JP2762553B2 - 微生物中のアデノシン三リン酸の抽出方法 - Google Patents
微生物中のアデノシン三リン酸の抽出方法Info
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- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
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- Y02W10/10—Biological treatment of water, waste water, or sewage
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 A.産業上の利用分野 本発明は活性汚泥中の微生物に含まれるATP（アデノ
シン三リン酸）を抽出する方法に関するものである。
シン三リン酸）を抽出する方法に関するものである。
B.発明の概要 本発明は、活性汚泥中の微生物に含まれるATPを抽出
する方法において、 トリクロロ酢酸を用いて抽出を行うことによって、 操作が簡便で、操作時間が短く、しかもATPの抽出効
率が高いという効果を得るようにしたものである。
する方法において、 トリクロロ酢酸を用いて抽出を行うことによって、 操作が簡便で、操作時間が短く、しかもATPの抽出効
率が高いという効果を得るようにしたものである。
C.従来の技術 細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定量
的に測定することにより有効な知見を得ることができ
る。
的に測定することにより有効な知見を得ることができ
る。
例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネル
ギー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（AT
P）が必ず存在し、死細胞中にはATPが存在しないことが
知られている。また１個の細胞中に存在するATP量は、
同一細胞では同一濃度のATPが存在する。従ってATPが定
量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞かの判定や細
胞の活性度が測定できることになる。
ギー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（AT
P）が必ず存在し、死細胞中にはATPが存在しないことが
知られている。また１個の細胞中に存在するATP量は、
同一細胞では同一濃度のATPが存在する。従ってATPが定
量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞かの判定や細
胞の活性度が測定できることになる。
このようなことから微生物の細胞中のATPを測定する
ことは、水処理、食品、医学等様々な分野において注目
されている。特に水処理分野においては、水を浄化する
ために活性汚泥を用いているので、その微生物量及び活
性度を迅速に測定することが重要であり、ATPは重要な
指標と考えられる。
ことは、水処理、食品、医学等様々な分野において注目
されている。特に水処理分野においては、水を浄化する
ために活性汚泥を用いているので、その微生物量及び活
性度を迅速に測定することが重要であり、ATPは重要な
指標と考えられる。
ところで微生物内のATPを測定するためには、ATPを微
生物の外部へ抽出することが必要である。この抽出方法
について現在まで数多くの方法が試みられており、その
条件としてはATPの抽出効率が高く、操作性が優れ、測
定に対する影響の小さいことが挙げられる。
生物の外部へ抽出することが必要である。この抽出方法
について現在まで数多くの方法が試みられており、その
条件としてはATPの抽出効率が高く、操作性が優れ、測
定に対する影響の小さいことが挙げられる。
こうしたことを踏まえて従来法の中でも優れた方法を
挙げると、ボイリングトリス法が知られている。この方
法においては、先ずトリス（NH2C（CH2OH）３）を蒸留
水に溶かした後pH調製等の処理をして得たトリス緩衝液
と、ルシフェリン及びルシフェラーゼの混合試薬にトリ
ス緩衝液を加えて得た酵素混合液とを用意する。次に試
料を試験管に入れ、沸騰させたトリス緩衝液を加え、沸
騰水浴中でかき混ぜながら抽出を行う。次いで沈澱管に
移して遠心分離を行い、上澄液をとり、室温まで冷却さ
せて試料液とする。一方空試験としてトリス緩衝液と酵
素混合液を蛍光光度計のキュベットに入れ、10〜60秒間
蛍光強度を測定する。次にキュベットに試料液をとり、
直ちにキュベット内に酵素混合液を加えて十分にかき混
ぜたのち、10〜60秒間蛍光強度を測定する。空試験値を
差し引き補正したのち、あらかじめ作成した検量線から
ATPの量を算出する。
挙げると、ボイリングトリス法が知られている。この方
法においては、先ずトリス（NH2C（CH2OH）３）を蒸留
水に溶かした後pH調製等の処理をして得たトリス緩衝液
と、ルシフェリン及びルシフェラーゼの混合試薬にトリ
ス緩衝液を加えて得た酵素混合液とを用意する。次に試
料を試験管に入れ、沸騰させたトリス緩衝液を加え、沸
騰水浴中でかき混ぜながら抽出を行う。次いで沈澱管に
移して遠心分離を行い、上澄液をとり、室温まで冷却さ
せて試料液とする。一方空試験としてトリス緩衝液と酵
素混合液を蛍光光度計のキュベットに入れ、10〜60秒間
蛍光強度を測定する。次にキュベットに試料液をとり、
直ちにキュベット内に酵素混合液を加えて十分にかき混
ぜたのち、10〜60秒間蛍光強度を測定する。空試験値を
差し引き補正したのち、あらかじめ作成した検量線から
ATPの量を算出する。
D.発明が解決しようとする課題 上述のボイリングトリス法においては、温度変化によ
ってATPを抽出する方法であるため沸騰水浴及び冷却装
置が必要であること、操作が複雑で時間もかかるという
欠点があった。
ってATPを抽出する方法であるため沸騰水浴及び冷却装
置が必要であること、操作が複雑で時間もかかるという
欠点があった。
本発明の目的はこのような欠点を解消することにあ
る。
る。
E.課題を解決するための手段 活性汚泥中には様々な微生物が存在し、具体的には、
藻、原生動物、変形菌、酵母、糸状菌及びグラム陰性菌
やグラム陽性菌を含む細菌等が混在している。そこで本
発明者は、複数菌が存在する活性汚泥を取り扱う前に、
活性汚泥の代表的な２種類の菌について基礎実験を行
い、最適抽出方法を選定した。その後、この結果をもと
に活性汚泥に適用し、操作が簡易でATP抽出率が高い抽
出方法の選定を行った。その結果トリクロロ酢酸を用い
て抽出することが最適抽出方法であることを見い出し
た。
藻、原生動物、変形菌、酵母、糸状菌及びグラム陰性菌
やグラム陽性菌を含む細菌等が混在している。そこで本
発明者は、複数菌が存在する活性汚泥を取り扱う前に、
活性汚泥の代表的な２種類の菌について基礎実験を行
い、最適抽出方法を選定した。その後、この結果をもと
に活性汚泥に適用し、操作が簡易でATP抽出率が高い抽
出方法の選定を行った。その結果トリクロロ酢酸を用い
て抽出することが最適抽出方法であることを見い出し
た。
F.実施例 （グラム陰性菌とグラム陽性菌の純粋培養菌についての
実験） （１）試料 活性汚泥中の微生物としてはPseudomonas fluorescen
s（グラム陰性菌）とBacillus megaterium（グラム陽性
菌）の純粋培養菌を用いた。また、活性汚泥は下水処理
場のばっき槽から採取し、冷蔵保存したものを用いた。
実験） （１）試料 活性汚泥中の微生物としてはPseudomonas fluorescen
s（グラム陰性菌）とBacillus megaterium（グラム陽性
菌）の純粋培養菌を用いた。また、活性汚泥は下水処理
場のばっき槽から採取し、冷蔵保存したものを用いた。
（２）抽出方法 化学的な方法の中から沸騰トリスバッファー（BT
B），過塩素酸（PCA），トリクロロ酢酸（TCA），エタ
ノール，セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTA
B）を抽出剤として用いた方法およびドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）とクロロホルムを組み合わせた方法につ
いて検討し、物理的な方法としては超音波を用いた方法
について検討した。
B），過塩素酸（PCA），トリクロロ酢酸（TCA），エタ
ノール，セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTA
B）を抽出剤として用いた方法およびドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）とクロロホルムを組み合わせた方法につ
いて検討し、物理的な方法としては超音波を用いた方法
について検討した。
（３）ATP測定 抽出したATPの測定は生物発光反応で生じた光の強度
を（株）明電舎製の生物発光・化学発光測定装置（ルミ
ノメータUPD-8000）で計測することによって行った。
を（株）明電舎製の生物発光・化学発光測定装置（ルミ
ノメータUPD-8000）で計測することによって行った。
なお生物発光反応を利用した測定法は、以下に示すよ
うにATPとルシフェリンとルシフェラーゼとの反応によ
り発生する光の量にもとづいてATPの量を知る方法であ
り、簡便で高感度な測定法である。なおホタルの光はこ
れに相当する。
うにATPとルシフェリンとルシフェラーゼとの反応によ
り発生する光の量にもとづいてATPの量を知る方法であ
り、簡便で高感度な測定法である。なおホタルの光はこ
れに相当する。
（４）抽出方法の決定 この２種類の菌について各方法の最適抽出条件を決定
するために、各々の抽出方法において抽出剤の濃度，抽
出温度，抽出時間について検討した結果、各抽出方法の
最適条件は表−１に示す通りであった。
するために、各々の抽出方法において抽出剤の濃度，抽
出温度，抽出時間について検討した結果、各抽出方法の
最適条件は表−１に示す通りであった。
なお表−１の後処理の欄の希釈１とは、4mM EDTAを含
む0.025Mトリス緩衝液により希釈する処理であり、希釈
２とは、4mM EDTAを含む0.1Mトリス緩衝液により希釈す
る処理である。また濃度を表示する「Ｍ」はmol/lの意
味である。
む0.025Mトリス緩衝液により希釈する処理であり、希釈
２とは、4mM EDTAを含む0.1Mトリス緩衝液により希釈す
る処理である。また濃度を表示する「Ｍ」はmol/lの意
味である。
これらの条件のもとで、２種類の微生物のATP抽出効
率について実験した結果を表−２に示す。この表はトリ
クロロ酢酸法で得られたATP抽出量を100％として各抽出
方法のATP抽出効率を相対的に示したものである。
率について実験した結果を表−２に示す。この表はトリ
クロロ酢酸法で得られたATP抽出量を100％として各抽出
方法のATP抽出効率を相対的に示したものである。
表−１から操作性においては、室温，短時間抽出が可
能で抽出後の操作が簡易であるトリクロロ酢酸法，エタ
ノール法,CTAB法が優れており、表−２からATP抽出効率
においては、トリクロロ酢酸法，エタノール法，過塩素
酸法が優れていることがわかった。従って、操作性,ATP
抽出効率を考慮すると上記２種類の微生物からATPを抽
出する方法としてはトリクロロ酢酸法，エタノール法が
有効であることが明らかとなった。
能で抽出後の操作が簡易であるトリクロロ酢酸法，エタ
ノール法,CTAB法が優れており、表−２からATP抽出効率
においては、トリクロロ酢酸法，エタノール法，過塩素
酸法が優れていることがわかった。従って、操作性,ATP
抽出効率を考慮すると上記２種類の微生物からATPを抽
出する方法としてはトリクロロ酢酸法，エタノール法が
有効であることが明らかとなった。
また生物発光測定への抽出方法の影響（抽出操作によ
る発光量の低下の大きさを示したもの）は表−３に示す
結果となったが、生物発光測定への影響は、抽出操作を
同様に行った検量線を作成することにより補正できる。
る発光量の低下の大きさを示したもの）は表−３に示す
結果となったが、生物発光測定への影響は、抽出操作を
同様に行った検量線を作成することにより補正できる。
（活性汚泥中微生物のATP抽出及び測定） 次に活性汚泥を試料とし、先の実験で選択したトリク
ロロ酢酸，エタノールを抽出剤とした実験を行うと共
に、これらの実験結果と従来行っていたボイリングトリ
ス法による実験結果とを比較した。
ロロ酢酸，エタノールを抽出剤とした実験を行うと共
に、これらの実験結果と従来行っていたボイリングトリ
ス法による実験結果とを比較した。
先ずトリクロロ酢酸を抽出剤として用いた例について
述べると、活性汚泥懸濁液0.5mlを試験管に分取し、こ
の試験管に５％のトリクロル酢酸（TCA）0.5mlを加え
て、ボルテックスミキサーで10秒間撹拌振盪する。なお
TCAの濃度単位として用いている「％」については、１
％が0.01g/mlの意味である。更に0.1Mトリス−4mM EDTA
緩衝液（pH7.75）9mlを加え、この反応液0.5mlを測定装
置専用のバイヤルビンに分取し、発光試薬を含む反応試
薬を0.5ml自動的に分注して、分注直後から30秒間の発
光量を計測する。
述べると、活性汚泥懸濁液0.5mlを試験管に分取し、こ
の試験管に５％のトリクロル酢酸（TCA）0.5mlを加え
て、ボルテックスミキサーで10秒間撹拌振盪する。なお
TCAの濃度単位として用いている「％」については、１
％が0.01g/mlの意味である。更に0.1Mトリス−4mM EDTA
緩衝液（pH7.75）9mlを加え、この反応液0.5mlを測定装
置専用のバイヤルビンに分取し、発光試薬を含む反応試
薬を0.5ml自動的に分注して、分注直後から30秒間の発
光量を計測する。
更に表−１に示した条件においてBTBとエタノールと
を用いて同様な試験を行った。
を用いて同様な試験を行った。
これらの試験結果は表−４に示すとおりである。ただ
しTCA法で得られた値を100％として、ATP抽出効率を相
対的に示している。
しTCA法で得られた値を100％として、ATP抽出効率を相
対的に示している。
以上の結果から活性汚泥中のATP抽出にTCAを用いた場
合には、エタノールを用いる方法やボイリングトリス法
に比べてATP抽出効率が高いことがわかる。
合には、エタノールを用いる方法やボイリングトリス法
に比べてATP抽出効率が高いことがわかる。
またサンプル希釈試験の結果、MLSS（活性汚泥浮遊物
質）濃度と抽出ATP濃度との間には第１図に示すように
良好な直線関係が成立した。
質）濃度と抽出ATP濃度との間には第１図に示すように
良好な直線関係が成立した。
以上において抽出したATPについては、生物発光法や
化学発光法を利用して、その発光量を吸光光度法や蛍光
光度法により測定することができる。
化学発光法を利用して、その発光量を吸光光度法や蛍光
光度法により測定することができる。
G.発明の効果 本発明によれば、トリクロロ酢酸を用いて活性汚泥中
微生物に含まれるATPを抽出しているため、実験例から
わかるように、抽出を室温で行うことができる上、操作
が簡便であり、しかも操作時間が１〜２分と短く、ATP
の抽出効率が高い。
微生物に含まれるATPを抽出しているため、実験例から
わかるように、抽出を室温で行うことができる上、操作
が簡便であり、しかも操作時間が１〜２分と短く、ATP
の抽出効率が高い。
第１図はMLSSとATP濃度との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】活性汚泥液にトリクロロ酢酸溶液を抽出剤
として加え、これにより活性汚泥中の微生物に含まれる
アデノシン三リン酸を抽出することを特徴とする微生物
中のアデノシン三リン酸の抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1109486A JP2762553B2 (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 微生物中のアデノシン三リン酸の抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1109486A JP2762553B2 (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 微生物中のアデノシン三リン酸の抽出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02290299A JPH02290299A (ja) | 1990-11-30 |
| JP2762553B2 true JP2762553B2 (ja) | 1998-06-04 |
Family
ID=14511466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1109486A Expired - Fee Related JP2762553B2 (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 微生物中のアデノシン三リン酸の抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2762553B2 (ja) |
-
1989
- 1989-04-28 JP JP1109486A patent/JP2762553B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02290299A (ja) | 1990-11-30 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080327 Year of fee payment: 10 |
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