JPH07203995A

JPH07203995A - 細胞内ａｔｐの測定方法

Info

Publication number: JPH07203995A
Application number: JP2381094A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Haketa; 靖羽毛田; Tatsuo Nishino; 達夫西野; Hiroshi Tsunoda; 浩角田
Original assignee: Toa Electronics Ltd
Current assignee: Toa Electronics Ltd
Priority date: 1994-01-26
Filing date: 1994-01-26
Publication date: 1995-08-08

Abstract

(57)【要約】【目的】界面活性剤を含んだ抽出試薬により細胞を含
む試料から細胞内ＡＴＰを抽出し、これにルシフェラー
ゼとルシフェリンによる生物化学発光法を適用して細胞
内ＡＴＰを測定するに際し、抽出試薬による生物化学発
光の酵素反応の阻害を抑制することができ、且つ細胞内
ＡＴＰの抽出能力を低下することがない細胞内ＡＴＰの
測定方法を提供することである。【構成】 α−シクロデキストリン等のシクロデキスト
リンは、界面活性剤を含む抽出試薬の抽出能力を低下さ
せず、且つ酵素反応の阻害を抑制する特性を有するの
で、これを抽出試薬による酵素反応阻害に対する抑制試
薬として使用した。【効果】シクロデキストリンの使用により目的の効果
を得ることができ、又測定試料の稀釈を要しないので、
測定感度を向上する等の効果もある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物化学発光法を利用
した細胞内ＡＴＰの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌、酵母菌、乳酸菌及びその他の生
細胞数の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、
超純水、環境などの分野において非常に重要である。一
般に、細胞数の測定は、成長培地中のコロニーの計測、
血球計算盤による顕微鏡下の計測、濁度測定などによっ
て行なわれている。

【０００３】成長培地中のコロニー計測による方法は、
高感度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞種が同定できる等の点で優れている。
しかし、細胞の培養を必要とするので、測定に通常１日
以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さな
い。

【０００４】血球計算盤による方法は、顕微鏡を用いる
ために操作が煩雑である、自動化が困難である等の欠点
を有している。

【０００５】濁度測定による法は、迅速で自動化が容易
である点で優れているが、感度が低い、生細胞と死細胞
の細胞数が区別ができない、発酵乳などベースの濁度が
高い試料には適用できない等の問題点を有している。

【０００６】ところで、上記分野における細胞数測定に
は、迅速且つ高感度の測定が要求される。例えば食品衛
生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の検
査は必要不可欠である。従来、この検査はコロニー計測
法によって行なわれているが、検査に１日以上を要する
ために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかねば
ならない。このため流通効率の点で問題があるだけでな
く、牛乳などの製品では保管時間が長くなるにつれて微
生物汚染の可能性が高くなる。又食品で汚染を問題にす
る微生物濃度は総じて低濃度であるので、高感度な検査
が要求される。

【０００７】上記の要求を満たす微生物濃度測定法とし
て、生きた微生物中に必ず存在するアデノシン３リン酸
（ＡＴＰ）を生物化学発光法を用いて測定する方法が知
られている。この方法は微生物に含まれるＡＴＰ濃度が
微生物濃度に比例することを利用しており、測定時間が
短く、高感度であるために非常に有効な方法である。

【０００８】生物化学発光法による測定では、蛍発光の
基質であるルシフェリンとその酵素のルシフェラーゼが
用いられる。この方法を用いて微生物細胞のＡＴＰ濃度
を測定するには、細胞中に含まれるＡＴＰを抽出する必
要がある。

【０００９】細胞のＡＴＰ抽出法としては、トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）の水溶液を微生物に加えて抽出する方法
（ＴＣＡ法）、界面活性剤水溶液で抽出する方法（界面
活性剤法）、９０℃のトリス緩衝液で抽出する方法（ト
リス緩衝液法）、エタノールを用いる方法（エタノール
法）、リゾチームなどの溶菌酵素を用いる方法（酵素
法）等がある。

【００１０】しかしながら、ＴＣＡ法、エタノール法、
界面活性剤法は、生物化学発光の酵素反応を阻害する場
合が多い上に、稀釈やｐＨ調整などの前処理を必要と
し、操作が煩雑で感度を低下させる場合が多い。トリス
緩衝液法は抽出溶液を９０℃の高温に熱する必要があ
り、操作面での煩わしさがある。酵素法は抽出に時間が
かかり、試薬が高価で不安定という問題もある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】以上、いずれの方法も
一長一短があり、場合に応じて使い分けているのが現状
であるが、比較的多用されているのが界面活性剤法であ
る。一般に陽イオン性界面活性剤を用いる。

【００１２】この方法は、上述したように、生物化学発
光の酵素反応を阻害する場合が多く、その阻害度合は界
面活性剤の濃度が高いほど大きくなる。抽出能力は界面
活性剤濃度が高いほど大きくなるので、界面活性剤濃度
が低いと酵素反応の阻害を小さくできるが、抽出能力が
不十分となる。従って界面活性剤法では酵素反応を阻害
せず、抽出能力が高い方法が望まれている。

【００１３】従って本発明の目的は、界面活性剤を含ん
だ抽出試薬により細胞を含む試料から細胞内ＡＴＰを抽
出し、これにルシフェラーゼとルシフェリンによる生物
化学発光法を適用して細胞内ＡＴＰを測定するに際し、
抽出試薬による生物化学発光の酵素反応の阻害を抑制す
ることができ、且つ細胞内ＡＴＰの抽出能力を低下する
ことがない細胞内ＡＴＰの測定方法を提供することであ
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的は本発明に係る
細胞内ＡＴＰの測定方法にて達成される。要約すれば本
発明は、細胞を含む試料をＡＴＰ抽出試薬と接触して試
料の細胞内ＡＴＰを抽出し、次いで抽出試料にルシフェ
ラーゼとルシフェリンによる生物化学発光法を適用し
て、試料の細胞内ＡＴＰを測定する方法において、前記
抽出試料をシクロデキストリンを含む酵素反応阻害抑制
試薬と接触した後、抽出試料に前記生物化学的発光法を
適用することを特徴とする細胞内ＡＴＰの測定方法であ
る。ＡＴＰ抽出試薬は界面活性剤を含む。

【００１５】以下、本発明について詳述する。

【００１６】本発明は、界面活性剤を含んだ抽出試薬に
よる細胞内ＡＴＰの抽出と、これへの生物化学発光法の
適用とによって細胞内ＡＴＰを測定する方法において、
抽出試薬の抽出能力を低下させず、且つ酵素反応の阻害
を抑制することが可能な酵素反応阻害抑制試薬（抑制試
薬）を発見したことによって達成されたものである。即
ち、界面活性剤は細胞からＡＴＰを抽出するために使用
されるが、生物化学発光の酵素反応を阻害する場合が多
く、本発明の特徴は、この阻害を抑制するために、シク
ロデキストリンを含んだ抑制試薬を接触させることにあ
る。

【００１７】生物化学発光法を用いた細胞内ＡＴＰの測
定は、細胞を含んだ試料を界面活性剤を含んだ抽出試薬
と接触させて、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した後、抽
出したＡＴＰを蛍発光の基質であるルシフェリンと酵素
であるルシフェラーゼを含んだ発光試薬と接触し、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼ及びＡＴＰによる酵素反応に
より生物化学発光させ、その生成した光を測定する方法
が一般的である。本発明では、このとき、シクロデキス
トリンを含んだ抑制試薬を発光試薬に添加するか、試料
又は抽出試薬を抑制試薬に接触した後、発光試薬と接触
させることにより、界面活性剤による生物化学発光の酵
素反応を抑制することが可能である。

【００１８】これらの試薬の接触操作は、手操作による
方法、ポンプ等の装置による方法、フローインジェクシ
ョン分析法（ＦＩＡ法）又はこれらを組合せた方法等に
より行なうことができ、発光量の測定は、バッチ式又は
ＦＩＡ法などの流れを利用した分析法で行なうことがで
きる。ＦＩＡ法においては、キャリヤ液に抑制試薬を添
加することによっても本発明の目的を達成することが可
能である。

【００１９】上述のいかなる方法によらず、抑制試薬を
接触さる工程は、抽出したＡＴＰを発光試薬と接触させ
るのと同時か、発光試薬と接触させる以前が、生物化学
発光の酵素反応の阻害を抑制する点で好ましい。

【００２０】抽出試薬に用いる界面活性剤には、アルキ
ルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベン
ゼトニウム、セチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）等を好適に使
用することができる。抑制試薬に用いるシクロデキスト
リンとしては、界面活性剤の種類、濃度により、α−シ
クロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シク
ロデキストリンのいずれか１種又は複数種を選択して使
用することができる。

【００２１】本発明の具体例について説明する。

【００２２】

【実施例】

実施例１先ず、抽出試薬の化学発光反応阻害に対するシクロデキ
ストリンの抑制効果を示す試験について述べる。発光の
測定にはバッチ式の生物化学発光測定装置を使用した。
抽出試薬の界面活性剤にはドデシルジメチルベンジルア
ンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）を使用
し、又抑制試薬にはα−シクロデキストリンを使用し
た。

【００２３】上記の塩化ベンザルコニウムは殺菌剤とし
て知られており、細胞の細胞壁に作用してＡＴＰなどの
比較的小さい分子を透過させる能力を有している。従っ
てＡＴＰを抽出する能力は非常に高く、抽出試薬として
優れている。ＡＴＰの抽出は、抽出試薬の一定量に細胞
を懸濁させた懸濁液を一定量加えて撹拌することにより
成し遂げられる。十分な抽出能力を発現させるために
は、懸濁液と抽出試薬を混合したときの混合液に対し、
塩化ベンザルコニウム濃度が０．０５％以上になるよう
にすることが好ましい。しかしながら、塩化ベンザルコ
ニウムが０．０５％以上の濃度では、生物化学発光によ
りＡＴＰ濃度を測定する工程で酵素反応を著しく阻害す
るため、抽出後に緩衝液などにより稀釈することが必要
になる。

【００２４】本発明では、α−シクロデキストリンを含
んだ抑制試薬を加えるので、抽出後に希釈等をすること
なく、上記の阻害を抑制することが可能である。

【００２５】測定操作は以下の通りである。１００ｎｍ
ｏｌ／ｌのＡＴＰ標準液をキュベットに１００μｌ入
れ、０．１％塩化ベンザルコニウムと１ｍＭのＥＤＴＡ
をｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬
（これを抽出試薬Ａとする）を１００μｌ加えて撹拌
し、ＡＴＰを抽出する。更に２％のα−シクロデキスト
リンと１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝
液に溶解した抑制試薬（これを抑制試薬ａとする）を５
０μｌ加えて撹拌した後、蛍のルシフェリン、ルシフェ
ラーゼを含んだ発光試薬（東亜電波工業製ＡＴＰＡ−１
Ｌ１）を１００μｌ加えて撹拌する。そしてキュベット
を生物化学発光測定装置にセットし、生物化学発光反応
によって生じた光を測定し発光量を求める。発光量はキ
ュベットをセットした後、５秒後から始めて０．１秒間
隔で発光を３０秒間計測し、これを積算して求めた。

【００２６】抽出試薬Ａと抑制試薬ａに加えたＥＤＴＡ
は、細胞を抽出試薬に接触したときにＡＴＰを分解する
アルカリフォスフォターゼなどの酵素作用を抑制する目
的で使用している。ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液は、
生物化学発光法を用いてＡＴＰを測定する酵素を至適状
態に保つために必要である。

【００２７】表１にＡＴＰ測定に対する発光量と相対発
光量を示す。比較のために、上記の抑制試薬ａの組成か
らα−シクロデキストリンを除いたもの（抑制試薬ｂ）
と、１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液
に溶解した試薬（抽出試薬Ｂ）を用いた場合を試した。

【００２８】

【表１】

【００２９】ブランクとして使用した抑制試薬ｂと抽出
試薬Ｂの組合せでは、α−シクロデキストリンと界面活
性剤を含んでいないので、生物化学発光の酵素反応に対
する阻害はないと考えられる。そこでこれを基準に選ん
で相対発光量１００％とする。表１に示されるように、
本発明による抑制試薬ａと抽出試薬Ａの組合せでは、相
対発光量は抑制試薬ｂと抽出試薬Ｂの組合せのときの９
２％であり、発光反応の阻害が抑制されている。α−シ
クロデキストリンを含まない抑制試薬ｂと抽出試薬Ａの
組合せの場合には、相対発光量は僅か２．７％であり、
発光反応の阻害が極めて大きいことが分かる。

【００３０】以上のように、α−シクロデキストリンを
含んだ抑制試薬を添加することにより、生物化学発光の
酵素反応に対する阻害をほぼ抑制できることが確認され
た。

【００３１】次に、本発明法による微生物細胞内ＡＴＰ
の測定を、従来法による測定と比較して示す。従来法
は、ＡＴＰの抽出にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いる
ＴＣＡ抽出法に依った。ＴＣＡ抽出法は一般に微生物か
らＡＴＰを抽出する場合に用いられる方法で、ＡＴＰの
抽出能力に非常に優れている。測定試料には乳酸菌懸濁
液を用いた。

【００３２】ＴＣＡ抽出液による微生物中のＡＴＰの測
定操作は以下の通りである。乳酸菌懸濁液の試料１００
μｌに５％のトリクロロ酢酸溶液を０．９ｍｌ加えて６
０秒間撹拌し、乳酸菌からＡＴＰを抽出する。この試料
を５０μｌ分取し、ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液９．
９５ｍｌを加えて良く撹拌する。この試料１００μｌを
キュベットに取り、発光試薬１００μｌを添加撹拌し、
前述の生物化学発光測定装置にセットし、発光量を求め
る。そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌについて
生物化学発光測定装置で測定した発光量と比較して、Ａ
ＴＰ濃度を求めた。

【００３３】上記のｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液を加
えて撹拌する操作は、トリクロロ酢酸が生物化学発光の
酵素反応を大きく阻害するので、これを防ぐために必要
である。しかし、試料溶液がトリクロロ酢酸と緩衝液に
より大きく稀釈（本例では２０００倍に稀釈）されてし
まい、測定感度の低下が起こり、ＴＣＡ抽出法の問題点
になっている。

【００３４】本発明による抑制試薬ａを用いた微生物細
胞内ＡＴＰの測定操作は以下の通りである。乳酸菌懸濁
液の試料１００μｌをキュベットに入れ、抽出試薬Ａを
１００μｌ加えて６０秒間撹拌し、乳酸菌からＡＴＰを
抽出する。更に抑制試薬ａを５０μｌ加えて撹拌した
後、発光試薬１００μｌを加えて撹拌し、生物化学発光
測定装置にキュベットをセットし、生物化学発光反応に
よって生じた光の発光量を測定する。発光量は、上述し
たように、キュベットをセットした後、５秒後から始め
て０．１秒おきに発光を３０秒間計測し、これを積算し
て求めた。抑制試薬ｂと抽出試薬Ａ、抑制試薬ｂと抽出
試薬Ｂの組合せについても同様な操作をして、発光量を
測定した。そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに
ついて生物化学発光測定装置で測定した発光量と比較し
て、ＡＴＰ濃度を求めた。これらの結果及びＴＣＡ抽出
法による結果を表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２に示されるように、本発明による抑制
試薬ａと抽出試薬Ａの組合せでは、ＴＣＡ法による測定
値とほぼ同等な結果が得られているが、α−シクロデキ
ストリンを加えない抑制試薬ｂと抽出試薬Ａの組合せで
は、発光の酵素反応が阻害されるので、ＴＣＡ法に比べ
ると低いＡＴＰ濃度しか得られない。又抑制試薬ｂと界
面活性剤を含まない抽出試薬Ｂの組合せでは、抽出が全
く起こらないために、ＡＴＰ濃度の測定値がゼロとなっ
ている。以上のように、本発明に基づくシクロデキスト
リンを含んだ抑制試薬ａと抽出試薬Ａの組合せが優れた
結果を示した。

【００３７】この本実施例よる測定では、試料溶液は抽
出試薬と抑制試薬の添加によりわずか２倍強にしか希釈
されない。抑制試薬を添加しない場合、従来の方法であ
ると試料溶液の２０倍以上の稀釈が必要であり、ＴＣＡ
法に至っては２０００倍もの稀釈が必要であることを考
慮すると、本発明の方法は感度の点で非常に有利とな
る。

【００３８】上記において、塩化ベンザルコニウムの濃
度は、抽出試薬１容に対し微生物を含んだ試料１容とい
う条件では０．１％以上が好ましいが、微生物濃度が低
濃度である場合には必ずしも０．１％以上である必要は
なく、塩化ベンザルコニウムの濃度を適宜低くすること
ができる。塩化ベンザルコニウムの濃度は、抽出を行な
う細胞の種類によっても使い分けることが好ましい。

【００３９】抑制試薬に添加するα−シクロデキストリ
ンの濃度は、抽出を行なった試料１容に対して、添加試
薬０．５容積という条件では２％以上好ましいが、塩化
ベンザルコニウム濃度が０．１％以下の場合には必ずし
も２％以上である必要はない。α−シクロデキストリン
濃度はある程度高いほど発光反応の阻害を抑制する効果
が大きいが、必要以上に高いと逆に酵素反応を阻害する
ので、適当な濃度を使用するのが好ましい。塩化ベンザ
ルコニウム、α−シクロデキストリンの濃度は、上述の
例に限られず、試料、抑制試薬、抽出試薬、発光試薬の
使用量や種類により適切に設定する必要がある。

【００４０】α−シクロデキストリンの代わりにβ−シ
クロデキストリンを用いても同様な効果がある。又α−
シクロデキストリンとβ−シクロデキストリンの混合液
を抑制試薬として用いても良い。γ−シクロデキストリ
ンも抽出試薬に対する阻害抑制効果があるが、塩化ベン
ザルコニウムに対しては抑制効果が小さいので、この場
合には適さない。

【００４１】抑制試薬、抽出試薬に添加するＥＤＴＡ及
びｐＨ緩衝液は必ずしも両試薬に入れる必要はなく、い
ずれか一方に添加すれば良い。抽出時間が短い場合には
必ずしもＥＤＴＡの添加は必要ではなく、ｐＨ緩衝液は
測定したい試料のｐＨが中性付近であれば使用する必要
はない。

【００４２】ＡＴＰの抽出に要する時間は微生物の種類
により異なるが、大腸菌、乳酸菌、一般細菌では１０秒
以上、酵母菌の場合には３０秒以上が好ましい。抽出を
行なってから試料を放置しておくとＡＴＰ濃度は少しず
つ低下するので、発光量の測定は抽出後５分以内に行な
うことが好ましく、特にＥＤＴＡを含んでいない抽出試
薬を使用する場合には、抽出が完了してからすぐに測定
するのが好ましい。又この例では試薬の添加を手操作に
より行なっているが、ポンプや自動シリンジを利用して
試薬を自動的に添加しても良く、これにより更に簡便に
細胞内ＡＴＰを測定することができる。

【００４３】実施例２本実施例では、発光試薬に抑制試薬を添加する場合につ
いて示す。抽出試薬の界面活性剤として塩化ベンゼトニ
ウムを、抑制試薬としてβ−シクロデキストリンをそれ
ぞれ使用した。測定装置はバッチ式の生物化学発光測定
装置を用いた。

【００４４】又蛍のルシフェラーゼ、ルシェフェリンを
含んだ発光試薬（東亜電波工業製ＡＴＰＡ−１Ｌ１）に
抑制試薬の０．３％のβ−シクロデキストリンを添加し
た発光試薬（発光試薬Ｘ）と、０．１％塩化ベンゼトニ
ウムと１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝
液に溶解した抽出試薬（抽出試薬Ｃ）を使用した。

【００４５】測定操作は次の通りである。１００ｎｍｏ
ｌ／ｌのＡＴＰ標準液１００μｌをキュベットに入れ、
抽出試薬Ｃを１００μｌ加えて撹拌し、ＡＴＰを抽出す
る。次に本発明に基づく発光試薬Ｘを１００μｌ加えて
撹拌し、生物化学発光測定装置にキュベットをセット
し、生物化学発光反応によって生じた光の発光量を測定
する。発光量はキュベットをセットした後、５秒後から
始めて０．１秒間隔で発光を３０秒間計測し、これを積
算して求めた。

【００４６】表３には、各発光試薬と抽出試薬のＡＴＰ
測定に対する発光量と相対発光量を示した。比較のため
に、上記の発光試薬組成からβ−シクロデキストリンを
除いたもの（発光試薬Ｙ）と、１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ
７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（前述の
抽出試薬Ｂ）を用いた場合についても示した。

【００４７】

【表３】

【００４８】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せでは、β
−シクロデキストリンと界面活性剤を含んでいないため
に発光反応への阻害はなく、相対発光量は１００％と考
えられる。本発明による発光試薬Ｘと抽出試薬Ｃの組合
せでは、表３に示されるように、相対発光量は発光試薬
Ｙと抽出試薬Ｂの組合せの場合の８４％であり、大きな
阻害はない。一方、β−シクロデキストリンを含まない
従来法に基づく発光試薬Ｙと抽出試薬Ｃの組合せでは、
相対発光量は１１％と低く阻害が大きいことが分かる。
以上のように、発光試薬にβ−シクロデキストリンを加
えても、本発明の効果が得られることが分かる。

【００４９】次に本発明による微生物細胞内ＡＴＰ測定
を、従来法による測定との比較において示す。試料は酵
母菌懸濁液を用いた。従来法は、実施例１と同様、ＡＴ
Ｐの抽出にＴＣＡ抽出法を用いる方法で、その微生物細
胞内ＡＴＰの測定操作は実施例１で説明した通りであ
る。

【００５０】本発明による発光試薬Ｘを用いた微生物細
胞内のＡＴＰの測定操作は以下の通りである。酵母菌懸
濁液の試料１００μｌをキュベットに入れ、抽出試薬Ｃ
を１００μｌ加えて３０秒間撹拌し、酵母菌からＡＴＰ
を抽出する。更に発光試薬を１００μｌ加えて撹拌し、
生物化学発光測定装置にキュベットをセットし、生物化
学発光反応によって生じた光の発光量を測定する。発光
量はキュベットをセットした後、５秒後から始めて０．
１秒おきに発光を３０秒間計測し、積算して求めた。

【００５１】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｃ、発光試薬Ｙと抽
出試薬Ｂの組合せについても同様な操作により発光量を
測定した。そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに
ついて生物化学発光測定装置で測定した発光量と比較し
て、ＡＴＰ濃度を求めた。これら及びＴＣＡ法による結
果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】表４に示されるように、本発明に基づく発
光試薬Ｘと抽出試薬Ｃの組合せでは、ＴＣＡ法による測
定値と同等な結果が得られている。これに対し、β−シ
クロデキストリンを加えない発光試薬Ｙと抽出試薬Ｃの
組合せでは、発光の酵素反応の阻害を防止できないため
に、ＴＣＡ法に比べ低いＡＴＰ濃度しか得られない。又
界面活性剤を含まない抽出試薬Ｂを使用した場合には、
ほとんど抽出が起こらないために、ＡＴＰの測定値がほ
ぼゼロとなっている。従って本発明に基づく発光試薬Ｘ
と抽出試薬Ｃの組合せが優れていることは明らかであ
る。

【００５４】界面活性剤の濃度とシクロデキストリンの
濃度及び抽出時間については、実施例１と同様な注意が
必要である。β−シクロデキストリンの代わりにγ−シ
クロデキストリンを用いても同様な効果がある。又β−
シクロデキストリンとγ−シクロデキストリンの混合液
を抑制試薬として用いても良い。α−シクロデキストリ
ンの阻害抑制効果は塩化ベンゼトニウムに対しては小さ
いので、他の抽出試薬に対しては使用できるが、この場
合には適さない。

【００５５】実施例３本実施例においても、発光試薬に抑制試薬を添加して使
用した。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、
抑制試薬としてγ−シクロデキストリンを使用した。測
定装置はこれまでと同様、バッチ式の生物化学発光測定
装置である。

【００５６】ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、ほとんどの微
生物細胞に対しＡＴＰ抽出能力を示さず、動物の体細胞
のみからＡＴＰを抽出する能力があることが知られてい
る。そのために動物細胞と微生物細胞のＡＴＰを別々に
測定したい場合に使用されることがあるが、塩化ベンザ
ルコニウムなどの陽イオン性界面活性剤と同様に生物化
学発光反応を阻害するため、同様にＡＴＰ測定感度の低
下などの問題を有している。

【００５７】本実施例では、蛍のルシフェラーゼ、ルシ
フェリンを含んだ発光試薬（東亜電波工業製ＡＴＰＡ−
１Ｌ１）に抑制試薬の０．５％のγ−シクロデキストリ
ンを添加した発光試薬（発光試薬Ｚ）と、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００と１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５
ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（抽出試薬Ｄ）を
使用した。比較のために、上記の発光試薬組成からγ−
シクロデキストリンを除いた発光試薬（前述の発光試薬
Ｙ）と、１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩
衝液に溶解した抽出試薬Ｂを用いた場合についても試験
した。

【００５８】阻害抑制の測定は実施例２と同様な方法で
行なった。表５には各発光試薬と抽出試薬のＡＴＰ測定
に対する発光量と相対発光量を示した。

【００５９】

【表５】

【００６０】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せでは、γ
−シクロデキストリンと界面活性剤を含んでいないため
発光反応への阻害がなく、相対発光量は１００％と考え
られる。本発明による発光試薬Ｚと抽出試薬Ｃの組合せ
の場合の相対発光量は、表５に示されるように、発光試
薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せの場合の９５％であり、ほと
んど阻害はない。γ−シクロデキストリンを含まない従
来法に基づく発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄの組合せでは、相
対発光量は３５％と低く、阻害が大きいことが分かる。
以上のように、発光試薬にγ−シクロデキストリンを加
えることによっても、本発明の効果が得られることが分
かる。

【００６１】次に本発明による動物体細胞内ＡＴＰの測
定を従来法との比較において示す。試料はマウスの肺細
胞懸濁液を用いた。従来法は、これまでと同様、ＴＣＡ
抽出法によるＡＴＰの抽出を行なう方法である。ＴＣＡ
抽出法及び本発明による発光試薬Ｚと抽出試薬Ｄを用い
た細胞内ＡＴＰの測定操作は、実施例２で説明した通り
である。

【００６２】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄ、発光試薬Ｙと抽
出試薬Ｂの組合せについても同様な操作により発光量を
測定し、既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌについて生
物化学発光測定装置で測定した発光量と比較して、ＡＴ
Ｐ濃度を求めた。これらの結果を表６に示す。

【００６３】

【表６】

【００６４】表６に示されるように、本発明に基づく発
光試薬Ｚと抽出試薬Ｄの組合せでは、ＴＣＡ法による測
定値と同等な結果が得られているが、γ−シクロデキス
トリンを加えない発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄの組合せで
は、発光の酵素反応を阻害するためにＴＣＡ法に比べる
と低いＡＴＰ濃度しか得られない。又界面活性剤を含ま
ない抽出試薬Ｂでは全く抽出が起こらないために、ＡＴ
Ｐ濃度の測定値はほぼゼロとなっている。本発明に基づ
く発光試薬Ｚと抽出試薬Ｄの組合せが優れていることは
明らかである。

【００６５】上記において、界面活性剤の濃度とシクロ
デキストリンの濃度及び抽出時間については、実施例１
と同様な点を注意することが必要である。γ−シクロデ
キストリンの代わりにβ−シクロデキストリンを用いて
も同様な効果がある。β−シクロデキストリンとγ−シ
クロデキストリンの混合液を抑制試薬として用いても良
い。又α−シクロデキストリンの阻害抑制効果は、他の
抽出試薬に対しては有効であるが、ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００に対しては小さいのでこれには適さない。

【００６６】実施例４本実施例では、ＦＩＡ法（フローインジェクション分析
法）によるＡＴＰ測定装置を使用し、これに本発明を適
用して細胞中のＡＴＰ濃度を測定する方法について説明
する。測定装置の一例を図１に示す。

【００６７】本装置は、ルシェフェラーゼとルシフェリ
ンを含んだ発光試薬２の輸送ポンプ８及び流路２１と、
発光試薬用キャリヤ液１の輸送ポンプ７及び流路２６
と、キャリヤ液１及び発光試薬２のインジェクタ１３及
び混合器１６と、細胞を含んだ試料溶液４の輸送ポンプ
１０及び流路２２と、試料溶液用キャリヤ液３の輸送ポ
ンプ９及び流路２７と、キャリヤ液３及び試料溶液４の
インジェクタ１４及び混合器１７と、キャリヤ液１、キ
ャリヤ液３、発光試薬２及び試料溶液４の混合器１８及
び混合流路２８と、化学発光検出器１９と、そしてコン
ピュータ２０とを備えてなっている。

【００６８】上記の測定装置により試料溶液４のＡＴＰ
濃度を測定するには、発光試薬２をポンプ８により流路
２１を通って輸送してインジェクタ１３に導入し、ＡＴ
Ｐを含んだ試料溶液４をポンプ１０により流路２２を通
って輸送してインジェクタ１４に導入する一方、キャリ
ヤ液１をポンプ７によりインジェクタ１３に送液し、キ
ャリヤ液３をポンプ９によりインジェクタ１４に送液す
る。これによってキャャリヤ液１で発光試薬２を流路２
６に注入し、同時にキャリヤ液３で試料溶液４を流路２
７に注入する。流路２６に注入された発光試薬２は混合
器１６でキャリヤ液１と混合され、その発光試薬２を含
んだキャリヤ液１を流路２６を通って混合流路２８に導
入する。同様に、流路２７に注入された試料溶液４を混
合器１７でキャリヤ液３と混合し、その試料溶液４を含
んだキャリヤ３液を流路２７を通って混合流路２８に導
入する。これによって混合流路２８において発光試薬２
を含んだキャリヤ液１及び試料溶液４を含んだキャリヤ
３液を一緒に合せ、混合器１８で発光試薬２及び試料溶
液４を混合して、生物化学発光反応を行なわせる。

【００６９】そしてその反応により発生した光を化学発
光検出器１９で検出し、電気信号に変換してコンピュー
タ２０に送り、コンピュータ２０で信号の積分値を計算
し発光量を求める。求めた発光量と試料溶液４のＡＴＰ
濃度は比例するので、予め既知量のＡＴＰ標準液につい
て測定して求めた発光量と、試料溶液４の発光量をコン
ピュータ２０で比較計算することにより、試料溶液４の
ＡＴＰ濃度が求まり、ＡＴＰ濃度が測定される。

【００７０】上記において、細胞を含んだ試料溶液４の
ＡＴＰ濃度を測定装置で測定する前に、試料溶液４中の
細胞内ＡＴＰは抽出試薬により抽出する必要がある。こ
のときＡＴＰを抽出した試料溶液を従来法で測定する
と、抽出試薬の界面活性剤により生物化学発光の酵素反
応が阻害され、定量的な測定結果が得られない。これに
対し、本発明では、シクロデキストリンを含んだ抑制試
薬を例えばキャリヤ液１又はキャリヤ液３に添加するの
で、生物化学発光反応の阻害を抑制して定量的な結果を
得ることができる。

【００７１】上記の測定装置において、抽出試薬の界面
活性剤としてセチルトリメチルアンモニウムクロライド
を、抑制試薬のシクロデキストリンとしてα−シクロデ
キストリンを使用した例を、以下に詳しく説明する。

【００７２】キャリヤ液１及びキャリヤ液３は、０．５
％α−シクロデキストリン、１５ｍＭ硫酸マグネシウム
と１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に
溶解した溶液（キャリヤ液ｕ）を使用した。この方法で
はキャリヤ液が抑制試薬を兼ねていることになる。蛍の
ルシフェラーゼ、ルシフェリンを含んだ発光試薬（東亜
電波工業製ＡＴＰＡ−１Ｌ１）（発光試薬Ｙ）を使用し
た。抽出試薬は０．１％セチルトリメチルアモニウムク
ロライドと１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ
緩衝液に溶解した溶液（抽出試薬Ｅ）を使用した。比較
のために、上記キャリヤ液からα−シクロデキストリン
を除いた溶液（キャリヤ液ｖ）と、抽出試薬Ｅからセチ
ルトリメチルアンモニウムクロライドを除いた溶液（前
出の抽出試薬Ｂ）を用いた場合について検討した。上記
試薬を用いたＡＴＰ測定に対する阻害の度合の測定操作
を以下に示す。

【００７３】１００ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ標準液１ｍｌ
と抽出試薬Ｅの１ｍｌをキュベットに入れ３０秒間撹拌
し、試料溶液４とした。キャリヤ液１とキャリヤ液３を
流速１ｍｌ／分でインジェクタ１３、１４に送液し、５
０μｌの発光試薬２と５０μｌの試料溶液４を流路２
６、２７に注入し、上記操作により発光量を求める。混
合器１６、１７、１８には内径０．５ｍｍ、外径１．６
ｍｍ、長さ１ｍのテフロンチューブをコイル状に巻いた
ものを使用した。

【００７４】キャリヤ液１、３がキャリヤ液ｖであり、
これと抽出試薬Ｅ又は塩化ベンザルコニウムを含まない
抽出試薬Ｂを使用した場合についても、同操作により１
０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ標準液を測定した。各キャリヤ
液と抽出試薬のＡＴＰ測定に対する発光量と相対発光量
を表７に示す。

【００７５】

【表７】

【００７６】キャリヤ液ｖと抽出試薬Ｂの組合せでは、
α−シクロデキストリンと界面活性剤を含んでいないた
め発光反応への阻害はなく、相対発光量は１００％と考
えられる。本発明によるキャリヤ液ｕと抽出試薬Ｅの組
合せでは、キャリヤ液ｖと抽出試薬Ｂの組合せと比較し
た相対発光量は９４％であり、阻害がほとんどない。α
−シクロデキストリンを含まない従来法に基づくキャリ
ヤ液ｖと抽出試薬Ｅの組合せでは相対発光量は２５％と
低く、阻害が非常に大きいことが分かる。以上のよう
に、キャリヤ液１、３にα−シクロデキストリンを加え
ることにより、酵素反応の阻害を抑制する効果があるこ
とは明確である。

【００７７】次に本実施例による微生物細胞内ＡＴＰ測
定を従来法との比較において示す。測定試料には大腸菌
懸濁液を用いた。従来法は、ＡＴＰの抽出にトリクロロ
錯塩によるＴＣＡ抽出法を使用する方法で、これまでの
例と同じである。

【００７８】ＴＣＡ法による微生物中のＡＴＰの測定操
作は以下の通りである。試料２０μｌに５％のＴＣＡ溶
液を１．８ｍｌ加えて６０秒間撹拌し、大腸菌からＡＴ
Ｐを抽出する。この試料から２００μｌを分取し、ｐＨ
７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液３．８ｍｌに加えて良く撹拌
し、試料溶液４とする。キャリヤ液１とキャリヤ液３に
キャリヤ液ｖを用い流速１ｍｌ／分で送液し、５０μｌ
の発光試薬２と５０μｌの試料溶液４を注入し、上記操
作により発光量を求める。

【００７９】本実施例によるキャリヤ液ｕと抽出試薬Ｅ
の組合せの他に、比較のために、キャリヤ液ｕと抽出試
薬Ｅ、キャリヤ液ｖと抽出試薬Ｂの組合せについても前
述の操作により発光量を測定し、既知濃度のＡＴＰ標準
液５０μｌをＡＴＰ測定装置で測定したときの発光量と
比較してＡＴＰ濃度を求めた。試料溶液４、発光試薬組
成、混合器の条件は上記と同じである。それらの結果を
表８に示す。

【００８０】

【表８】

【００８１】表８に示されるように、本発明に基づくキ
ャリヤ液ｕと抽出試薬Ｅの組合せでは、ＴＣＡ法による
測定値と同等な結果が得られているが、シクロデキスト
リンを加えないキャリヤ液ｖと抽出試薬Ｅの組合せで
は、発光試薬の酵素反応を阻害するためにＴＣＡ法に比
べると低いＡＴＰ濃度しか得られない。又キャリヤ液ｖ
と界面活性剤を含まない抽出試薬Ｂでは全く抽出が起こ
らないために、ＡＴＰ濃度の測定値はほぼゼロとなって
いる。以上のように、本発明に基づくキャリヤ液ｕと抽
出試薬Ｅの組合せが明らかに優れている。

【００８２】上記において、界面活性剤の濃度とシクロ
デキストリンの濃度は、界面活性剤とシクロデキストリ
ンの種類によって異なるので、実施例１で説明したよう
な点に留意することが必要である。

【００８３】又本実施例のようなＦＩＡ法によるＡＴＰ
測定装置を使用する場合、シクロデキストリンを必ずし
もキャリヤ液１とキャリヤ液３の両方に添加する必要は
なく、キャリヤ液１もしくはキャリヤ液３だけにシクロ
デキストリンを加えることによっても本発明の目的は達
成され、同様な効果が得られる。

【００８４】又実施例１のように抑制試薬としてシクロ
デキストリンを加えて試料溶液４を作成する方法や、実
施例２のように発光試薬にシクロデキストリンを添加す
る方法を用いれば、キャリヤ液にはシクロデキストリン
を添加する必要はない。

【００８５】α−シクロデキストリンの代わりにβ−シ
クロデキストリンの混合液を抑制試薬として用いても良
い。γ−シクロデキストリンの阻害抑制効果は、セチル
トリメチルアンモニウムクロライドに対しては小さいの
で、この場合には使用に適さない。

【００８６】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では、ＡＴ
Ｐ抽出試薬の界面活性剤による生物化学発光の酵素反応
の阻害に対し、シクロデキストリンを含む抑制試薬を用
いたので、酵素反応の阻害を抑制して発光させることが
でき、その発光を検出することによりＡＴＰ濃度を正確
に測定することができる。又測定試料の稀釈を必要とし
ないために、測定感度の向上を図ることができ、抽出能
力を低下させることなもなく、操作面でも一層簡単なＡ
ＴＰ測定方法を構築することができる。従って食品衛
生、バイオなどの微生物検査に際し多大な威力を発揮す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例で使用したＦＩＡ法によるＡ
ＴＰ測定装置を示す構成図である。

【符号の説明】

１、３キャリヤ液２発光試薬４試料溶液７、８、９、１０輸送ポンプ１３、１４インジェクタ１６、１７、１８混合器１９化学発光検出器２０コンピュータ２１、２２流路２６、２７、２８流路

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を含む試料をＡＴＰ抽出試薬と接触
して試料の細胞内ＡＴＰを抽出し、次いで抽出試料にル
シフェラーゼとルシフェリンによる生物化学発光法を適
用して、試料の細胞内ＡＴＰを測定する方法において、
前記抽出試料をシクロデキストリンを含む酵素反応阻害
抑制試薬と接触した後、抽出試料に前記生物化学発光法
を適用することを特徴とする細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項２】ＡＴＰ抽出試薬が界面活性剤を含む請求
項１の測定方法。