ＡＴＰを検出する感度を低下させる。ヒ酸塩を含むルシフェラーゼ調 製物は最近まで市販されていたが、このような調製物の使用はもはや好まれてい ない、それは一部には、用途によっては精巧な光測定装置を使用して、ヒ酸塩を 使用する必要性が避けられ得るからである。

しかしながら、そのような精巧な装置を用いてさえ、酵素と基質を迅速に混合す るための注入方式のような特定の実験作業は依然として必要とされている。この ような特定のやっかいな作業の必要性を回避するため、酵素反応における光生成 速度を改善することは、ルシフェラーゼのリポータ−としての有用性を大幅に拡 大する。

ヒ酸塩のほかにも多数の化合物が、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ る光生成パターンに影響すると報告されている。ヒ酸塩と同じ目的でリン酸塩が 使用されたが、リン酸塩を使用する場合にはアッセイにマグネシウムイオンを存 在させることが必要となり、不本意にもリン酸マグネシウムが沈澱するという結 果となるため、歓迎されなかった。

補因子、即ち補酵素Ａ（ＣｏＡ）も、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応におけ る発光パターンに影響すると報告されている。Ａｉｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ ｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　ＢＬｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、ｖｏｌ。

２７（１９５８）ｐｐ、５１９−５３２は、ＣｏＡをホタルルシフェリン−ホタ ルルシフェラーゼ混合物に加えると、光強度の初期ピークには影響しないが、発 光がより高いレベルで、加えた合計ＣｏＡに比例する時閉だけ継続すると報告し ている。Ａｉｒｔｈらは、全発光量がＣｏＡの不在下よりも存在下でより大きい ことも示した。

Ａｉｒｔｈらは更に、システィン及びグルタチオンは発光を刺激せず、詳細は与 えていないが、ヒドロキシルアミンはＣｏＡと同様に発光と剰激し、チオエタノ ールアミンは僅かに刺激すると報告している。

ルシフェリン、ＡＴＰ及び酸素の甲虫ルシフェラーゼ触媒反応による発光に及ぼ すＣｏＡの影響に係わるＡｉ　ｒｔｈらの教示は疑わしい、Ａｉｒｔｈらの報告 に続き、ルシフェラーゼに及ぼすＣｏＡの影響が、デヒドロルシフェリンによる 酵素阻害をＣｏＡが防ぐことに基づいて説明された。デヒドロルシフェリンは、 ホタル由来のルシフェリンを精製したＡｉ　ｒｔｈら及びこれに続く研究者によ って使用されたルシフェリンの有意な夾雑物であると考えられている化合物であ る。より最近及び今日使用されているルシフェリンは合成によって製造されてお り、従ってそれ自体はデヒドロルシフェリンを実質的に含まない、ルシフェリン の合成調製物には、ルシフェリンに対して典型的には１重量％未満、好ましくは ０．３重量？６未満のデヒドロルシフェリンしか混入していない、従ってＣｏＡ は、合成によって製造されたルシフェリンにおいてはルシフェラーゼ活性に影響 しないと推定される。甲虫ルシフェラーゼによる発光ｅｃｏＡ（及びＡｉｒｔｈ らの文献に記載されている他の化合物）が刺激するというＡｉｒｔｈら及びそれ に続く研究者らの教示は、ルシフェラーゼ触媒発光に基づくアッセイの実用性を 拡張しようという努力において３０年以上も完全に無視されてきた１例えば、ヒ 酸塩は７丈しくないと認識されているにも拘わらず、ＣｏＡがヒ酸塩の代替物と して示唆されたことはない。

更に、他のスルフヒドリル化合物が、酵素の調製及び貯蔵の際のルシフェラーゼ の安定性に貢献すると報告されている。米国特許第４，８３３，０７５号は、ジ チオトレイトール（ＤＴＴ）が、新たに調製したルシフェラーゼ溶液と比較して 、ＤＴＴなしではたった１０％の残留酵素活性しが持たないであろう熟成二二立 工上ユ且互−王上工１ユニ」ルシフェラーゼ溶液中で、ルシフェラーゼ活性を５ ０％レベルに維持することを開示している。米国特許第４，６１４．７１２号は 、細菌ルシフェラーゼがジスルフィド形成によって失活されたとき、ＤＴＴ、β −メルカプトエタノール（β−ＭＥ）または他の還元剤を加えることにより酵素 活性を回復し得ると記載している。甲虫ルシフェラーゼと細菌ルシフェラーゼと は構造及び作用が異なるが、いずれも、所定の還元剤により通常酸化がら保護さ れ得る反応性スルフヒドリル基を有するとみられている。

しかしながら当分野においては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び同様のチオ ール試薬は、約５ｍＭ以上の濃度ではルシフェラーゼによって触媒される発光を 阻害すると考えられている。

ルシフェラーゼの化学的機構（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の種々の局面が認識及び研 究されているにも拘わらず、従来技術は、実用的技術面で、検出モードとしての 得られる発光の有用性を増大するようなルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ る、より効果的な光生成をほとんど提供していない。

及ｊｆｌ約 本発明は、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光生成速度を改善し 、かがる光生成の化学的機構に係わる種々の新規知見をもたらす、光生成速度の 改善は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの生産物阻 害を減速または低減し、光生成触媒反応の間に起こるルシフェラーゼ失活を減速 する化学的機構に関係する。

速度改善は、一部には、これまで認識されていなかった２種票の組成物、即ちＣ ｏＡ及びルシフェリンのチオエステルと、ＣｏＡ、ルシフェラーゼ及び励起状態 の酸化ルシフェリンの結合体との作用による０本発明はこれらの組成物をも含む 。

甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合液に、Ｃ。

ＡもしくはＤＴＴのようなチオール試薬またはこれら両方を含めると、反応によ る光生成速度及び反応による全発光量が驚くほど向上することが見い出された。

更に、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合物にＣｏＡを含め、次いで混 合物を、反応による生物発光のピーク強度を少量だけ低下させる何等かの他の化 学的または物理化学的条件に暴露すると、反応による生物発光の全発光量を増大 するという有利な効果があることも見い出された。従って本発明は、甲虫ルシフ ェラーゼの存在について、試ｆｆ（例えば細胞）中で甲虫ルシフェラーゼの生成 をもたらす遺伝事象について、ＡＴＰの存在について、またはＡＴＰの生成をも たらす化学的もしくは生化学的事象について、試料を試験またはアッセイするた めに、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応及びそれによって生起される生物 発光を使用するための優れた方法と、該方法を実施するための組成物及び試験キ ットとを提供する０本発明の方法においては、本発明の組成物及び試験キットを 用いて、かかる光の全発光量に対するピーク強度の比を小さくすると共に全発光 量を増大することにより、またはピーク強度に達した後に強度が低下する速度を 遅くすることにより、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度 を改善する。

本発明の利点は、従来技術において反応に災いしていた“閃光”は著しく低減さ れるが、全発光量は著しく増大、典型的には従来秘術におけるかかる反応の１０ 倍以上に増大する光生成速度を有する甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を 提供することである６甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成され る光の生成速度及び全光量の向上によって、ルシフェラーゼを、またはルシフェ ラーゼを使用してＡＴＰをアッセイすることが、従来の方法よりずっと単純に、 しかもより高怒度になる。ｇＩ４えば本発明の方法及び組成物または試験キット を用いると、通常のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の急激な閃光において発 せられる光を測定するための、迅速に試料を注入するような特別の作業や精巧な ルミノメータ−のような特別の装置が、アッセイに必要ではなくなる。

実際、本発明の方法及び組成物またはキットを使用し、他のタイプの測定のため に実験室で既に使用可能であるシンチレーションカウンターのような装置を、甲 虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成される光を測定する必要があ るアッセイに使用することができる。これは、ルミノメータ−はないがシンチレ ーションカウンターまたは他の光生成を測定する装置は所有する実験室において 該アッセイの使用を容易にすることにより、科学及び技術分野におけるこのよう なアッセイの適用を著しく拡張し得る。

以前は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度は、このような光 を測定する必要があるアッセイにおけるシンチレーションカウンターの使用を阻 んでいた。

本発明によれば、甲虫ルシフェラーゼをマーカーまたはリポータ−分子として使 用し得る全可能性が実際に実現され得る。

特定の適応、組成物の変形君様及び物理的属性の他の利点及び更なる理解は、添 付の図面を参照して与えられる以下の本発明の詳ｍ説明を検討することにより得 られるであろう。

区ｌ１Ｊ１１４に朋 以下、本発明を添付の図面を参照して説明する。全図面を通して、同じ参照符号 は同じエレメントを指す。

１１１は、補酵素Ａの存在下及び不在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発光 を比較したグラフである。

図２は、ジチオトレイトールの存在下及び不在下での甲虫ルシフェラーゼ活性に よる発光を比較したグラフである。

［］３ａ及びｒＸＩ３ｂは、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生 成の触媒の不在下及び触媒中の、甲虫ルシフェラーゼ安定性に及ぼすジチオトレ イトール濃度の変化の影響を示すグラフである。

図４は、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血清アルブミンの存在下での甲 虫ルシフェラーゼ活性による発光を、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血 清アルブミンの不在下での同活性による発光と比較したグラフである。

図５は、酵素をコードするｃＤＮＡの発現によりルシフェラーゼが産生された培 養哺乳動物Ｍｉ胞由来の抽出物における甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を、 本発明のアッセイと慣用の従来技術のアッセイとにおいて比較したグラフである 。

図６は、（１）甲虫ルシフェラーゼ濃度の対数値と、本発明に従って実施したア ッセイにおける甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成された光の 対数値との一次相関と、（２）甲虫ルシフェラーゼを検出するアッセイの感度と を示すグラフである。

図７は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ る光生成に、３６ｍＭ　２−アミノエタノールは影響するが３６ｍＭ　エタノー ルは影響しないことを示すグラフである。

図８は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ る光生成に及ぼす種々のリン酸塩濃度の影響を示すグラフである。グラフ中、リ ン酸濃度が増加するにつれてピーク強度は低下している。

免肌ム■Ｉ 以下の説明においては、特に記載のない限り、室温（約り０℃〜約２５℃）及び 大気圧下で処理ステップを実施し且つ濃度を測定した。

本明細嘗中゛′ルシフェラーゼなる用語は、特に記載のない限り、天然または突 然変異甲虫ルシフェラーゼを指す。

ルシフェラーゼは、天然である場合には５甲虫目体、特にその発光器官から当業 者は容易に入手することができる。

ルシフェラーゼが、天然に存在するもの、またはルシフェラーゼ−ルシフェリン 反応において活性を保持する天然ルシフェラーゼの突然変異体であるならば、ル シフェラーゼをコードするｃＤＮＡを発現するように形質転換された細菌、酵母 、哺乳動物細胞、植物細胞などの培養体から、またはルシフェラーゼをコードす る核酸からルシフェラーゼを作製するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏｆｉ細胞系から、 容易に入手し得る。好ましいルシフェラーゼはホタルＰｈｏｔｉエエ１−１Ｌ工 互ユｉｓのものである。

“ルシフェリン”なる用語は先に定義しである。

本発明は、その＋ＩＥ！様の１つにおいて、ルシフェラーゼを含むと推定される 試料において甲虫ルシフェラーゼの存在を検出する方法であって、（ａ）前記試 料のアリコートを用いて、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェ ラーゼの活性に有効な濃度の、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、チオール試 薬及びＭ　ｇ　２　’を含む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた溶 液からの発光を測定することからなる方法を提供する。この本発明の第１ｗＡ様 は、単に、分析すべき試料（例えば、その細胞中で、ルシフェラーゼ発現を制御 するプロモーターが活性または不活性であった場合にそれぞれルシフェラーゼが 発現されたまたはされなかったと推定される哺乳動物細胞培養体の抽出物）の一 部（即ちアリコート）を取り、該アリコートを、存在するとすればその中でルシ フェラーゼがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性である、チオール 試薬を含む溶液と混合し、溶液（またはその一部）を測定して、生物発光がその 中で行われているか確認することを含む、試料のアリコートをこのような溶液と 混合することは、好ましくは、また一般的には、アリコートの全ての成分を溶液 中に単純に溶解するだけでよい、どんな場合でも混合は、ルシフェラーゼがアリ コート中に存在するならば、それが、アッセイ法の基礎をなす反応がその中で起 こる溶液中に溶解するようなものである必要がある。当業者には理解されるよう に、アッセイ法である本発明の方法は通常は適当な対照または基準と一緒に実施 され（例えば分析される試料がルシフェラーゼを含まない溶液及び既知濃度のル シフェラーゼを含む溶液と並行して分析される）、適当な基準をもってして該方 法は、試験試料（即ち分析されている試料）中の甲虫ルシフェラーゼの濃度を定 量化するのに適合され得る。

後述するように、本発明によってルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生 成速度が改善されるが故に、本発明のルシフェラーゼアッセイ法は、約１０−” Ｍ〜約１０−６Ｍの酵素を検出することができ、下限は、使用可能な最高の検出 装置においてさえノイズによってのみ制限される。

甲虫ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応においてルシフェラ ーゼが活性であるＰＨ、イオン強度、温度、ＡＴＰ濃度、マグネシウムイオン濃 度、ルシフェリン濃度などの条件の範囲が幾分異なる。しがしながら、任意の特 定の甲虫ルシフェラーゼに対するかがる範囲、場合によっては最適範囲でさえ確 定することは当業者には簡単なことである。

当業者は、例えば酵素の活性を維持または増強するために、またはアッセイ作業 を行なう試料アリコートを入手するのに使用する平原に必要なものとして、特に 上述したちの以外の組成物もアッセイ反応混合液中に存在させ得ることに気付く であろう。例えばトリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥｌ”ＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒ　ｉ　 ｓ、グリシルグリシン、リン酸塩などの典型的なＭｆＩＩ剤を、ｐＨ及びイオン 強度を維持するために存在させ、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるル シフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば哺乳動物血清アルブミ ン（好ましくはウシ血清アルブミン）ｔたはラクトアルブミンもしくはオボアル ブミンを存在させることもでき、アッセイすべきルシフェラーゼを抽出する系（ 例えばｍ胞）中に存在し得て且つルシフェラーゼまたはＡＴＰに悪影響を及ぼし 得る金属含有プロテアーゼまたはホスファターゼの活性を抑制するためには、Ｅ ＤＴＡまたはＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミンテトラアセテート）などを存 在させ得る。ルシフェラーゼを安定化するグルセロールまたはエチレングリコー ルを存在させることもできる。同様に、洗剤または界面活性剤、特に非イオン性 洗剤、例えばオクトキシノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のようなＲｏｈｍ＆Ｈ ａａｓの商品名“Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ″で販売されているもの）を、典型的にはル シフェラーゼをアッセイ用に抽出する。ｌｌ［ＩＪＩ２１を溶解するのに使用す る溶液の、本発明のアッセイに使用する溶液に混合される残りの部分として含め ることができる。マグネシウムに対する対イオンは勿論存在させる。当業者には 理解されるように、かかる対イオンの化学的特性及び濃度は、マグネシウムイオ ンを与えるのに使用されるマグネシウム塩、使用するＭｆｒ液、溶液のｐＨ，ｐ Ｈ調節に使用される物質（ｉａまたは塩基）、並びに、マグネシウム塩、緩衝液 及びｐＨ調節に使用する酸または塩以外の資源から出た溶液中に存在するアニオ ンに従って、広範に変化し得る。１つの方法においては、所望のマグネシウムイ オン濃度を与えるために、使用するＭ衝液（例えばトリシン）の溶液中の炭酸塩 としてマグネシウムイオンを供給し、次いで緩衝溶液のｐＨを強酸、例えば硫酸 を加えることにより調節することができ、そうするとほとんどの炭酸塩（及び重 炭酸塩）が二酸化炭素として失われ、かかるアニオンをスルフェート、ビスルフ エート、トリシンアニオン、場合によっては（溶液中に存在し得て、アニオンを 与える他の物質（例えばリン酸塩）によって）ｆ［！！のタイプのアニオンで置 き換える結果となる。アッセイ法を実施する溶液の空気からの酸素飽和は、ルシ フェラーゼ−ルシフェリン反応に必要とされる酸素分子を与えるに十分である。

どんな場合でも、ルシフェラーゼールシフェリン反応におけるルシフェラーゼの 活性に有効である該方法の説明において特に上述した成分を含む、アッセイ反応 混合液中の種々の成分の濃度を容易に確定することは、十分に当業者の技術の範 囲内である。光生成速度向上に必須の成分はチオール試薬である。

本発明の方法及び組成物に使用されるチオール試薬は、ＣｏＡまたはＣｏＡ以外 のチオール試薬である。ＣｏＡ以外のチオール試薬は、ルシフェラーゼ−ルシフ ェリン反応が起こる温度、ｐＨ、イオン強度、化学組成などの条件下で空気飽和 水溶液中の還元荊として有効となり得る遊離スルフヒドリル基を有する試薬であ る。かかる試薬のなかで好ましいのはジチオトレイトールである。使用し得る他 の試薬としては、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、２−メルカプトプロ パツール（鏡像異性体または両鏡像異性体の任意の組合せ）、３−メルカプトプ ロパツール、２，３−ジチオプロパノール及びグルタチオンを挙げることができ る。

本発明の方法に従ってルシフェラーゼをアッセイし得る試料のタイプとしては、 特に、イムノア・ンセイにリポータ−として使用されたルシフェラーゼを含む試 料、または、核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにリポータ−として 使用されたルシフェラーゼを含む試料を挙げることができる。イムノアッセイ及 び核酸プローブ技術において理解されているように、本発明に従ってアッセイさ れたルシフェラーゼは、それぞれイムノアッセイまたは核酸プローブハイブリダ イゼーションアッセイにおいて被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）を検出するのに使 用される抗体または核酸プローブに化学的に、該技術においては公知の多数の方 法のいずれかによって結合されている０次いで、やはりよく知られた方法に従っ て、ルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブを分析すべき試料と混合し、試 料中に存在する可能性があり検出がめられている被分析物質（例えばイムノアッ セイの場合には抗原または抗抗原抗体、核酸プローブハイブリダイゼーションア ッセイの場合にはターゲット核酸）に結合させ、次いで、被分析物質と結合しな かったルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブを、もしあれば結合したもの から分離する０本発明に従ってアッセイすべき試料は、ルシフェラーゼ標識抗＃ Ｃまたは核酸プローブの被分析物質に結合したかかる抗体またはプローブ上のラ ベルであったルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、本発明に従ってルシフ ェラーゼをアッセイする間、標識抗体またはプローブに化学的に結合したままと することもできるし、ここでも公知の方法によって、本発明に従ってルシフェラ ーゼをアッセイする前に標識抗体または核酸プローブから分離することもできる 。甲虫ルシフェラーゼをリポータ−またはラベルとして使用し得るイムノア・ン セイ及び核酸ブローブハイプリダイゼーションア・ンセイは、生物学、バイオテ クノロジー、並びに病原体の検出、遺伝子異常の検出、疾患の診断などを含む医 学の分野で多数の実用及び研究用途を有する。

本発明の方法に従ってルシフェラーゼの存在をアツセイし得る別のタイプの試料 は、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片に結合されたプロモーターまたは他 の転写調節エレメントによる転写の活性化に応答して、またはルシフェラーゼを コードするＲＮＡの転写の結果として、ルシフェラーゼが発現した細胞の抽出物 である。このような細胞においてはルシフェラーゼは、クロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのような他の酵素が、転 写または転写調節のような遺伝事象をモニターするのに使用されるのと同様に使 用される。このような甲虫ルシフェラーゼの使用は分子生物学及び生物医学にお いて重要であり、例えば、特定のプロモーターまたは他の転写調節エレメントに おける転写活性化または転写抑制活性によって、治療作用に対して化合物をスク リーニングすることに使用され得る。

本発明は、別のｆｉ様においては、ＡＴＰを検出する方法を提供する。この方法 は、生物発光の生起にＡＴＰが必要であるという事実から、ルシフェラーゼをア ッセイする方法からなる本発明の態様から派生したものであり、ＡＴＰではなく て甲虫ルシフェラーゼがアッセイ反応混合液の必須成分であることだけが、ルシ フェラーゼをアッセイする方法とは異なる。アデノシン三リン酸を含むと推定さ れる試料中の該化合物の存在を検出する本発明の方法は、（ａ）前記試料のアリ コートを用いて、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン、チオール試薬及びＭｇ２ °を、全てがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼ活性に 有効な濃度で含む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた溶液からの発 光を測定することからなる。当業者には容易に理解されるように、ＡＴＰ濃度が 既知の適当な可変基準と、ＡＴＰ濃度が未知の試料とを用いて本発明の方法を実 施することにより、該方法は、未知濃度の試料中のＡＴＰ濃度を決定するように 適合し得る０分析されている試料中のＡＴＰは、種々の生化学的事象または反応 １例えば血小板凝気によって上昇し得る。従って本発明のＡＴＰをアッセイする 方法は、ＡＴＰを生成する事象または反応をモニターすることにも使用し得る。

好ましくは、本発明の方法（及び組成物）においては、使用するルシフェラーゼ は合成によって製造し、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬の両方を使用また は存在させ、溶液である本発明の組成物においては、ＣｏＡは約０．１ｍＭ〜約 １．０ｍＭの濃度で存在させ、ＣｏＡ以外のチオール試薬は約２０ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度で存在させる。

本発明は、更に別の態様において、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し 得る甲虫ルシフェラーゼ、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬を含む組成物を 提供する。

かかる組成物は好ましくは水溶液であるが、例えば凍結乾燥成分混合物とするこ ともできる。“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”なる表現は、 組成物中の酵素がそのままで反応を触媒できるか、または、酵素が反応を触媒す ることにおいて活性となるように組成物を再構成、溶解、またはその他化学的も しくは物理的に処理し得ることを意味する。酵素が不可逆的に失活または阻害さ れるならば、それは、“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”とは 言えない０本発明の組成物は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光生 成速度を著しく改善し、本発明のアッセイに、本発明の試験キットに、本発明の アッセイ及び試験キットにおける基準に、並びに、本発明のアッセイ混合液及び 試験キットと混合液及びキットに使用するための基準を調製することに使用され る０本明細書中に詳細に記載したように、本発明の組成物は、上述のごとき作用 する能力のある甲虫ルシフェラーゼ、ＣｏＡ、及びＣｏＡ以外のチオール試薬の ３種の必須成分のほかに多数の他の成分を含むことができる。

本発明は更に、本発明のアッセイ法を実施するための試験キットをも提供する。

かかるキットは、通常はアッセイに使用するのを容易にするよう都合良くパッケ ージされている１つ以上の容器内に、本発明のアッセイを実施するのに必須の種 々の成分を所定量で含む、即ち、ルシフェラーゼをアッセイするためのキット内 には、反応に不可欠であることがよく知られているマグネシウムイオン、ＡＴＰ 及びルシフェリンに加えて、チオール試薬をも念む、゛°ルシフェラーゼールシ フェリン反応組成物“と称される組成物が含まれる。かかる組成物は、ＣｏＡと 、ＣｏＡ以外のチオール試薬、例えばＤＴＴとの両方を含むのが好ましく、例え ばタンパク質性ルシフェラーゼ活性エンハンサ−（例えばウシ血清アルブミン） 、ＥＤＴＡもしくはＣＤＴＡ、リン酸塩もしくは２−アミンエタノール（下記参 照）のような他の成分、または、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が適当 な速度で進行するｐＨ及びイオン強度の溶液を与えるための緩衝液を含み得る。

キット内のルシフェリンは合成によって製造されているのが好ましい。既に述べ たように、種々の成分は例えば、溶液または凍結乾燥混合物で組合されていても よいし、単一容器内またはそれぞれを含む複数容器内で組合されてもよい、ルシ フェラーゼが発現される細胞中のルシフェラーゼをアッセイするための好ましい キットには、細胞は溶解するが、活性形態または活性になり得る形態で細胞中に 存在し得るルシフェラーゼを（溶解の際に放出される種々の酵素の作用に対して ）保存するのに有効な溶液くまたは溶液を調製するための成分）も含まれる。

ＡＴＰをアッセイするための試験キットは、ルシフェラーゼをアッセイするため のものと類似であるが、但し、かかるキットはＡＴＰの代わりに甲虫ルシフェラ ーゼを含む。

本発明の試験キットは更に、当業者には良く知られているように、該キットを使 用して実施されるアッセイの信顆性及び精度を保証するため、及びキットの被分 析物質（例えばルシフェラーゼ、ＡＴＰ）に対して試料を定量分析し得るように 、種々の対照及び基準、即ちルシフェラーゼまたはＡＴＰを含まないものく負の 対照）含むルシフェラーゼまたはＡＴＰ濃度が既知の溶液を含むことができる。

本発明は、別の態様においては、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におい て生成される光を測定することからなる、試料中の物質（例えばＡＴＰ、ＡＴＰ を生成する結果となる物質、ルシフェラーゼ）の存在をアッセイする方法の改良 を含む、改良は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応をＣｏＡの存在下に、該反 応において生成される光のピーク強度を少量だけ（例えばかかる条件の不在下で のピーク強度に対して約３％〜約３０％）低下させる条件下に実施することから なる１本発明のこの態様は、ＣｏＡの存在下でルシフェラーゼ−ルシフェリン反 応が進行する条件を反応による光生成のピーク強度が少量だけ低下するように変 更すると、反応において放出される全光量（即ち強度対時間の曲線を積分するこ とにより測定されるｊｌ）が増大する結果となるという新規知見に基づいている 。これは、反応において生成された光についての強度対時間の曲線を平坦化し、 それによって全光出力をより単純に且つより正確に測定し得るという利点がある 。勿論、同じ条件を各県に適用してもピーク強度と低下するのに使用される条件 が種々の程度に変更されるが故にピーク強度が種々の程度に低下されることな除 いては同じ一連の反応系において、条件が適用されず従ってピーク強度が低下さ れなかった系からの全出力と比較して、（強度対時間の曲線を反応開始から積分 することにより測定される）全光出力の増加が実現されるには、ピーク強度がよ り大きく低下したならばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はより長い時間進行 する必要がある〔例えば図８参照〕０種々の条件を変更してピーク強度を少し低 下させることができる１例えば反応のｐＨ、イオン強度または温度を、当業者に は容易に確定され、また関与する特定の甲虫ルシフェラーゼに幾分従う方法で、 ピーク強度が低下するように変更することができる。また、ルシフェラーゼの阻 害物質である種々の物質を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が行われる溶液 中に、適当な濃度で含めることもできる。このような物質としては、約１０ｍＭ 〜約ＬＯＯｍＭの濃度の２−アミンエタノール、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度の リン酸塩を挙げることができるＣｒ：ｉ！１７及び図８参照〕、この改良は本発 明の新規の方法にも適用され、例えば３６ｍＭ　２−アミンエタノールまたは２ ５ｍＭ　リン酸塩を、ＣｏＡだけでなく、ＣｏＡ以外のチオール試薬をも存在す るルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合液中に含めることができる。

本発明の基礎をなすと考えられる機構は完全には理解されていないが、本明細書 においてかがる機構に言及したことが本発明の範囲を制限すると解釈されるべき ではない。

ＣｏＡは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する際に酵素及び電気的に 励起されたオキジルシフェリンと相互作用し、この相互反応の１つの結果として 、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の過程で酵素の生産物阻害を低下させる（ 本明細書中“酸化ルシフェリン（ｏｘｉｄｉｚｅｄ　Ｉｕｃｉｆｅｌｉｎ）”と も称するオキジルシフェリンは、ルシフェリンのチアゾリン環の４位置に水素及 びカルボキシレートの代わりに酸素を有することでルシフェリンとは異なる）、 従って本発明の１つの態様は、ＣｏＡ。

甲虫ルシフェラーゼ、及び酵素上で励起状態にあるオキジルシフェリンの結合体 である。

ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼー励起オキジルシフェリン結合体の存在はこれまで 認識されていなかった。かかる結合体は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に おいて生物発光が生起されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ（例えばアッセイに使用されてい るルシフェラーゼ溶液中）及び甲虫の発光器官細胞中を含む、ＣｏＡ、ルシフェ リン、ＡＴＰ、酸素及び酵素的活性形態の甲虫ルシフェラーゼが共在する任意の 溶液中に存在する０本発明においては、結合体が実際に存在する環境の外、即ち 甲虫においてルシフェラーゼが天然に存在する細胞の外にある甲虫ルシフェラー ゼのみの、Ｃ０Ａ−酵素−励起オキジルシフェリン結合体を特許請求する。

甲虫ルシフェラーゼは、ＣｏＡ及びルシフェリンのチオエステル、ルシフェリル ーＣｏＡの形成を触媒する。この化合物の存在もこれまでに認識されていない。

従ってこのチオエステルは本発明の別の態様である。

ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼー励起オキジルシフェリン結合体と同様に、ルシフ ェリルーＣｏＡは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生物発光が生起 される１ｎｖｉｔｒｏ（例えばアッセイに使用されているルシフェラーゼ溶液中 ）及び甲虫の発光器官細胞中を含む、ルシフェリン、ＡＴＰ、ＣｏＡ及び酵素的 活性形態の甲虫ルシフェラーゼが共在する任意の溶液中に存在する０本発明にお いては、化合物が実際に存在する環境の外、即ちルシフェラーゼが天然に存在す る細胞の外にあるルシフエリルーＣ。

Ａのみを特許請求する。ルシフエリルーＣｏＡは、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフ ェリン反応における光生成速度に及ぼすＣｏＡの有益な効果を仲介することにお いて重要な化合物である。チオエステルの形成は、ＣｏＡの存在下での、ルシフ ェラーゼ−ルシフェリン反応における生産物阻害の低下に関与する。

ルシフェリン−ＣｏＡが生成された後のその行末は明らかではないが、チオエス テルは酵素に結合したままであること、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応 を触媒する過程でチオエステルからＣｏＡが再生されることが考えられる。

還元剤として機能する遊離チオール基を有する千オール試薬、即ちＤＴＴまたは β−ＭＥなどの物質は、甲虫ルシフェラーゼと、または酵素による触媒反応生成 物と何等かの方法で相互作用する一方で、発光生起を触媒する。ルシフェラーゼ に及ぼすこれらの試薬の作用は、触媒反応の間のこの相互作用によって、ＣｏＡ の作用が飽和する濃度の約１０倍〜約１００倍の濃度で飽和するようである。触 媒反応の間のチオール試薬と酵素または酵素による触媒反応生成物との相互作用 によって、試薬は、千オール試薬の不在下で失活が生じるであろう速度より酵素 の失活を遅らせる。

ＣｏＡは、上記役割に関係する特定の結合部位を有する酵素の基質でもあり、関 係酵素活性安定化特性を有するチオール試薬でもある。ＣｏＡを用いると、恐ら くはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の際の生産物阻害の速度を減速すること に関係して反応の間に生じる酵素失活速度をＣＯＡが増大するので、状況はより 複雑となり得る。触媒反応の間にＣｏＡ基質結合部位を飽和するのに必要とされ るより過剰な濃度のＣｏＡは、他のチオール試薬と同様に、失活遠度を減速する 。

甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応速度に及ぼすＣｏＡの作用は、基質によ って酵素に結合する飽和に典型的な範囲である約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの比較的 低いＣｏＡ濃度で飽和する。

甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の速度に及ぼすＣｏＡ以外のチオール試 薬の作用は従来技術によって示されていない６作用は、タンパク賀を製造及び貯 蔵の間の失活から保護するために当分野において示されている・１ｍＭ〜５ｍＭ よりはるかに高く、またかかる速度に及ぼすＣ。

Ａの作用が飽和する０、１ｍＭ〜１ｍＭよりもずっと高い、約３０ｍＭ〜約８０ ｍＭで飽和する。チオール試薬の安定化作用は、従来技術によって示されている ような通常の、単に酵素を酸化から保護することによるものではない、５ｍＭ以 上でチオール試薬は、生物発光触媒反応のないところでは、安定化が単に酵素上 の基を酸化から普通に保護することによるものであるならば該試薬が持つであろ うような安定化作用は酵素に及ぼさないが、かかる触媒反応が進行している間は 酵素を安定化する。

従って本発明は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において、生産物阻害の低 下丈たはルシフェラーゼ失活の低下の結果として光生成速度が改善されるルシフ ェラーゼ組成物を提供する。１つのこのような組成物は、甲虫ルシフェラーゼ、 約０．１ｍＭ〜１．ＯｍＭのＣｏＡ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＣｏＡ以外の チオール試薬と含む水溶液である０組成物は、約０．１ｍＭ〜１．０ｍＭのＡＴ Ｐ　；約０゜１ｍＭ〜１．ＯｍＭのルシフェリン；約２ｍＭ〜約１５ｍＭのＭｇ ″２イオン；ビーク強度を最高的３０％だけ低下させるのに有効な濃度のホスフ ェートイオン、２−アミンエタノールまたは他のピーク強度低下用化合物；溶液 のｐＨ及びイオン強度を、甲虫ルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ルシフェリン 反応において活性である範囲に維持するための、トリシン、ＨＥＰＰＳ−ＨＥＰ ＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、グリシルグリシン、リン酸塩などのＭ新液；約ＩＯ μｇ／ｍ１〜５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉの、需乳動物血清アルブミンまたはラクト アルブミンまたはオボアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミンのようなタン パク質性ルシフェラーゼ活性エンハンサ−；約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのＥＤＴＡ またはＣＤＴＡのような他の物質を含むこともできる０本発明の組成物における ルシフェリンは合成であるのが好ましい。

更に別のＷｓａ！においては本発明は、化合物を含むと考えられる試料中のＡＴ Ｐを検出する方法及び試験キットを提供する１本発明の方法及びキットは、甲虫 ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による生物発光に依存しており、本発明に従 って、かかる反応による光生成速度が改善される組成物を使用する。

その中にルシフェリンが存在する水溶液である本発明の組成物、即ち本発明の方 法に使用される組成物中には、ルシフェリンが典型的には約０．１ｍＭ〜約１ｍ Ｍ、好ましくは約１ｍＭの濃度で存在する。同様に、ＡＴＰが存在するかかる組 成物中のＡＴＰ濃度は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭであ る。水溶液である本発明のかかる組成物、即ち本発明に使用されるかかる組成物 中にＣｏＡが存在する場合は、ＣｏＡ濃度は約０．００１ｍＭ〜約１ｍＭ、好ま しくは約１ｍＭである。同様に、存在するＤＴＴ濃度は約２０ｍＭ〜約２００ｍ Ｍ、好ましくは約３０〜４０ｍＭであり、ＢＳＡ濃度は約０．５ｍｇ／ｍ１〜約 ５ｍｇ／ｍ＋、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌである。

ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光は、市販のルミノメータ−、シンチレ ーションカウンター、光増幅器、光度計またはフォトエマルジョンフィルム（ｐ 　ｈ　ｏ　ｔ　ｏ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｆｉｌｍ）ｅ使用して測定することがで きる。

反応溶液中で本発明のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を開始するためには、 （通常は２種類の）溶液を単純に混合するか、または一方の溶液を他方の溶液中 に注入して２つの溶液を迅速に混合することにより、反応溶液を調製することが できる。本発明に従ってチオール試薬を使用すると、迅速な混合（注入）方式の 必要性がほとんどの場合に回避される。

通常のルシフェラーゼアッセイによる光生成を、本発明のアッセイ方法と比較す るように計画された種々の実験によって、本発明の方法を試験した。

また、光生成に及ぼすＣｏＡの作用を、それが不在の場合の光生成と比較した。

混合前に、この補因子を酵素に加えた。かかる試験においては、２５ｍＭ　）リ シン、７ｍＭＭｇ”及び１ｍＭＥＤＴＡからなるＩＩ衝液液中３ｍＭＣｏＡを含 むまたは含まない、３ｍＭルシフェリン及び３ｍＭ　ＡＴＰを含む溶液１００μ ｌを、ルシフェリン溶液について上記したのと同じ緩衝液中に０．８Ｎｍ　ルシ フェラーゼを含む溶液２００μｌ中に注入した１図１は、Ｃ。

Ａの存在する場合及びしない場合のルシフェラーゼの発光を示している１反応に よって放出された全光量は、無限時間まで外挿した指数間数的減衰強度を積分す ることにより推定した。かかるデータは、アッセイ混合液にＣｏＡを加えるとよ り大きい初期光強度を与え、初期減衰速度はより小さく、全発光量は２倍以上に 増大することを示している。

特に合成ルシフェリンを使用したことがら見て、このようなデータは予想外であ った。

スルフヒドリル基を有する他の試薬の作用を試験した。

図２は、３３．３ｍＭ　ＤＴＴがアッセイ混合液中に存在する場合の発光曲線を 示す、この試験においては、ＣｏＡを用いた実験について上述したのと同じＨ新 液中に３ｍＭルシフェリン、３ｍＭ　ＡＴＰ及び１００ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液 １００μ夏を、同じＭｆ［−液中に０．８ｎＭルシフェラーゼを含む溶液２００ μｌ中に注入した０曲線ははるかに高い“定常状態”を示しおり、全光生成はＤ ＴＴが存在しない場合の６，３倍に増大した。＃素を用いてＤＴＴをブレインキ ュベーションした場合も試験した。アッセイ前に１０ｍＭのＤＴＴを酵素に加え ても、光生成に有意な増加はなかった。他のチオール試薬を用いた結果もＤＴＴ に見られたものと同様であった。

更に、従来技術において広く報告されているチオールの保護作用と比較したＤＴ Ｔの作用モードをテストする試験を実施した。かかる試験においては、２０ｍＭ 　）リシン（ｐＨ７，８）、８　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　”、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ 、０．５３ｍＭ　ＡＴＰ及び０．２７ｍＭ　ＣｏＡを含み、更に、一方の溶液は ５ｍＭ　ＤＴＴを含むが他方は４０ｍＭ　ＤＴＴを含む２種類の溶液をそれぞれ １０００μｌずつ調製した。

同量のルシフェラーゼアリコートをそれぞれに加えた１種々の時点で、２００μ ！の溶液を取り出し、ルシフェリンを濃度０．４７ｍＭまで加えて酵素活性を生 起させた。ルシフェラーゼ溶液の条件は、ルシフェリンが存在しないので触媒反 応が進行できないことを除いては、反応条件と同じである。光出力を１０分間測 定した。結果を図３ａ及び図３ｂに示す、これらの結果から２つの結論を引き出 すことができる。第一に、酵素活性の安定性は触媒反応の間はずっと低下し、第 二に、ＤＴＴ濃度が５ｍＭ以上に増加しても触媒反応の不在下ではルシフェラー ゼの安定性を増大しないが、触媒反応の間の安定性が増大される。ルシフェラー ゼ−ルシフェリン反応を触媒しないとき及び該反応を触媒するときで、ＤＴＴは 酵素に異なるモードで作用するらしい。

他の添加物の作用をテストする試験も実施した６例えば、ＢＳＡは光強度を約２ ０％増大したが、減衰速度は変えなかった。非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１００を加えた場合は初期光強度の増大が認められたが、減衰速度も増 大した。他の非イオン性界面活性剤は酵素活性にわずかな作用しか示さなかった 。

図４は、ＣｏＡ、ＤＴＴ及びＢＳＡが混在したアッセイ、ＣｏＡが単独で存在し たアッセイ、何も加えていない通常のアッセイにおける発光曲線を示す、ＣｏＡ 、ＤＴＴ及びＢＳＡの併用効果は、何も添加しない場合の１５倍以上大きい全光 生成量をもたらした。

本発明の方法の驚くべき結果は、チオール試薬及び酵素安定化剤の不在下の発光 と比較して、１０分間の全発光が１５〜１７倍に増大し得ることである。上記物 質の併用効果は、ルシフェラーゼのリポータ−としての有用性を増大している。

優れた光生成によって、所定の生物特異反応における生産物または事象を検出す る高度に感受性で迅速な方法が可能となる。

以下の実ａ例によって本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を ＃Ｉ＠するものではない。

！ＥＪＬＬＬ 外来宿主中のルシフェラーゼ合成を検出するための、溶解剤及びアッセイ試薬か らなるキットを製造した。溶解剤は、２５＠Ｎ　Ｔｒｉｓ−リン酸塩（ｐＨ７， ８）、１０ｇグリセロール（エチμ”ｊ　り！／　：７−ルテ置換し得る）、１ 　ｇ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００［商標；Ｒｏｈ腸＆　ｆｆａａｓ　Ｃｏｒｐ、 製、１分子当たり９〜１０個の平均エチレニルオキシ（−ＣＨ２ＣＨｚＯ−）ユ ニット数を有するオクトキシノール混合物である非イオン洗剤］、１　ｍｙ／ｌ ｌウシ胎児血清アｌレブミン（ＢＳ＾ン、２ｍＭ　ＣＤＴ＾（シクロヘキシレン ジアミン四酢酸塩）及び２ｍＭ　ＤＴＴからなっていた。アッセイ試薬は、２０ １Ｍトリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）Ｍ階液（ｐＨ ７，１１１）、３３．３ｍＭ　ＤＴＴ、８ｄ　Ｍｇ”、０．１３鱈ＥＤＴＡ、０ ．５３ｍＭ＾ＴＰ、０．４７ｍＭルシフェリン及び０．２７ｍＭ　ＣｏＡがらな っていた。

ａｍ質抽出物ヲ、７　ラスミＦ　ｐＲ５ＶＬを含ｔｒｉｌｌ（３Ｔ３Ｍ胞、Ｐ、 ｐｙｒａｌｉｓホタルルシフェラーゼをコードするｅＤＮＡを含むプラスミドか ら、ラウス肉腫ウィルスゲノムに対応するプロウィルスｔｌＮ＾の５’−［、Ｔ Ｈの転写制御下で誘導した。細胞をＬＯＯ＊ｚベトリ皿の約１７３に生長させた ０次いでＨｉ胞を当業界で公知の標準リン酸カルシウム法を使用して１０μｇプ ラスミドＯＮ＾で形質転１′ａ５せ、３らに４８時間生長させた。

培養した細胞に溶解剤１ｙ１を添加して室温で２〜５分溶解した。溶解？麦、細 胞破片を簡単に遠心分１１（約１０秒）して除去し、ルシフェラーゼ活性に関し て上清（即ち、細胞質抽出物溶液）を試験した。

細胞質抽出物：アッセイ試薬的１：５〜１：２５の割合でアッセイ試薬と細胞質 抽出物を混合し、酵素活性を試験した。混合する際に注入法は使用しなかった。

本発明のアッセイの細胞抽出物−ルシフニリン反応の発光を、ルシフェラーゼ活 性に関する通常のアッセイと比較した６本発明のアッセイは注入方法が必要ない が、通常の従来のアッセイで必要な混合用に注入−型フォーマットを使用して比 較を実施した。これらの比較では、２０１１８　）リシン、８ＩＩＭＭｇ”、０ ．１３ｍＭ　ＥＤＴ＾のＩＩＩ液（ｐＨ７，８）中、０．８ｍＮＣｏ＾、１．４ ｍＭ　ｌレジフェリン、１．５ｍＭ＾ＴＰ及び９０Ｊ　ＤＴＴを含む溶液１００ μｌを、２０μＩＭＩ胞質抽出物と２００μＩＭ衝液（２０ｍＭトリシン、０． ８ｍＭＭｇ”、０．１３Ｊ　ＥＤＴ＾：ｐＨ７，８＞とを混合することにより作 成した溶液２２０μｌに注入し、次いで発光を標準ルミノメータ−（例えば、Ｔ ｕｒｎｅｒモデル２０ルミノメータ−）ご使用して測定した。遺伝学的事象［＠ えば、転写（Ｎｏ１．Ｃｅ１１．８ｉｏ１．７，７２５−７：１７：１９８７． 　５ｃＩｅｎｃｅ　２３４．　８５６−８５９（１９８６））コのリポータ−と して使用されるルシフェラーゼのＲ初の報告に記載されているアッセイを適用す る通常の比較アッセイは、２５＋＊Ｍグリシルグリシン、１２ｍＭ　Ｍｇ”の緩 衝液（ｐＨ７，８）中０，６７−Ｈルシフェリンと含む溶液１００μｌを、２０ μｍ細胞質抽出物と５．８３ＩＩＭ　ＡＴＰを含む２００ｔｔ　１緩衝液（２５ 〜Ｎグリシルグリシン、１２１ｍＮＭｇ”、ｐＨ７，８）を混合して作成した溶 液２２０μｌに注入することからなる。

図５は、これらの試験結果を示している１図５のグラフに於いて、発光強度が注 入時間からの時間の関数としてプロットされている。この結果は、０〜６０秒で 強度対時間曲線の積分により出力を決定すると１本発明のアッセイが従来のアッ セイの１０倍の光の出力（即ち、生起した発光）を出すことを示し、０〜５０分 で強度対時間曲線の積分により出力を決定すると、従来のアッセイと比較して生 起した発光が１７倍増加することを示している。従来のアッセイと比較して、本 発明の方法のアッセイでの強度に強いピークがないことは、図５から明らかであ る。

及１１工 ｌ　Ｈ／ｗｅストックルシフェラーゼ溶液を、１０１　ＫＭアンモニウム及び１ ０！グリセロール中の結晶質の純粋なｐ、ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼから調 製した１反応に使用するルシフェラーゼ溶液を、実施例１に記載の溶解剤を１０ ０倍に希釈してストック溶液から調製した。各希釈液から２０μｌを実施例１に 記載のアッセイ試薬２００μｌに（注入せずに）添加し、発光を測定するために 標準ルミノメータ−にセ・ｙトした。

図６は、種々のサンプルに関してルシフェラーゼ濃度の対数の関数として生起し た発光量（６０秒間の発光強度の積分により決定した）の対数をプロ・ノトシた ものである６図６の曲線は、ルシフェラーゼ濃度に関して８オーダーにわたって 良好な直線性を示している。このような最低濃度を示す区６のグラフ上のデータ ポイントのルシフェラーゼ濃度は、従来報告されたルシフェラーゼの最高態度の ア・ンセイで検出可能のルシフェラーゼの最低濃度よりも５０倍も低い、従来法 のシステムと比較して生起した発光量が多く、光測定装置中のランダムノイズの 作用を平均化させる“平坦”機構により、本発明の方法は高感度となる。

この実施例に記載の実験では、ルシフェラーゼの全濃度に於いて光生起機構は殆 ど平坦である６又、各濃度（５レプリカ）に於ける測定の変動係数は、ルミノメ ータ−中のノイズ由来のシグナルが念著である最低濃度以外では、１．５ｚより も良い、この精度レベルは、従来法即ち、注入型アッセイで通常報告されるレベ ルと等しいかまたはそれ以上に良好である。

図６の曲線により表された直線性、曲線のデータポイントが測定され得る精度、 及び比較的ルシフェラーゼ濃度の高い′１ｇ液（約ＩＮ＞を使用して実施例４で 報告された実験に基づいて、本発明のアッセイに関するルシフェラーゼ濃度の実 際の範囲は、起こり得る最低のバックグラウンドと有する光検出方法が検出し得 る最低濃度（現在、溶液２００μ！容積中約１０−’　”　〜１０−　”　１４ 即ち、酵素約２００分子）カラ約１０μＨまでに広がる。実際、重要な総てのサ ンプル中のルシフェラーゼ濃度はこの範囲内に十分大る。

１１色± この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応由 来の全発光に於ける反応由来の発光のピーク強度を少し減少させる好都合な作用 を提供する。

ｒＸ１７は、　ＣｏＡを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン混合物中に３６１Ｍ のルシフェラーゼインヒビター（２−アミンエタノール）３含むと、発光のピー ク強度を約１２１減少させ、反応の開始から約３分以上の発光強度の積分で測定 した場き、発光生起量を増加させること９示している。

同様に、図８は、ＣｏＡを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合物中にル シフェラーゼインヒビター（リン酸塩）も含むと、発光のピーク強度は（リン酸 塩濃度に依存して）下がるが、リン酸塩イオン濃度によって異なるが発光強度を 時間で積分して決定した全発光量は増加する。リン酸塩濃度が高いとピーク強度 はかなり下がり、長時間にわたって強度の積分すると、全発光量の増加が顕著で ある。

図７及び８のデータは、０．８ｍＭ　ＣｏＡ、１．４ｄルシフエリン、　１．５ ｄ　＾ＴＰ、８ｍＭ　Ｍｇ”、　０．１３ａＭ　ＥＤＴＡ、　５．５ｍＭ　ＤＴ Ｔ、　２０１ＩＭトリシン、さらに （１）　ｆｌ！Ｉの化合物なしまたは （２）１１０　ｍＭ　２−アミノエタノールまたは（３）１１０ｍＭエタノール または （４）１１０ａＭエタノールと３０ｔｇＨ、７５Ｊ若しくは５０ｇＭリン酸ナト リウム を含む溶液（ｐｆ１７．８）１００μｌをＩＩ液（２０１１Ｍトリシン、８５Ｍ Ｍ　ｇ−２、Ｏ，１３ｉ＋Ｎ　ＥＤＴＡ：ｐＨ７，ＦＩ）２００μｌとＭｉ１Ｍ 質抽出物２０Ｊｉ１とを混合して製造した溶液２２０μｌに注入し、漂準ルミノ メータ−を使用して発光を測定した以外には、細胞質抽出物中のルシフェラーゼ に関する慣用の、従来アッセイと本発明のアッセイを比較する実施例１に記載の 方法を使用して得た０図７及び８に記載の如＜　、３６ｍＭエタノールはＣｏＡ の存在下のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応での発光の生起には効果がない。

え１匠主 この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反 応に於いて、 （１）ルシフェリンのカルボキシルとＣｏＡのチオール基の硫黄との間に、ルシ フェリンーＣＯ＾、即ちチオエステルが形成する、及び （２）ＣｏＡと励起状態の酸化ルシフェリンとルシフェラーゼの結合体も形成す る ということが確認できる。

甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列と他の蛋白質のアミノ酸配列とを比較すると これらは殆ど相同であり、従って植物酵素、４−クマレー）：Ｃｏ＾リガーゼ及 び酵素長鎖アシル−Ｃｏ＾シンセターゼと共通の祖先であることが明らかになっ た。他の２種類の酵素とルシフェラーゼを比較するＨｙｄｒｏ−ｐａｔｈｙプロ ット［Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉＬｔｌｅ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５７，１０ ５−１３２（１９８２）　、各点毎の１５残基値の平均］では、４−クマレート ：Ｃｏ＾リガーゼとの類似は特に原著であるという類似点を示す、４−クマレー ト：ＣＯ＾リガーゼ及び長原アシルーＣｏＡ−シンセターゼの両方は、ＣｏＡと その個々の置換体のカルボキシル基との間のチオエステル形成を触媒する０両方 の酵素に関して、＾ＴＰは基質と反応してチオエステルの形成中にアシル−ＡＭ Ｐ中間体を形成する。上記記載の如く、ルシフェラーゼも同様に、＾ＴＰとルシ フェリンからルシフエリルアデニレートを形成する。

１９５０年代の研究では、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に於ける光生 起速度でのＣｏＡの作用に関して、酸化できないルシフェリン類似物、即ちデし ドロルシフェリンはＣｏＡとそのカルボキシル基を介してチオエステル結合を形 成し得たことが示されている。

甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に於ける光生起速度に影響するＣｏＡの 活性は、特にそのチオール基によって仲介されることが知見された。デチオＣｏ ＾は、硫黄原子の無いＣｏＡと同一である。　ＣｏＡでなくデチオＣＯ＾をルシ フェラーゼ−ルシフェリン反応混合物に添加すると、反応由来の光生起速度には 全く影響がない、さらにこのようにＣｏＡにより生じた反応での光生起量の増加 は、デチオＣｏ＾により特異的に阻害される。一定濃度でデチオＣｏ＾が存在す る場合及び存在しない場合のＣｏ＾濃度の逆数の関数として光生起に於ける増加 の逆数の逆数プロットに於いて、デチオＣｏ＾はＣｏＡの蒙合インヒビターとし て活性を示した。従って、デチオＣｏ＾及びＣｏＡはルシフェラーゼの同一部位 に結合するが、チオール基を欠失しているデチオＣｏ＾はＣｏＡ様の活性を持た ない。

逆数プロットをめるための実験に於いて、発光アッセイ用の緩衝液は３０ｍＭ　 トリシン、８ｍＭ炭酸マグネシウム、１０ｍＭ　０７丁、０．２ｍＮ　ＥＤＴＡ （ｐＨ７，８）Ｔあった。　（１０ｇ硫酸アンモニウム及び５０！グリセロール 中）結晶質Ｐ、ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ１ｏｚｇ７ｘｉを、１０ｇ（ｖ／ ｖ）グリセロール及びＩＨ／ｚｌウシ胎児血清アルブミンを補った緩衝液で１０ ，０００倍に希釈した。

次いで、アッセイ用に、１０μ！酵素希釈液（ＩＩ素１μｉ／ｍｌ）を２００μ ！緩衝液と混合し、３ｍＭルシフェリン、１．５＋＊Ｍ＾ＴＰ及び種々の濃度の ＣｏＡ及びデチオＣｏ＾（３ＩＩＩＭデチオＣｏ＾：０．０１２ｍＭ。

０．０８ｓ＋Ｎ及び０．３ａＭ　ＣｏＡ：デチオＣｏ＾なし：０．０１２ｍＭ、 ０．０６５Ｍ、０．３−ＭＣｏ＾及び１．０＋ｅＭ　ＣｏＡ）を補った緩衝液１ ００μｌを得られた２１０μｌに注入すると発光が開始する＊　Ｔｕｒｎｅｒモ デル２０ルミノメータ−で発光を測定した。

甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により光が生起する溶液中にＣｏＡが存 在すると、生起した光の色を短波長にシフトすることが知見された。この光の色 は、励起状態の酵素が結合した酸化ルシフェリンと、基底状態の酵素が結合した 酸化ルシフェリンとの間のエネルギーの差により決定される。短波長へのシフト は、概して酸化ルシフェリンとルシフェラーゼの結合体中、エネルギーの差がＣ ｏＡにより増加されることを意味する。エネルギーがこのように増加するには、 酵素と励起状態の酸化ルシフェリン及びＣｏＡの結合体が存在しなければならず 、これによりＣｏＡが存在しない場合の増加に対し、励起状態のオキジルシフェ リンと酵素の結合体のフラクション中でエネルギーが増加し、励起状態と基底状 態のオキジルシフェリンとの間のエネルギー差がより高くなる。このような結合 体中でのＣｏＡの作用がルシフェラーゼ−オキジルシフェリン結合体の構造を変 えることは、異なるアミノ酸配列のルシフェラーゼ及びそれゆえ少なくともやや 異なる三次元構造（例えば、甲虫の異種由来）が、種々の色の生物発光の生起を 触媒する上記記載の観察と一致している。

ＣｏＡが甲虫のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応中に生起した光の波長を減少 させるということは、Ｐ−９Ｆｒａｌｉｓルシフエラーゼに関する以下の実験で 発見された。これらの比較に於いて、第１の溶液を０．８−Ｍ　ＣｏＡ、１．４ ｍＮルシフェリン、１．５ｍＭ＾ＴＰ及び９０ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液２５０μ ｍと、ｐ、ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（１０１［酸アンモニウム、５０＄グ リセロ一ル中１０Ｍｇ／蔗ｌ）の溶液０．５μｌと５００μｍ緩衝液（２０請Ｈ トリシン、８−ＭＭｇ″２．０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ：ｐＨ７，８）を混合する ことにより作成した溶液とを混合することにより製造した。第２の溶液を、Ｃｏ ＡもＤＴＴも使用しない以外には同様にして製造した。第１及び第２の溶液を、 ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応からの光が生成したら目視で観察した。第１ の溶液はいくらかだがはっきりと、第２の溶液よりも緑がかっていた。

本発明の範囲から逸脱することなく本発明を以下説明及び例示するが、当業者に は、変化、付加及び省略を含む種々の変形が考えられ得よう、従って、これらの 変形は本発明に包含され、本発明の範囲は付記請求項によってのみ限定され得る 。

時間　（ｙ） １０２（モルルシ７エラーε°） Ｔｕｒｎｅｒ　Ｅｌ＋　像 タヒ、調１　イカ− メジ　≠　イカ一 Φ Ｔｕｒｎｅｒ　Ｌ＊　ｆＬ Φ Ｔｕｒｎｅｒ　灼’ｌｔ＞ Ｔｕｒｎｅｒ　を挙廖 Ｔｕｒｎｅｒ　弥’ｌｌｋ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ルシフェラーゼを含むと思われるサンプル中で甲虫ルシフェラーゼの存在を 検出するための方法であって、（ａ）前記サンアルのアリコートを用い、ルシフ ェラーゼ−ルシフェリン反応中でルシフェラーゼの活性に有効な濃度で、ルシフ ェリン、アデノシン三リン酸、チオール試薬及びＭｇ＋２を含む溶液を作成し、 次いで（ｂ）段階（ａ）から得られた溶液からの発光を測定することを含む該方 法。 ２．段階（ａ）で作成した溶液中のチオール試薬が、ＣｏＡ、ジチオトレイトー ル、ジチオエリトリトール、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトプロパ ノール、３−メルカプトプロパノール、２．３−ジチオアロパノール及びグルク チオンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．溶液がＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬を含むことを特徴とする請求項 ２に記載の方法。 ４．溶液がさらに蛋白質性のルシフェラーゼ−活性エンハンサーを含むことを特 徴とする請求項３に記載の方法。 ５．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであることを特徴とする請 求項３に記載の方法。 ６．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであり、ルシフェラーゼ− 活性エンハンサーがウシ胎児血清アルブミンであることを特徴とする請求項４に 記載の方法。 ７．溶液中のＣｏＡ濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭであり、ジチオトレイトール濃 度が５ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項５に記載の方法。 ８．溶液中のＣｏＡ濃度が０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、ジチオトレイトール 濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭであり、及びウシ胎児血清アルブミン濃度が１０μｇ ／ｍｅ〜５ｍｇ／ｍｅであることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ９．溶液中のＡＴＰ濃度が０．ｍＭｈ〜１ｍＭであり、ルシフェリン濃度が０． １ｍＭ〜１ｍＭんであり、及びＭｇ＋２濃度が２ｍＭ〜１５ｍＭであることを特 徴とする請求項７に記載の方法。 １０．溶液中のＡＴＰ濃度が０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、ルシフェリン濃度が０ ．１ｍＭ〜１ｍＭであり、及びＭｇ＋２濃度が２ｍＭ〜１５ｍＭであることを特 徴とする請求項８に記載の方法。 １１．甲虫ルシフェラーゼがＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼであることを特 徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 １２．前記化合物を含むと思われるサンプル中のアデノシン三リン酸の存在を検 出するための方法であって、（ａ）前記サンプルのアリコートを用い、ルシフェ ラーゼールシフェリン反応でのルシフェラーゼの活性に有効な濃度で、甲虫ルシ フェラーゼ、ルシフェリン、チオール試薬及びＭｇ＋２を含む溶液を作成し、次 いで（ｂ）段階（ａ）から得られた溶液からの蛍光を測定することを含む該方法 。 １３．段階（ａ）で作成した溶液に於けるチオール試薬が、ＣｏＡ、ジチオトレ イトール、ジチオエリトリトール、β−メルカプトエタノール、２−メルカプト プロパノール、３−メルカアトブロパノール、２，３−ジチオプロパノール及び グルタチオンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方 法。 １４．溶液がＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬を合むことを特徴とする請求 項１３に記載の方法。 １５．溶液がさらに、蛋白質性のルシフェラーゼ−活性エンハンサーを含むこと を特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであることを特徴とする 請求項１４に記載の方法。 １７．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであり、ルシフェラーゼ −活性エンハンサーがウシ胎児血清アルブミンであることを特徴とする請求項１ ５に記載の方法。 １８．溶液中のＣｏＡ濃度が０．ｍＭ〜１．０ｍＭであり、ジチオトレイトール 濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 １９．溶液中のＣｏＡ濃度が０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、ジチオトレイトー ル濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭであり、ウシ胎児血清アルブミン濃度が１０μｇ／ ｍｅ〜５ｍｇ／ｍｅであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 ２０．溶液中のルシフェリン濃度が０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、Ｍｇ＋２濃度が ２ｍＭ〜１５ｍＭであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２１．溶液中のルシフェリン濃度が０．ｍＭ〜１ｍＭであり、Ｍ８＋２濃度が２ ｍＭ〜１５ｍであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２２．甲虫ルシフェラーゼがＰ．ρｙｒａｌｉｓルシフェラーゼであることを特 徴とする請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。 ２３．ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る甲虫ルシフェラーゼ、Ｃ ｏＡ及びＣｏハ以外のチオール試薬を含むことを特徴とする組成物。 ２４．ＣｏＡ濃度が０．ｍＭ〜１．ｍＭであり、ＣｏＡ以外のチオール試薬濃度 が５ｍＭ〜２００ｍＭであり、水溶液であることを特徴とする請求項２３に記載 の組成物。 ２５．ＣｏＡ以外のチオール試薬が濃度５ｍＭ〜１００ｍＭのジチオトレイトー ルであることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。 ２６．さらにウシ胎児血清アルブミンを濃度１０μｇ／ｍｅ〜５ｍｇ／ｍｅで含 むことを特徴とする請求項２５に記載の組成物。 ２７．さらに２−アミノエタノールを濃度５ｍＭ〜５０ｍＭで、またはリン酸イ オンを濃度１０ｍＭ〜６０ｍＭで含むことを特徴とする請求項２６に記載の組成 物。 ２８．甲虫ルシフェラーゼがＰ．ｙｒａｌｉｓルシフェラーゼであることを特徴 とする請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物。 ２９．さらに、（１）濃度２ｍＭ〜１５ｍＭのマグネシウムイオンと （２）濃度０．１ｍＭ〜１．ｍＭのアデノシン三リン酸及び濃度０．１ｍＭ〜１ ．ｍＭのルシフェリンのいずれかまたは両方を含むことを特徴とする請求項２８ に記載の組成物。 ３０．ＣｏＡ、甲虫中で天然に存在するルシフェラーゼ及びルシフェラーゼ−ル シフェリン反応中の励起状態のオキシルシフェリンの結合体であって、細胞外で 存在する該結合体。 ３１．甲虫ルシフェラーゼがＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼであることを特 徴とする請求項３０の錯体。 ３２．ルシフェラーゼが天然に存在する細胞外でのルシフェリル−ＣｏＡ。 ３３．チオール試薬、アデノシン三リン酸、ルシフェリン及びマグネシウムイオ ンを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物からなる、このようなルシフ ェラーゼを含むと思われるサンアル中に甲虫ルシフェラーゼの存在をアッセイす るための試験キット。 ３４．ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物が、ＣｏＡ０．ｍＭ〜１ｍＭ、 ＣｏＡ以外のチオール試薬５ｍＭ〜１００ｍＭ、アデノシン三リン酸０．１０ｍ Ｍ〜１．ｍＭ、ルシフェリン０．ｍＭ〜１．ｍＭ及びマグネシウムイオン２ｍＭ 〜１５ｍＭをむ水溶液であることを特徴とする請求項３３に記載の試験キット。 ３５．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであり、溶液中に濃度５ ｍＭ〜１００ｍＭで存在することを特徴とする請求項３４に記載の試験キット。 ３６．甲虫ルシフェラーゼを含むと考えられる培養した哺乳類細胞サンプル中の 甲虫ルシフェラーゼの存在をアッセイするための請求項３３に記載の試験キット であって、さらにルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物と別個に、ルシフェ ラーゼ−ルシフェリン反応でルシフェラーゼが活性であるｐＨ及びイオン強度の 水溶液である前記細胞を溶解するための組成物を含み、且つ濃度０．１％〜１０ ％（ｍ／ｍ）の非イオン洗剤、濃度０．１ｍＭ／ｍｅ〜ｍＭ／ｍｅの蛋白質性ル シフェラーゼー活性エンハンサー、濃度１ｍＭ〜１０ｍＭのＣｏＡ以外のチオー ル試薬及び濃度１％〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールまたはエチレングリコー ルよりなる組成物を含むことを特徴とする該試験キット。 ３７．甲虫ルシフェラーゼを合むと考えられる培養した哺乳類細胞サンプル中に 甲虫ルシフェラーゼの存在をアッセイするための請求項３４に記載の試験キット であって、さらにルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物と別個に、ルシフェ ラーゼ−ルシフェリン反応でルシフェラーゼが活性であるｐＨ及びイオン強度の 水溶液である前記細胞を溶解するための組成物を含み、且つ１分子当たりエチレ ニルオキシ単位を平均９〜１０個有するオクトキシノール混合物である非イオン 洗剤０．１％〜１０％（ｖ／ｖ）、濃度０．１ｍｇ／ｍｅ１〜５ｍｇ／ｍｅのウ シ胎児血清アルブミン、濃度１．ｍＭ〜１０ｍＭのジチオトレイトール及び濃度 １％〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールまたはエチレングリコールよりなる組成 物を含むことを特徴とする該試験キット。 ３８．甲虫ルシフェラーゼを含むと考えられる培養した哺乳類細胞サンアル中に 甲虫ルシフェラーゼの存在をアッセイするための請求項３５に記載の試験キット であって、さらにルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物と別個に、ルシフェ ラーゼ−ルシフェリン反応でルシフェラーゼが活性であるｐＨ及びイオン強度の 水溶液である前記細胞を溶解するための組成物を含み、且つ１分子当たりエチレ ニルオキシ電位を平均９〜１０個有するオクトキシノール混合物である非イオン 洗剤０．１％〜１０％（ｖ／ｖ）、濃度０．１ｍｇ／ｍｅ〜５ｍｅ／ｍｅのウシ 胎児血清アルブミン、濃度１．ｍＭ〜１０ｍＭのジチオトレイトール及び濃度１ ％〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールまたはエチレングリコールよりなる組成物 を合むことを特徴とする該試験キット。 ３９．キットの被分析物質である甲虫ルシフェラーゼがＰｐｙｒａｌｉｓルシフ ェラーゼであることを特徴とする請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の試験 キット。 ４０．キットが甲虫ルシフェラーゼ、チオール試薬、ルシフェリン及びマグネシ ウムイオンからなる組成物を合むことを特徴とする、アデノシン三リン酸を含む と考えられるサンプル中のアデノシン三りン酸の存在をアッセイするための試験 キット。 ４１．組成物が、ＣｏＡ０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ、ＣｏＡ以外のチオール試薬５ ｍＭ〜２００ｍＭ及びマグネシウムイオン２ｍＭ〜１５ｍＭを含む水溶液である ことを特徴とする請求項４０に記載の試験キト。 ４２．ＣｏＡ以外のチオール試薬がジチオトレイトールであり、溶液中に濃度５ ｍＭ〜１００ｍＭで存在すろことを特徴とする請求項４１に記載の試製キット。 ４３．甲虫ルシフェラーゼがＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼであることを特 徴とする請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の試験キット。