JP4695818B2 - 微生物汚染試験方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ATP指標を利用した食品の衛生管理に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
食品の検査方法はその大要が食品衛生検査指針として集約され、食品の細菌学的成分規格として、食品別に細菌数及び大腸菌群数が規格化されている。さらに、都道府県で食品項目別に、生菌数、大腸菌群数、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌等の細菌数の指導基準を設けて行政指導を行っている。尚、これらの検査法は、いずれも培養法である(例えば非特許文献1参照)。
【0003】
【非特許文献1】
石関忠一,「医薬品・化粧品の微生物汚染試験法(第2報)」,医薬品研究,1973,4(2),175
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
検査法が培養法であるため、検査結果がでるまでには数日を要する。また、計数する場合には、大抵の場合、試験者が目視によって細菌のコロニー(集落)を計数するため、正確であると言い難い。
【0005】
本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は、微生物汚染の確認を効率的かつ正確に行う微生物汚染試験方法の提供にある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は以下のことを特徴とする。
【0007】
請求項1の微生物汚染試験方法は、微生物増殖培地に試料を添加して一定時間培養させた培地を超音波処理して培地内のフロックを分散させた後に、この培地にATP抽出試薬を添加して抽出したATPの濃度を測定し、この測定結果に基づき試料のカビ類を含む微生物による汚染を確認することを特徴とする。
【0009】
請求項2の微生物汚染試験方法は、請求項1の微生物汚染試験方法において、前記培養の時間は15時間以上であることを特徴とする。
【0011】
従来の微生物汚染検査法は、培養法に基づくもので、試験者が目視によって細菌のコロニー(集落)を計測するため、正確性に欠けるが、請求項1及び2の微生物汚染試験方法は、微生物汚染の指標にATP濃度を採用しているので、短時間で再現性よく微生物汚染の確認ができる。特に、ATPが抽出される前に、試料が一定時間超音波処理することで、カビのフロックが分散されるので、試料のカビ類汚染を正確に確認できる。また、ATP濃度測定は、市販の試薬キット及び発光測定装置を用いればよい。したがって、試料の簡易的かつ大量分析が可能となる。
【0012】
【発明の実施の形態】
以下、図面に基づき本発明の実施形態について述べる。
【0013】
図1は本発明の検査プロセスの概略説明図で、図2はATP濃度測定の基本原理の概略説明図である。
【0014】
1.基本原理
アデノシン三リン酸(ATP)は、生物が生活するために、必要な代謝活性物質で、生きている微生物には必ず存在し、死んでいる微生物には存在しない。しかも、ATPという物質は、微生物の活性が高いほど多く含まれていることがわかっている。図2に示したように、ATPは、ルシフェラーゼ(酵素)、酸素、マグネシウムイオンの存在下で、ルシフェリン(発光物質)と反応して光を放出する。この反応において、理論的には、ATP1分子に対して光が1個放出される。そして、微生物のATP含有量は生物種によりやや異なるが、凡そどのような微生物でも、乾燥重量1g当り1/1000グラムの割合でATPをもっていることがわかっている。したがって、光の個数(発光量)を計測すれば、ATPの個数(濃度)すなわち微生物量(微生物の活性度)を求めることができる。
【0015】
本発明の検査では、大腸菌類、一般細菌類またはカビ類の汚染確認ができる。これは、食品の検査法はその大要が食品衛生検査指針として集約され、食品の細菌学的成分規格として、食品別に細菌数、大腸菌群数が規格化されていることに基づくものである。尚、一般細菌とは、中温性好気性菌を意味する。
【0016】
2.検査プロセス
(1)試料調製 乾熱滅菌処理したアルミ管付試験管に、計り採った試料を無菌的に投入する。このとき、試料は滅菌処理蒸留水によって適宜希釈処理される。次に、乾熱滅菌処理した三角フラスコに、オートクレーブで滅菌処理した増殖培地を無菌的に所定量投入する。次いで、この三角フラスコに前記試験管から所定量の試料を無菌的に投入し、試料と培地を攪拌混合する。そして、この三角フラスコを培養器(インキュベータ)に供し、所定の温度のもと、一定時間、静置培養する。尚、増殖培地としては、例えばSCD培地(ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地(大日本製薬製)等がある。また、培養時間は、15時間以上に設定される。
【0017】
(2)発光量測定 発光量の測定は、ATP抽出工程と発光反応工程とデータ処理工程とを有する(図1参照)。
【0018】
1)ATP抽出工程 微生物(大腸菌類、一般細菌類、カビ類)の体内にはATPが存在しているため、試料中のATP濃度を調べることで、試料の微生物汚染を確認できる。この工程では、ATPをルシフェリンやルシフェラーゼと反応できるようにするため、試料中からATPを抽出する。すなわち、採取した試料にトリクロロ酢酸を主成分とした抽出試薬を添加して、ATPを抽出する。このとき、生物発光反応に及ぼす影響を最小限に抑えるために、希釈液が添加される。前記希釈液としては、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を含むトリス緩衝液等がある。
【0019】
また、カビ類を含む微生物の汚染を確認する場合は、試料を超音波処理するとよい。カビは通常フロック状態で存在するので、ATPの抽出効率が悪く、カビの菌体数とATP濃度とに相関性が得られない。したがって、試料中のカビの汚染が確認できない場合がある。そこで、ATPを抽出する前に、試料を一定時間超音波処理することで、カビのフロックは分散されるので、試料のカビの汚染を正確に確認できる。尚、超音波処理時間は、概ね3分とするとよい。
【0020】
2)発光反応工程 前記抽出工程によってATPを抽出した試料に、発光試薬(ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Mg2+)を添加して、試料中のATPと発光試薬とを反応させる。そして、この反応により発生した光を光センサーで一定時間(例えば30秒間)計測する。光センサーは、光電子増倍管を備えたものを用いる。尚、ATP測定試薬キット及び光センサーは、市販のものでよい。例えば、ATP測定試薬キットとしては、ルシフェールAS(明電舎製)等がある。また、光センサーとしては、ルミノメータUPD−4000(明電舎製)等がある。
【0021】
3)データ処理工程 種々の濃度に調製した既知濃度のATP溶液(ATP標準液)を測定し、標準曲線(検量線)を作成する。そして、試料の測定結果から得られる発光量に対するATP濃度を検量線から読み取り、試料中に含まれる微生物中のATP量を測定する。これにより、微生物の汚染度が確認できる。
【0022】
以上述べた実施形態の実施例を以下に示す。
【0023】
(参考例1)試料中の大腸菌類汚染の確認
図3は、大腸菌(Escherichia coli 1649T)とATP濃度の関係を示した特性図。本実施例では、試料0.25mlに5%のトリクロロ酢酸を主成分とした抽出試薬0.25mlを混合し、さらに生物発光反応に及ぼす影響を最小限に抑えるために、希釈液(4×10-3mol/lのEDTAを含む0.1mol/lのトリス緩衝液、pH7.75)4.5mlを添加した。発光反応工程では、抽出操作によりATPを抽出した試料(ATP抽出液)5mlから0.5mlを分取して、これに発光試薬(ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Mg2+)0.5mlを添加して、試料中のATPと発光試薬とを反応させた。
【0024】
図示された結果から明らかなように、大腸菌数(個/ml)とATP濃度(mol/l)の関係は比例関係にあり、試料のATP濃度から大腸菌類の汚染を確認することができる。
【0025】
(参考例2)試料中の一般細類汚染の確認
図4は、Pseudomonas fluorescens IAM12022の菌数(個/ml)とATP濃度(mol/l)の関係を示した特性図である。また、図5は、Bacillus megaterium IAM1166の菌数(個/ml)とATP濃度(mol/l)の関係を示した特性図である。一般細菌は、グラム陰性菌とグラム陽性菌に大別される。ここでは、グラム陰性菌にPseudomonas fluorescens IAM12022、グラム陽性菌にBacillus megaterium IAM1166を選定したこと以外は、参考例1と同じ測定操作とした。図4及び図5に示された結果から明らかなように、グラム陰性菌及びグラム陽性菌とATP濃度との関係が比例関係にあり、試料のATP濃度からグラム陰性菌数及びグラム陽性菌数すなわち一般細菌数の汚染を確認することができる。
【0026】
(実施例1)試料中のカビ類汚染の確認
図6は、カビ(Asperillus oryzae)の菌体数とATP濃度の関係を示した特性図である。ここでは、試供菌体にAsperillus oryzaeを選定し、試料に超音波を3分間照射した後、ATPの抽出したこと以外は、参考例1と同じ測定操作とした。図示された結果から明らかなように、菌体数とATP濃度の関係が比例関係にあり、ATP濃度からカビ類の汚染を確認することができる。
【0027】
(参考例3)培養による大腸菌数変化
図7は、培養による大腸菌数の経時的変化を示した特性図である。ここでは、標準大腸菌株(Escherichia coli 1649T)を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、数個/ml、数十個/ml、数百個/mlに調製して、それぞれ増殖培地(SCD培地(ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地,大日本製薬製))で10時間、20時間及び40時間培養した後にATP濃度を測定したこと以外は、参考例1と同じ測定操作とした。図示された結果から明らかなように、初期大腸菌数が数個/mlであっても、約15時間以上培養すれば、大腸菌数は109個/ml程度まで増加し、ATP濃度が定量できることがわかる。
【0028】
(参考例4)培養による一般細菌数変化
図8は、Pseudomonas fluorescens IAM12022の菌体数の経時的変化を示した特性図である。また、図9は、Bacillus megaterium IAM1166の菌体数の経時的変化を示した特性図である。ここでは、グラム陰性菌にPseudomonas fluorescens IAM12022、グラム陽性菌にBacillus megaterium IAM1166を選定し、それぞれの細菌を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、数個/ml、数十個/ml、数百個/mlに調製し、この各調製液を各増殖培地(SCD培地)に添加した後、10時間、20時間及び40時間培養してからATP濃度を測定した以外は、参考例1と同じ測定操作とした。図8及び図9の結果から明らかなように、初期の一般細菌数が数個/mlであても、約15時間以上培養すれば、一般細菌数が109個/ml程度まで増加し、ATP濃度が定量できることがわかる。
【0029】
(実施例2)培養によるカビの菌体数変化
図10に、カビの菌体数の経時的変化を開示した。ここでは、試供菌体にAsperillus oryzaeを選定し、数個/ml、数十個/ml、数百個/mlに調製して、それぞれの細菌を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、この各調製液を各増殖培地(SCD培地(ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地,大日本製薬製))で10時間、20時間及び40時間培養した後にATP濃度を測定したこと以外は、参考例1と同じ測定操作とした。図に示された結果から明らかなように、初期の菌体数が数個/mlであても、約15時間以上培養すれば、菌体数が109個/ml程度まで増加し、ATP濃度が定量できることが確認できる。
【0030】
(実施例3)カビ菌体中のATP測定に及ぼす超音波照射の効果
図11は、超音波照射時間と増殖培地(SCD培地(大日本製薬製))で一定時間培養した後の菌体数との関係(実線)及びATP濃度の関係(破線)を示したものである。ここでは、超音波でフロックを分散させた場合のカビ数とATP濃度の関係について検討した。試供菌体はAsperillus oryzaeを選定し、培養時間は17時間とした。図示された結果から明らかなように、3分間程度の超音波照射をすれば、カビ菌体のフロックが分散し、ATP濃度を正確に測定できることが確認できる。
【0031】
(実施例4)カビ菌体中のATP測定に及ぼす超音波照射の効果
図12は、超音波照射時間と増殖培地(SCD培地(大日本製薬製))で一定時間培養した後の菌体数との関係(実線)及びATP濃度の関係(破線)を示したものである。ここでは、試供菌体にAsperillus nigerを選定し、培養時間は17時間とした。図示された結果から明らかなように、3分間程度の超音波照射をすれば、カビ菌体のフロックが分散し、ATP濃度を正確に測定できるが確認できる。
【0032】
(実施例5)香料中の微生物汚染検査
実際の食品中の衛生管理がATP指標で可能かどうかを調べるために、17種類の香料についてATP濃度の測定を行った。培養時間は、1日の内で通常、夕方に製品が製造されることが多いと想定されるので、夕方4時から就業時間が開始される翌日の朝9時までの、17時間とした。以下に実験条件を記載した。
【0033】
培養時間 17時間
培 地 増殖培地(SCD培地(大日本製薬製))
培 養 30℃のもとで静置培養
希釈倍率 試料1ml/培地50ml
1)試料調製 乾熱滅菌処理したアルミ管付試験管に、オートクレーブで滅菌処理した蒸留水を5ml入れたものを18本(ブランク1本を含む)用意した。各試験管には、試料名または番号をラベルした。そして、各試料(17本)を天秤で5g秤量し、それぞれの試験管に入れて、試験管ミキサー(ボルテックスミキサー)で10秒間程度攪拌した。また、乾熱滅菌処理した100mlの三角フラスコを18個用意して、予め調製したオートクレーブで滅菌ずみの増殖培地(SCD培地)をそれぞれの三角フラスコに50mlづつ分取した。そして、各三角フラスコに、試料を1mlづつを入れ、各試料とSCD培地とを混和した。
【0034】
2)発光量測定 次に、前記の各三角フラスコを30℃のもと17時間静置培養した後、ATP測定試薬キット(ルシフェールAS(明電舎製))を使用して、生物発光・化学発光測定装置(ルミノメータUPD−4000(明電舎製))で30秒間の発光量を計測した。
【0035】
図13は、一般生菌数とATP濃度の関係を示したものである。特に、17種類の香料について、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数を手分析で測定した結果のうち、一般細菌数と、一般細菌、大腸菌群及びカビ類の合計に含まれるATP濃度の関係を示したものである。
【0036】
17種類の香料について、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数を手分析で測定した結果、一般細菌数は5種類が0個/mlで、残り12種類が40〜6200個/mlであった。大腸菌群数は17種類全てが0個/mlであった。また、カビ菌体数は15種類が0個/mlで、残り2種類がそれぞれ10個/mlと13個/mlであった。
【0037】
図13に示された結果から明らかなように、ATP濃度が1.0×10-9mol/l以下であれば、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数のいずれも存在しないと判断できることが確認できる。
【0038】
以上のように、従来の培養法では、測定結果がでるまでに、一般細菌数と大腸菌群数は2日間、カビ菌体数は5日間を要したが、本発明の微生物汚染試験法によると、ATPを指標とすることにより、20時間程度の短時間で微生物汚染の確認が可能となる。したがって、ATP指標が食品等の衛生管理に適用できると考えられる。
【0039】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明は以下の効果を奏する。
【0040】
従来の微生物汚染試験方法では、測定結果がでるまでに、一般細菌数と大腸菌群数が2日間、カビ数が5日間要していたが、本発明の微生物汚染試験方法は、ATP指標を採用しているので、20時間程度の短時間で食品の微生物汚染の確認ができる。
【0041】
また、培養法は操作が煩雑であり試料の大量分析が困難であるが、本発明は、市販の試薬キット及び発光測定装置を用いればよいので、試料の簡易的かつ大量分析が可能となる。
【0042】
従来の微生物汚染検査法は、培養法に基づくもので、試験者が目視によって細菌のコロニー(集落)を計数するため、正確性に欠けるが、本発明は再現性よくATPを測定することができる。
【0043】
このように、本発明によれば微生物の汚染度を効率的かつ正確に把握できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の検査プロセスの概略説明図。
【図2】ATP濃度測定の基本原理の概略説明図。
【図3】大腸菌(Escherichia coli 1649T)とATP濃度の関係を示した特性図。
【図4】細菌(Pseudomonas fluorescens IAM12022)の菌数(個/ml)とATPP濃度(mol/l)の関係を示した特性図。
【図5】細菌(Bacillus megaterium IAM1166)の菌数(個/ml)とATP濃度(mol/l)の関係を示した特性図。
【図6】カビ(Asperillus oryzae)の菌体数とATP濃度の関係を示した特性図。
【図7】培養による大腸菌数の経時的変化を示した特性図。
【図8】細菌(Pseudomonas fluorescens IAM12022)の菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図9】細菌(Bacillus megaterium IAM1166)の菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図10】菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図11】超音波照射時間と増殖培地で17時間培養した後のカビ(Asperillus oryzae)菌体数との関係(実線)及びATP濃度の関係(破線)を示した特性図。
【図12】超音波照射時間と増殖培地で17時間培養した後のカビ(Asperillus niger)菌体数との関係(実線)及びATP濃度の関係(破線)を示した特性図。
【図13】香料中の一般生菌数とATP濃度の関係を示した特性図。
Claims (2)
- 微生物増殖培地に試料を添加して一定時間培養させた培地を超音波処理して培地内のフロックを分散させた後に、この培地にATP抽出試薬を添加して抽出したATPの濃度を測定し、この測定結果に基づき試料のカビ類を含む微生物による汚染を確認することを特徴とする微生物汚染試験方法。
- 前記培養の時間は15時間以上であることを特徴とする請求項1に記載の微生物汚染試験方法。
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