KR20200082077A - 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법 - Google Patents

세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200082077A
KR20200082077A KR1020180172276A KR20180172276A KR20200082077A KR 20200082077 A KR20200082077 A KR 20200082077A KR 1020180172276 A KR1020180172276 A KR 1020180172276A KR 20180172276 A KR20180172276 A KR 20180172276A KR 20200082077 A KR20200082077 A KR 20200082077A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
atp
cells
seconds
measuring
Prior art date
Application number
KR1020180172276A
Other languages
English (en)
Inventor
김대운
강대일
Original Assignee
대한민국(국가기록원)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(국가기록원) filed Critical 대한민국(국가기록원)
Priority to KR1020180172276A priority Critical patent/KR20200082077A/ko
Publication of KR20200082077A publication Critical patent/KR20200082077A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 내 ATP 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 뿐만아니라 진균 등의 다른 미생물 세포에 대해서도 재현성 및 신뢰성 있는 데이터를 쉽고 빠르게 수득 가능한 본 발명 특유의 세포 내 ATP 검출 시약과, 이를 이용한 미생물 수준 측정 방법, 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물에 대한 오염도를 측정하는 방법에 대한 것이다.

Description

세포 내 ATP 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법{Composition for detecting ATP in cells, and method for measuring microbial contamination degree of cultural property or documentary using the same}
본 발명은 세포 내 ATP 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 뿐만아니라 진균 등의 다른 미생물 세포에 대해서도 쉽고 빠르게 재현성 및 신뢰성 있는 데이터를 수득 가능한 본 발명 특유의 세포 내 ATP 검출 시약과, 이를 이용한 미생물 수준 측정 방법, 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물에 대한 오염도를 측정하는 방법에 대한 것이다.
우리나라의 지정문화재 중 유기질 문화재가 국보의 28.5 %, 보물의 44.1 %로 매우 높은 비율을 차지하고 있어 해충이나 미생물 등 생물적 손상에 따른 보존관리의 필요성이 매우 중요하게 부각되고 있다. 금속, 석재, 토기와 같은 무기질 문화재에 비해 섬유, 종이, 목재 등으로 이루어진 유기질 문화재는 그 재질의 특성상 미생물, 곤충과 같은 생물적 요인에 의한 피해가 야기되기 쉽다. 미생물 및 곤충과 같은 생물 열화원에 의한 유기질 문화재의 피해는 문화재 외관을 오염시키거나 글씨, 무늬 장식 등에 손상을 주어 미적 가치를 하락시킬 뿐만 아니라 재질손상으로 인한 구조적 관점에서도 심각한 문제를 야기한다. 특히 종이 기록물은 그 재질의 특성상 보관 상태 및 조건에 따라 다양한 손상유형이 발생하며, 이 중 미생물에 의한 열화현상은 재질의 분해, 착색 등의 결과로 나타난다. 종이 기록물에서 발생되는 미생물에 의한 손상은 크게 세균류(Bacteria)와 진균류(Fungi)에 의한 원인으로 구분할 수 있다. 따라서 문화재 및 여러 가지 기록물들의 보존 관리에 있어서, 사전에 어떤 종류의 손상 위험이 존재하는지 및 그 위험 수준이 어느 정도인지를 파악하여 빠른 조치를 취하는 것이 중요하다.
기록물 재질 표면에 존재하는 미생물을 측정할 수 있는 생물학적 방법으로는 표면부착미생물을 직접 포집하여 배양하는 평판배양법과 세포 내에 존재하는 ATP(Adenosine triphosphate)의 양으로 미생물의 수를 파악하는 생물 발광 반응(ATP bioluminescence)법을 들 수 있다. 평판배양법의 경우(특허문헌 1) 미생물 포집 후 24-48시간이 소요될 뿐 아니라 생물학적 배양기술을 가진 전문 인력만이 수행할 수 있다는 한계점이 존재한다. 그에 반해 ATP 생물 발광 반응법은 측정시간이 수 초정도로 짧고 현장에서 누구나 쉽게 측정할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이에 따라 최근에는 미생물 세포 내 존재하는 ATP를 측정하는 방법론을 사용하는 추세이다. ATP의 양은 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 현재 통상적으로 사용되어 오고 있는 ATP 생물발광반응법은 1단계 미생물포집, 2단계 세포용해, 3단계 용출된 ATP와 시약과의 발광반응, 4단계 발광량 측정의 단계로 진행된다. 이에 따라 현재 시중에 판매되고 있는 ATP 생물발광반응 전용시약은 미생물의 세포벽을 용해시키는 시약과 세포용해 이후 세포외부로 용출된 ATP와 반응하는 루시페린, Luciferase 등으로 구성되어 있다. 또한 측정기기인 루미노미터는 전용시약과 반응한 발광량을 측정할 수 있는 센서로 구성되어 있다.
종이 기록물에 존재하는 미생물은 각 기록물마다 종류가 매우 다양하고 생물량이 상이하다. 현재 통상적으로 사용되는 ATP 생물발광반응 전용시약은 세균류 생물량 측정에 대해서는 비교적 재현성이 높고 정확하며 일관적인 측정 결과를 제시할 수 있으나, 세균류에 의한 기록물 오염보다 진균류에 의한 기록물 오염이 심각한 경우에는 현재 시중에 판매되고 있는 ATP 반응시약은 매우 부정확한 결과를 나타낸다. 기존 시약은 진균류의 종류 및 생물량에 따라 반응시간이 매우 상이하고, 시판되는 시약의 종류에 따라 다소 차이는 있으나 세포용해에 20분 이상의 반응시간이 소요될 경우 ATP 반응시약에 존재하는 발광물질인 Luciferase의 활성이 급격히 감소되어 측정결과에 신뢰도가 매우 낮아진다.
이에 세균 뿐만아니라 진균류 등의 다른 미생물에 대해서도 정확한 생물량을 측정할 수 있는 시약이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 10-1808912
이에 본 발명자들은 세균 뿐만아니라 진균류 등의 다른 미생물 세포에 대해서도 정확한 생물량을 측정할 수 있는 방법을 고안하여, 본원 발명의 ATP 발광반응 시약을 제조하고, 상기 본 발명의 시약을 이용하면 세균뿐만 아니라 진균 등에 대해서도 재현성 있고 신뢰성 있는 데이터를 수득 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 루시퍼레이스(luciferase), 하기 (b) 기질 조성물 및 하기 (c) 버퍼 조성물을 포함하는 세포 내 ATP 검출용 조성물을 제공하는 것이다:
상기 (b) 기질 조성물은
젤라틴 가수분해물(Gelatin hydrolyzates);
CDTA 모노하이드레이트 (Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate);
시트릭 애시드(Citric Acid);
루시페린 포타슘 염(Luciferin potassium salt);
소듐 시트레이트(Sodium Citrate);
마그네슘 설페이트(magnesium sulfate);
HEPES 소듐 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt); 및
키티네이스(Chitinase)를 포함하며,
상기 (c) 버퍼 조성물은
물(water);
6-((4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)메틸)니코티닉 애시드 (6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid);
폴리에틸렌 글라이콜 tert-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether);
디소듐 디하이드로젠 EDTA(Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate);
마그네슘 클로라이드(Magnesium Chloride); 및
클로헥시딘 디아세테이트(Chlorhexidine Diacetate)를 포함함.
본 발명의 다른 목적은,
(I) 상기 본 발명의 조성물을 세포에 처리하는 단계; 및
(II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
를 포함하는 세포 내 ATP 수준 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은,
(I) 상기 본 발명의 조성물을 미생물 세포에 처리하는 단계; 및
(II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
를 포함하는 미생물 수준 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
(i) 문화재 또는 기록물로부터 시료를 채취하는 단계;
(ii) 상기 시료를 상기 본 발명의 조성물과 혼합하는 단계; 및
(iii) 발광 수준(level)을 측정하는 단계
를 포함하는, 문화재 또는 기록물의 미생물에 대한 오염도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
기존에 시판되고 있는 ATP 생물발광반응 전용시약들이 세균(bacteria)에 대해서는 비교적 재현성이 높고 정확하며 일관적인 측정 결과를 제시할 수 있으나, 진균(Fungus)에 대해서는 부정확한 측정이 이루어지는 문제점이 있었다(비교예 1 참조). 특히 기존 시약은 진균류의 종류 및 생물량에 따라 반응시간이 매우 상이하고, 시판되는 시약의 종류에 따라 다소 차이는 있으나 세포용해에 20분 이상의 반응시간이 소요될 경우 ATP 반응시약에 존재하는 발광물질인 Luciferase의 활성이 급격히 감소되어 측정결과에 신뢰도가 매우 낮아지기 때문에 30분 이내에 진균에서도 빠르고 정확한 반응이 일어나는 것이 중요하다.
이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하여, 세균 뿐만아니라 진균 등의 다른 미생물에 대해서도 재현성 및 신뢰성 있는 데이터를 수득 가능한 본 발명 특유의 미생물 내 ATP 검출 시약을 제조하였다.
이에 본 발명은 (a) 루시퍼레이스(luciferase), 하기 (b) 기질 조성물 및 하기 (c) 버퍼 조성물을 포함하는(또는 필수적으로 구성되는) 세포 내 ATP 검출용 조성물을 제공한다:
상기 (b) 기질 조성물은
젤라틴 가수분해물(Gelatin hydrolyzates);
CDTA 모노하이드레이트 (Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate);
시트릭 애시드(Citric Acid);
루시페린 포타슘 염(Luciferin potassium salt);
소듐 시트레이트(Sodium Citrate);
마그네슘 설페이트(magnesium sulfate);
HEPES 소듐 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt); 및
키티네이스(Chitinase)를 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되며),
상기 (c) 버퍼 조성물은
물(water);
6-((4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)메틸)니코티닉 애시드 (6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid);
폴리에틸렌 글라이콜 tert-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether);
디소듐 디하이드로젠 EDTA(Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate);
마그네슘 클로라이드(Magnesium Chloride); 및
클로헥시딘 디아세테이트(Chlorhexidine Diacetate)를 포함함(또는 이들로 필수적으로 구성됨).
상기 본 발명의 조성물 중, 루시퍼레이스는 ATP와 루시페린 사이의 반응을 촉매하여 빛을 생성시키는 효소로서, 이때 생성되는 빛의 세기는 ATP 양에 직접적으로 비례한다. 본 발명에서 루시퍼레이스는 당업계에 알려진 것이라면 이의 구체적 생물 출처 및 구체적 아미노산 서열이 제한되지 않는다. 일례로 반딧불이(firefly) 루시퍼레이스 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 루시퍼레이스는 천연형 그대로의 것을 단리된(정제된) 상태로 사용하는 것일 수 있으며, 또는 천연형 루시퍼레이스에 대하여 유리한 성질(예를들어, 구조적 안정성 또는 열안정성 등)을 부과하기 위한 당업계에 알려진 임의의 아미노산 서열 변형이 포함된 형태로 사용되는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시 양태(embodiment)에서, 열안정성이 높은 종류의 루시퍼레이스를 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 상기 성질을 만족하는 한 이의 구체적 생물 출처 및 구체적 아미노산 서열에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 루시페린(이의 염을 모두 포함한다)은 D-루시페린, L-루시페린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 바람직한 하나의 실시 양태에서, 본 발명의 조성물에는 D-루시페린이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물 중 키티네이스(chitinase)는 바람직하게, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)유래의 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 조성물 중 키티네이스는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 ‘폴리(1,4-β-[2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코사이드])글라이카노하드롤레이스 (Poly(1,4-β-[2-acetamido-2-deoxy-D-glucoside]) glycanohydrolase, EC 3.2.1.14)’일 수 있다.
본 발명의 조성물 중 (c) 버퍼 조성물에는 임의의 탈포제(Defoamer)가 포함될 수 있다. 상기 탈포제는 거품에 기인하는 샘플의 손실 등 거품에 의해 발생할수 있는 실험오차를 줄이기 위하여 포함될 수 있다. 탈포제로서는, 당업계에 공지된 것이라면 당업자가 적절히 그 종류를 선택하여 사용가능하며, 예를들어 이에 제한되지 않으나 상품명 MAZU (등록상표) (PPG Industries, Gurnee, IL) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게 탈포제의 선택은, 루시퍼레이스-루시페린 반응에 영향을 주지 않는 종류의 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게 본 발명은, (a) 루시퍼레이스(luciferase), 하기 (b) 기질 조성물 및 하기 (c) 버퍼 조성물을 포함하는(또는 필수적으로 구성되는) 세포 내 ATP 검출용 조성물을 제공한다:
(b) 기질 조성물은
젤라틴 가수분해물(Gelatin hydrolyzates);
CDTA 모노하이드레이트 (Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate);
시트릭 애시드(Citric Acid);
루시페린 포타슘 염(Luciferin potassium salt);
소듐 시트레이트(Sodium Citrate);
마그네슘 설페이트(magnesium sulfate);
HEPES 소듐 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt);
키티네이스(Chitinase); 및
선택적으로 물
로 구성되며(또는 필수적으로 구성되며),
상기 (c) 버퍼 조성물은
물(water);
6-((4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)메틸)니코티닉 애시드 (6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid);
폴리에틸렌 글라이콜 tert-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether);
디소듐 디하이드로젠 EDTA(Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate);
마그네슘 클로라이드(Magnesium Chloride);
클로헥시딘 디아세테이트(Chlorhexidine Diacetate); 및
선택적으로 탈포제(Defoamer)
로 구성됨(필수적으로 구성됨).
하나의 바람직한 실시 양태(embodiment)에서, 상기 본 발명의 세포 내 ATP 검출용 조성물에 포함되는 (b) 기질 조성물은 구체적으로 다음과 같은 함량(비)으로 이루어지는 것일 수 있다:
젤라틴 가수분해물(Gelatin hydrolyzates) 100 중량부에 대하여,
CDTA 모노하이드레이트 (Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate) 10 내지 20 중량부,
시트릭 애시드(Citric Acid) 0.1 내지 5.0 중량부,
루시페린 포타슘 염(Luciferin potassium salt) 40 내지 50 중량부,
소듐 시트레이트(Sodium Citrate) 20 내지 30 중량부,
마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 2 내지 10 중량부,
HEPES 소듐 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt) 0.1 내지 4.0 중량부,
키티네이스(Chitinase) 10 내지 20 중량부, 및
선택적으로 물(water) 0.1 내지 4.0 중량부.
하나의 바람직한 실시 양태(embodiment)에서, 상기 본 발명의 세포 내 ATP 검출용 조성물에 포함되는 (c) 버퍼 조성물은 구체적으로 다음과 같은 함량(비)으로 이루어지는 것일 수 있다:
물(water) 100 중량부에 대하여,
6-((4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)메틸)니코티닉 애시드 (6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid) 2 내지 10 중량부,
폴리에틸렌 글라이콜 tert-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) 0.1 내지 4.0 중량부,
디소듐 디하이드로젠 EDTA(Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate) 0.1 내지 2.0 중량부,
마그네슘 클로라이드(Magnesium Chloride) 0.1 내지 2.0 중량부,
클로헥시딘 디아세테이트(Chlorhexidine Diacetate) 0.1 내지 2.0 중량부, 및
선택적으로 탈포제(Defoamer) 0.1 내지 2.0 중량부.
본 발명에서 용어 ‘중량부’는, 성분 간 중량 비율(즉, 중량의 상대적 비율)을 의미한다.
본 발명에서 상기 (c) 버퍼 조성물은 pH6.0 내지 pH 8.0 범위로 조성되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 pH7.0±0.5로 조성되는 것일 수 있다. 이에, 상기 (c) 버퍼 조성물은 임의의 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다.
본원 발명의 세포 내 ATP 검출용 조성물에 있어서, 상기 (a) 루시퍼레이스(luciferase), (b) 기질 조성물 및 (c) 버퍼 조성물은 세포 시료에 대하여 동시에 또는 순차적으로 제공되는 것일 수 있다.
바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (a) 루시퍼레이스(luciferase), (b) 기질 조성물 및 (c) 버퍼 조성물은 하나의 용액으로서 혼합된 후, 세포 시료에 처리(즉, 세포와 접촉) 되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 상기 키트에서 본 발명의 ATP 검출용 조성물은 별도의 용기에 담아 제공될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 키트는 각각의 성분이 개별 포장된 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 각각의 성분이 본 발명에 따라 각각 적절한 비율로 혼합된 후, 각 혼합물의 기능별로 임의로 나누어져 포장된 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 본 발명 조성물의 모든 성분이 하나로 혼합된 단일 조성물로서 제공될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 키트는 세포 시료 채취부와 본원 발명의 ATP 검출용 조성물이 담지되어있는 별도의 반응부를 포함하는 기구(또는 용기)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료 채취부는 면봉 형(swab type)으로 된 것일 수 있으며, 이러한 형태의 기구에 대해서는 당업계에 상용화되어 잘 알려져있다. 추가적으로 이러한 형태의 기구는 예를들어 EP2870257B1 등을 바탕으로 이해될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군.
또한 본원 발명은,
(I) 상기 본원 발명 조성물(세포 내 ATP 검출용 조성물)을 세포에 처리하는 단계; 및
(II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
를 포함하는 세포내 ATP 수준 측정 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서 상기 (I) 단계 이전에‘세포 시료를 수득하는 단계’를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어‘시료’는, 바람직하게 세포를 포함하는 시료이다. 하나의 실시 양태에서, 상기 세포는 살아있는(live) 상태인 것으로서, ATP를 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포를 모두 포함하는 의미이다. 하나의 실시 양태에서, 상기 세포는 미생물일 수 있다.
상기 시료의 수득은, 세포 종류에 따라 당업계에 공지된 채취 방법을 자유롭게 선택하여 사용함으로써 수행되는 것일 수 있다. 또한 상기 시료의 수득은 임의의 증식배지에서 배양된 세포들을 이용하는 것도 포함하는 의미이다.
하나의 실시 양태에서, 세포의 존재가 의심되는 표면을 면봉(swab)을 이용하여 문지르거나, 또는 닦아내는 방법으로 세포(특히, 미생물) 시료를 채취할 수 있다.
상기 용어‘처리’는 세포(시료)와 본원 발명의‘접촉’을 포함하는 의미로, 이에 따라 일련의 반응들이 개시된다. 따라서 상기 처리는 본원 발명의 조성물과 세포를 반응시키는 것을 포함하는 의미이다. 상기 반응은, 주요하게 세포벽의 용해, 루시퍼레이스가 관여하는 ATP 및 루시페린 간의 발광반응 등을 포함하며, 이외에도 시약성분에 의해 세포 내 성분들의 변화를 모두 포함하는 의미이다.
하나의 실시 양태에서, 상기‘처리’는 시약 성분에 사용된 효소들의 활성 온도에서 수행되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 20℃ 내지 38℃ 의 온도에서 수행되는 것일 수 있다.
하나의 실시 양태에서 상기‘처리’는 상온에서 수행되는 되는 것일 수 있다.
상기 발광 수준의 측정은, 당업계에 바이오루미네센스(bioluminescence), 특히 루시퍼레이스-루시페린 발광 반응의 측정에 사용되는 것으로 알려진 것이라면 그 방법 및 도구(tool)의 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로 발광 반응 측정 도구로서 루미노미터(luminometer) 또는 CCD 카메라 등을 사용할 수 있으며, 당업자가 필요에 따라 그 측정 도구를 적의 선택하여 사용할 수 있다. 일례로 GloMax® 96 Microplate Luminometer를 사용하는 경우 여러 개의 시료에 대하여 동시에 발광분석이 가능하다. 또 다른 일례로 3M™ Clean-Trace NG Luminometer LM1는 휴대할 수 있는 기기로서 실험실 이외의 환경에서도 발광반응 측정이 가능하다.
상기 측정은 일정 시점에서 단회 또는 다회 수행될 수 있고, 또는 연속적으로 측정되는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 측정은 정성적 측정 및 정량적 측정을 모두 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 상기 발광 수준의 측정은 백그라운드 수준과 비교적으로 수행될 수도 있다.
하나의 실시 양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 2시간 이내에 수행되는 것일 수 있다.
하나의 실시 양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 1시간 이내에 수행되는 것일 수 있다.
바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 30분 이내에 수행되는 것일 수 있다.
바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 20분 이내에 수행되는 것일 수 있다.
바람직한 하나의 실시 양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물을 처리하고, 1초 후, 2초 후, 3초 후, 4초 후, 5초 후, 6초 후, 7초 후, 8초 후, 9초 후, 10초 후, 11초 후, 12초 후, 13초 후, 14초 후, 15초 후, 16초 후, 17초 후, 18초 후, 19초 후, 20초 후, 21초 후, 22초 후, 23초 후, 24초 후, 25초 후, 26초 후, 27초 후, 28초 후, 29초 후, 30초 후, 31초 후, 32초 후, 33초 후, 34초 후, 35초 후, 36초 후, 37초 후, 38초 후, 39초 후, 40초 후, 41초 후, 42초 후, 43초 후, 44초 후, 45초 후, 46초 후, 47초 후, 48초 후, 49초 후, 50초 후, 51초 후, 52초 후, 53초 후, 54초 후, 55초 후, 56초 후, 57초 후, 58초 후, 59초 후, 1분(60초) 후, 2분 후, 3분 후, 4분 후, 5분 후, 6분 후, 7분 후, 8분 후, 9분 후 또는 10분 후에 수행되는 것일 수 있다.
바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 10초 내지 30분 사이에 수행되는 것일 수 있다.
더욱 바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 10초 내지 20분 사이에 수행되는 것일 수 있다.
더욱 바람직한 하나의 실시양태에서, 상기 (II) 단계의 측정은 상기 (I) 단계에서 조성물 처리 후 10초 내지 15분 사이에 수행되는 것일 수 있다.
생물발광을 이용하는 어세이의 기본 원리는 세포생존 유지에 필수적 요소인 ATP 를 측정하는 것이다. ATP 는 건강한 세포에서는 정확하게 조절되지만，세포 사멸과 동시에 급격한 분해가 일어난다. 살아있는 세포에서는 세포 내 ATP의 수준이 일정하게 유지되며, 집단적 관점에서 ATP 수준은 생존하고 있는 세포 수와 직접적인 관련이 있다. 따라서, ATP의 측정은 살아있는 세포의 수준을 측정하기 위한 강력한 수단이 된다. 따라서 본 발명은 하나의 실시 양태로서,
(I) 상기 본 발명의 조성물(세포 내 ATP 검출용 조성물)을 미생물 세포에 처리하는 단계; 및
(II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
를 포함하는 미생물 수준 측정 방법을 제공한다. (II) 단계에서 측정되는 발광 수준은 ATP 수준과 비례하고, 상기 ATP 수준은 살아있는 미생물의 양과 비례되므로 당업자는 이를 통해 살아있는 미생물의 존재 수준을 간접적으로 측정 가능하다.
본 발명에서 미생물은, 이에 제한되지 않으나, 예를들어 세균, 진균 및 이들의 혼합물을 모두 포함하는 의미이다.
상기 본원 발명을 이용하여 미생물 수준을 측정하는 것은, 문화재 및 기록물(특히, 기록유산들)의 미생물 오염수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서 본 발명은
(i) 문화재 또는 기록물로부터 시료를 채취하는 단계;
(ii) 상기 시료를 상기 본원 발명의 조성물(세포 내 ATP 검출용 조성물)과 혼합하는 단계; 및
(iii) 발광 수준(level)을 측정하는 단계
를 포함하는, 문화재 또는 기록물의 미생물에 대한 오염도를 측정하는 방법을 제공한다.
하나의 실시 양태에서, 상기 시료는 문화재 또는 기록물 상의 임의의 부분을 면봉(swab)으로 닦아 채취되는 것일 수 있다. 상기 면봉은 바람직하게 면봉 형(swab type) 분석기구를 의미하는 것으로서, 이에 대해서는 키트 부분에 서술한 바를 참조로 이해된다. 간략하게, EP2870257B1 등에 도시된 바와 같이 검출 시약이 담지되어있는 별도의 반응부를 포함하는 용기에서 반응되는 경우, 더욱 편리한 측정을 가능하게 한다.
본 발명의 ATP 검출용 조성물은, 다양한 세포에 대해서(특히 세균뿐만 아니라 진균에서도) 재현성 있고 신뢰성 있는 데이터를 쉽고 빠르게 수득 가능하다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1 : 기존 시판 ATP 반응시약
현재 시중에서 판매되고 있는 ATP 반응시약인 Surface ATP UXL100 swabs(3M™ Clean-Trace™)을 이용하여, 제조사의 지침에 따라 발광분석을 수행하였다. 측정기기로는 ATP 루미노미터인 3M™ Clean-Trace NG Luminometer LM1을 사용하였다. 대표적으로 진균류 2종(Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum) 및 세균류 2종(Escherichia coli , Staphylococcus aureus)에 대하여 발광량(RLU; Relative Light Unit)을 측정하였으며, 1개의 시료 당 총 5회씩 반복 측정하였다. 각 측정은 1분 간격으로 수행되었다.
기존 ATP 반응시약을 이용한 진균류의 발광분석 결과
미생물
종명 		미생물
농도 		반복 측정 결과(RLU) 평균
(RLU) 		표준
편차
(RLU)
1차 측정 2차 측정 3차 측정 4차 측정 5차 측정
Aspergillus
niger 		1.6x102
CFUs/mL		 251 272 296 302 349 294.0 32.9
1.6x103
CFUs/mL		 4911 5109 5789 6208 7003 5804.0 759.1
1.6x104
CFUs/mL		 10874 11131 11958 12854 13227 12008.8 923.0
Penicillium
chrysogenum 		3.5x102
CFUs/mL		 331 409 503 549 616 481.6 101.0
3.5x103
CFUs/mL		 5111 6028 6657 7021 7799 6523.2 909.2
3.5x104
CFUs/mL		 10775 11803 12879 13001 13984 12488.4 1100.7
기존 ATP 반응시약을 이용한 세균류의 발광분석 결과
미생물
종명 		미생물
농도 		반복 측정 결과(RLU) 평균
(RLU) 		표준
편차
(RLU)
1차 측정 2차 측정 3차 측정 4차 측정 5차 측정
Escherichia
coli 		2.7x105
CFUs/mL		 834 842 820 851 839 837.2 10.2
2.7x106
CFUs/mL		 9637 9751 9584 9671 9695 9667.6 55.9
2.7x107
CFUs/mL		 44237 44263 44281 44187 44870 44367.6 253.2
Staphylococcus
aureus 		4.5x105
CFUs/mL		 970 956 987 975 985 974.6 11.2
4.5x106
CFUs/mL		 9817 9867 9738 9753 9721 9779.2 54.6
4.5x107
CFUs/mL		 64457 64655 64704 64213 64987 64603.2 258.4
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 기존 시판 ATP 반응시약을 이용하여 진균류의 발광량을 측정한 결과 반복적으로 측정할 때마다 발광량(RLU; Relative Light Unit)이 확연한 폭으로 점진적으로 증가하는 것이 확인되었다. 즉, 일정수준의 측정오차를 감안하더라도, 진균류에 대해서는 일관성 있고 재현성 있는 데이터 값을 얻지 못하였다. 따라서 기존 시약으로는 단회 측정만으로 진균류에 대한 정확한 측정이 이루어지기 어려운 것으로 확인되었다.
그러나 상기 표 2에서 보는 바와 같이, 동일한 방법을 이용하여 세균류에 대하여 발광량을 측정한 결과에서는, 반복측정 시에 일정 수준의 측정 오차만이 있었을 뿐, 표 1에서처럼 큰 폭으로 시간변화에 따라 값이 계속적으로 증가하거나 감소하는 경향이 확인되지 않았다. 이로써 기존 시판 ATP 시약은 세균류에 대해서는 신뢰할 수 있는 데이터 측정이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 1 : 본 발명 ATP 반응시약
본 발명자들은 하기 표 3에 도시된 바와 같은 조성의 ATP 반응 시약을 제조하였다. 본 발명의 ATP 반응시약을 이용하여 상기 비교예 1과 동일한 균들에 대하여 실험을 수행하였다. 구체적으로 실험은 다음과 같이 수행되었다.
먼저, 하기 표 3에 도시한 함량비(중량부)에 따라 성분들을 혼합하여 시약을 제조하였으며, 각각의 성분 물질들은 Sigma aldrich 로부터 구입하였다. Surface ATP UXL100 swabs(3M™ Clean-Trace™) 내부에 존재하는 기존 시약을 완전히 제거 한 후, 본 발명에 따른 ATP 반응 시약(즉, 하기 표 3에 도시된 조성의 ATP 시약) 1mL로 대체하여 사용하였다. 이후, 측정은 상기 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 동일한 측정기(3M™ Clean-Trace™ LM1)를 적용하여 수행하였다.
본 발명의 ATP 발광반응 시약 조성 및 효소 사용량
구분 효소 정보 사용량
enzyme - Luciferase 종류 : Luciferase from Photinus pyralis (firefly)/ sigma aldrich(CAS. No.61970-00-1)
- Luciferase 농도: 10x1010 units/mg protein
- Luciferase stock solution: 50μg/mL		 5μL/mL
구분 화학물질 명 함량
(중량부)
Substrate
(젤라틴 가수분해물 100 중량부 기준 함량)		 Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate 10 - 20
Citric Acid 0.1 - 5.0
Gelatins, hydrolyzates 100
D-Luciferin potassium salt 40 - 50
Sodium Citrate 20 - 30
Sulfuric acid, Magnesium salt (1:1, MgSO4) 2 - 10
HEPES sodium salt 0.1 - 4.0
Chitinase from Streptomyces griseus
Poly(1,4-β-[2-acetamido-2-deoxy-D-glucoside]) glycanohydrolase		 10 - 20
Nuclease free water 0.1 - 4.0
Buffer
(정제수 100 중량부 기준 함량)		 6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid 2 - 10
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether 0.1 - 4.0
Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate 0.1 - 2.0
Magnesium Chloride 0.1 - 2.0
Chlorhexidine Diacetate 0.1 - 2.0
Defoamers 0.1 - 2.0
Nuclease free water 100
본 발명 ATP 반응 시약을 이용한 진균류 발광분석 결과
미생물
종명 		미생물
농도 		반복 측정 결과(RLU) 평균
(RLU) 		표준
편차
(RLU)
1차 측정 2차 측정 3차 측정 4차 측정 5차 측정
Aspergillus
niger 		1.6x102
CFUs/mL		 401 441 432 468 461 440.6 23.7
1.6x103
CFUs/mL		 11130 11235 11123 11198 11200 11177.2 43.5
1.6x104
CFUs/mL		 45740 45879 46811 45326 46005 45952.2 486.4
Penicillium
chrysogenum 		3.5x102
CFUs/mL		 921 935 945 930 929 932.0 7.9
3.5x103
CFUs/mL		 12354 12464 11998 12897 12450 12432.6 287.1
3.5x104
CFUs/mL		 40333 40545 41023 41218 40879 40799.6 320.6
실험결과 상기 표 4에서 보는 바와 같이, 진균을 대상으로 본원 발명의 ATP 반응시약을 이용하는 경우 발광량 반복측정 시에 일정 범위의 측정 오차만이 있었을 뿐, 표 1에서처럼 큰 폭으로 시간변화에 따라 값이 계속적으로 증가하거나 감소하는 경향이 확인되지 않았다. 물론 세균에 대한 실험에서도, 재현성 및 일관성이 있게 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 수 있었다. 이로써 본원 발명의 ATP 반응 시약은 세균류 뿐만아니라 진균류들에 대해서도, 쉽고 빠르게 신뢰할 수 있는 데이터 측정이 가능한 것을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세포 내 ATP 검출용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 다양한 세포에 대해서(특히 세균뿐만 아니라 진균에서도) 재현성 있고 신뢰성 있는 데이터를 쉽고 빠르게 수득 가능하므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (9)

  1. (a) 루시퍼레이스(luciferase), 하기 (b) 기질 조성물 및 하기 (c) 버퍼 조성물을 포함하는 세포 내 ATP 검출용 조성물:
    상기 (b) 기질 조성물은
    젤라틴 가수분해물(Gelatin hydrolyzates);
    CDTA 모노하이드레이트 (Trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid monohydrate);
    시트릭 애시드(Citric Acid);
    루시페린 포타슘 염(Luciferin potassium salt);
    소듐 시트레이트(Sodium Citrate);
    마그네슘 설페이트(magnesium sulfate);
    HEPES 소듐 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt); 및
    키티네이스(Chitinase)를 포함하며,

    상기 (c) 버퍼 조성물은
    물(water);
    6-((4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)메틸)니코티닉 애시드 (6-((4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)methyl)nicotinic acid);
    폴리에틸렌 글라이콜 tert-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether);
    디소듐 디하이드로젠 EDTA(Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate);
    마그네슘 클로라이드(Magnesium Chloride); 및
    클로헥시딘 디아세테이트(Chlorhexidine Diacetate)를 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 루시퍼레이스(luciferase), (b) 기질 조성물 및 (c) 버퍼 조성물은 세포 시료에 대하여 동시에 또는 순차적으로 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 미생물인 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
  5. (I) 제1항의 조성물을 세포에 처리하는 단계; 및
    (II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
    를 포함하는 세포내 ATP 수준 측정 방법.
  6. (I) 제1항의 조성물을 미생물 세포에 처리하는 단계; 및
    (II) 발광 수준(level)을 측정하는 단계;
    를 포함하는 미생물 수준 측정 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 세균, 진균 또는 이들의 혼합물인 방법.
  8. (i) 문화재 또는 기록물로부터 시료를 채취하는 단계;
    (ii) 상기 시료를 제1항의 조성물과 혼합하는 단계; 및
    (iii) 발광 수준(level)을 측정하는 단계
    를 포함하는, 문화재 또는 기록물의 미생물에 대한 오염도를 측정하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시료는 문화재 또는 기록물 상의 임의의 부분을 면봉(swab)으로 닦아 채취되는 것인 방법.
KR1020180172276A 2018-12-28 2018-12-28 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법 KR20200082077A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180172276A KR20200082077A (ko) 2018-12-28 2018-12-28 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180172276A KR20200082077A (ko) 2018-12-28 2018-12-28 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200082077A true KR20200082077A (ko) 2020-07-08

Family

ID=71601220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180172276A KR20200082077A (ko) 2018-12-28 2018-12-28 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20200082077A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101808912B1 (ko) 2015-09-23 2018-01-19 대전대학교 산학협력단 문화재 보존 소독용 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101808912B1 (ko) 2015-09-23 2018-01-19 대전대학교 산학협력단 문화재 보존 소독용 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4275715B2 (ja) 改良されたａｔｐ検出法
JP3171595B2 (ja) ルシフェラーゼ組成物及び方法
Lundin Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites
JP6043399B2 (ja) 改良ルシフェラーゼ・アッセイ
US7422868B2 (en) Microbial ATP extraction and detection system
US20080166753A1 (en) Microbial Growth Assay
JP2007330270A6 (ja) 改良されたａｔｐ検出法
EP0756637B1 (en) Methods for calibrating chemical assays
JP2539225B2 (ja) グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法
EP1228239B1 (en) Assay of micro-organisms in cell cultures
KR20200082077A (ko) 세포 내 atp 검출용 조성물, 및 이를 이용한 문화재 또는 기록물의 미생물 오염도 측정 방법
US20040033587A1 (en) Method and device for detecting Biologically Active Substances
JPH09107994A (ja) 細胞内ａｔｐの測定方法
JPH07203995A (ja) 細胞内ａｔｐの測定方法
JP2008536519A (ja) 延長した直線を用いる発光ａｔｐ検出
Marcaida et al. Determination of intracellular ATP in primary cultures of neurons
JP6698651B2 (ja) 試料中の細菌ａｔｐを検出するためのａｔｐ−ジホスホヒドロラーゼを含むキット
JPWO2006013837A1 (ja) ルシフェラーゼ発光方法および発光試薬
EP1098001A1 (en) Assay of micro-organisms in cell cultures