HU218156B

HU218156B - Mikrobiológiai vizsgáló módszerek, berendezés és reagensek

Info

Publication number: HU218156B
Application number: HU9502220A
Authority: HU
Inventors: David James Squirrell
Original assignee: The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2000-06-28
Also published as: ATE170222T1; DE69412790D1; AU5841794A; DE69412790T2; CA2154462A1; GB9301118D0; ES2120006T3; HU9502220D0; AU677627B2; EP0680515A1; WO1994017202A1; CA2154462C; CN1119029A; DK0680515T3; CN1061378C; BR9406417A; HUT72396A; EP0680515B1; NZ259576A

Abstract

A találmány tárgya eljárás mikroorganizmusok és/vagy intracellulárisanyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének egy mintában valómeghatározására, amely eljárás abban áll, hogy meghatározzák adenilát-kináz- tartalmukat annak a képességnek az alapján, hogy az azadenozin-difoszfátot (ADP) adenozin-trifoszfáttá (ATP) képesalakítani, és ezt arányba állítják a mikroorganizmusok és/vagyintracelluláris anyagaik jelenlétével és/vagy mennyiségével. Atalálmány szerinti eljárás érzékenyebb, mint az ismertluciferáz/luciferin vizsgálat. A találmány tárgyát képezi még egytisztított ADP-t és adenilát-kináz-mentes luciferázt tartalmazóvizsgálati kit, és a módszer automatikus végrehajtására szolgálóberendezés is. ŕ

Description

A találmány tárgyát mikroorganizmusok kimutatására szolgáló módszerek, valamint ezen módszerek megvalósításához szükséges berendezés és lényeges reagenseket tartalmazó vizsgálati kitek képezik.

Minden élő organizmus felhasznál adenozin-trifoszfátot (ATP) mint kémiai energiaforrást, és ismeretes, hogy ez vizsgálható az ATP által irányított luciferáz/luciferin reakcióval. Az ennek az enzimes reakciónak során képződő fény luminométer alkalmazásával mérhető, és a jelen lévő ATP mennyiségével arányos. Az ATP-nek a mikrobaszám Indexeként való hasznosságát már az 1960-as évek közepe óta ismerik [lásd az ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), szerk.: Stanley és munkatársai; Blackwell Scientific Publications, London, 1-10. oldal szakirodalmi helyen]; fő előnye gyorsasága és érzékenysége. Ennek a vizsgálati módnak az alkalmazásával az egyszerű minták néhány perc alatt elemezhetők, míg a komplex minták esetén a rutinvizsgálat csak fél óra, és a kimutatási határ 10¹² mol/1 ATP. Mégis szükséges egy olyan módszer, amely a mikroorganizmusok vagy tartalmuk kimutatásánál még érzékenyebb, miközben megőrzi gyorsaságát és könnyű megvalósíthatóságát.

Azt találtuk, hogy a fenti ATP-alapú eljárás gyorsasága és érzékenysége jelentősen fokozható, ha a vizsgálat céljaként nem az ATP-t tekintjük, hanem az ezt létrehozó enzimet, az adenilát-kinázt. Az adenilát-kináz egy olyan enzim, amelyet minden organizmus felhasznál adenozin-difoszfátnak (ADP) adenozin-trifoszfáttá (ATP) való alakítására. Ennek az enzimnek az ATP helyett való célbavétele egy, a találmány szerinti előnyös eljárással, berendezéssel és kitekkel lehetővé teszi, hogy a legalább 10²⁰ mól mennyiségben jelen lévő adenilát-kináz intracelluláris markert kimutassuk.

Az adenilát-kináz vizsgálatára ismeretes a luciferáz/luciferin rendszer (Brolin és munkatársai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1, 163-169 (1979)] alkalmazása az adenilát-kináz meghatározására bizonyos emlős- és növényi szövetekben [Rodionova és munkatársai, Fiziologiya Rastenii, 25,4, 731-734 (1978)]. Nem javasolták azonban ennek a vizsgálati rendszernek az alkalmazását mikroorganizmusokra, és az ilyen alkalmazás előnyei, azaz az általa elért fokozott érzékenység nem volt releváns az enzimmel foglalkozók számára sem.

Bár az adenilát-kináz kisebb mennyiségben van jelen, mint az ADP vagy ATP, ennek mikroorganizmusok biológiai markereként való aktivitása jellemzően 400 000-szeres érzékenységfokozódást jelent az enzimnek az általa termelt ATP révén való mérésével; mivel minden jelen lévő mólnyi enzim 400 000 mól ADP-nek ATP-vé való alakulását eredményezi 10 perces inkubálás alatt. így az enzim mennyiségének mérése a szubsztrát vagy annak a terméknek a mérésével, amelynek reakcióját katalizálja, 10^-20 mól értékig csökkentheti a kimutathatósági határt.

A találmány egy első szempontja szerint eljárást nyújt mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározására egy mintában, amely eljárás a jelen lévő adenilátkináz mennyiségének meghatározásán alapszik annak a képességének az alapján, hogy az adenozin-difoszfátot (ADP) adenozin-trifoszfáttá képes alakítani az organizmus és/vagy intracelluláris anyaga jelenlétével vagy mennyiségével arányosan. Ez az átalakulás ADP-nek a mintához való adagolásával válik lehetővé.

Az adenozin-trifoszfátot (ATP) előnyösen lucifeητι/luciferáz rendszer alkalmazásával mutatjuk ki, hogy a mintában jelen lévő ATP mennyiségét jelző, fotometriásan érzékelhető jelet nyeljünk. A luciferin/luciferáz készítmények és ezeknek ATP vizsgálatában való alkalmazási módszerei szakember számára jól ismertek, a reagensek kereskedelmi forgalomban kaphatók (lásd például Brolin és munkatársai). Egy jellemző készítmény például 0,1-10 mg/liter luciferázt, 15-1000 pmol/l Dluciferint és egyéb szereket, például MgCl₂-t, EDTA-t, BSA-t és pH=7-es puffért tartalmaz (lásd például a 054676 számú európai szabadalmi leírásban).

Mint minden sokszorozási vizsgálatban, az adenilái-kináz-vizsgálat érzékenységét a reagensek tisztasága korlátozza. Ebben az esetben a jellemző szennyezők az ADP-szubsztrátban jelen lévő ATP, valamint a lucife 'ázkészítményben jelen lévő adenilát-kináz. Ahhoz, hogy a módszert mikroorganizmusok érzékeny meghatározására használhassuk, különösen abban az esetben, ha ezek a mikroorganizmusok lehetségesen károsak és kisszámú jelenlétüket is ki kell mutatni, szükséges, hogy a reagensek tisztasága azokra az anyagokra vonatkozóan, amelyekkel a vizsgálatban reagáltatni kell őket, a lehető legnagyobb legyen. A foszfátpuffer nem tartalmaz ATP-t.

Az első probléma tekintetében a kereskedelmi forgalomban kapható nagy tisztaságú ADP-t (>99,5% tisztaság) előnyösen további oszlopkromatográfiás tisztítás után használjuk. Ez azért kívánatos, mert még igen kis ATP-szennyezés is elegendő lehet ahhoz, hogy nagy háttér értékeket eredményezzen. Például dietil-aminoet .l-cellulóz-oszlop és 0,02 mmol/l-es hidrogén-klorideliens alkalmazásakor az ATP lassabban eluálódik az oszlopról, mint az ADP, így lényeges elválasztást tesz lehetővé. Hasonló hatású lehet más kromatográfiás közeg és eluens kombinációja. A kezdeti nagy ADP: ATP arányú frakciókat tesszük félre felhasználásra. A tisztaságot az ADP-szint mérése esetén adenilát-kináz hatása után luciferin/luciferáz reagenssel kiváltott biolumineszcencia alapján, az ATP-szennyeződés mennyiségének mérésével ugyanígy, de adenilát-kináz alkalmazása nélkül határozzuk meg. Az ATP-nek az ADP-szubsztráttól való eltávolítására további módszerként alkalmazhatunk az ATP-t fajlagosan lebontó enzimeket, például luciferázt vagy apirázt. Ezek az enzimek használhatók a kromatográfiásan tisztított ADP további tisztítására, vagy - más módon - az enzimesen tisztított ADP kezelhető oszlopkromatográfiás eljárással. Megjegyezziik, hogy az apiráz ADP-áz is, de mivel jóval aktívabb ATP iránt, és mivel az ADP jóval magasabb mennyiségben van jelen, mint az ATP, ez nem képez jelentős problémát.

A második problémát tekintve az adenilát-kináz, mint egy lényeges „háztartási” enzim, minden organiz2

HU218 156 Β musban jelen van, és általában jelen van a luciferázkészítményekben. Csak kis szennyeződésként fordul elő, de mivel a cél a minták igen alacsony adenilátkináz-szintjeinek meghatározása, e szennyeződés jelenléte a luciferázban korlátozó tényező lehet. A luciferáz és az adenilát-kináz molekulatömege jelentősen különböző, 61 kD, illetve 21 kD. Továbbá, a luciferáz egy membránhoz kötött protein, ezért viszonylag hidrofób, míg az adenilát-kináz oldható enzimként fordul elő. Ezért lehetséges az adenilát-kináz luciferázkészítményekből való eltávolítása például méretkizárásos kromatográfiás, fordított fázisú kromatográfiás eljárással vagy mindkettővel. Más megoldás szerint, vagy e mellett, a luciferáz adenilát-kináz-szennyeződésének problémája elkerülhető a biolumineszcens reagensek (luciferáz és luciferin) közvetlenül a mérés előtt, illetve a mérés során való adagolásával, hogy a szennyező adenilát-kináznak ne legyen ideje jelentős hatás kifejtésére.

Annak érdekében, hogy a célmikroorganizmussal kapcsolatos minden adenil-kinázt hozzáférhetővé tegyünk a találmány szerinti ADP és luciferáz/luciferin vizsgálati reagenseknek, szükséges lehet a mikroorganizmusok roncsolása, hogy intracelluláris anyaguk szabaddá váljon, vagy más módon hozzáférhetővé váljon a reagensek számára. Az ilyen roncsolás végrehajtható mechanikai eszközökkel, például ultrahanggenerátorral vagy ozmotikus sokk révén, amely adott esetben hideg sokkal társítható, vagy olyan szerekkel, mint a lizozim, vagy még célszerűbben detergensek alkalmazásával. Ilyen detergensek a kereskedelmi forgalomban kaphatók, szokásos megjelölésük „extrahálóanyagok”. Ilyen extrahálóanyagok többek között általában a kationos detergensek, például a CT AB (cetil-trimetil-ammónium-bromid) és saját anyagokat felszabadító anyagok, például Enzymatics® ATP, Biotrace® XM extrahálóanyag (Biotrace, Bridgend, UK) és Lumac® NRM (nukleotidfelszabadító szer, Lumac BV, Hollandia). Ha CTAB-t alkalmazunk, a készítmény célszerűen 0,01-1%, például CTAB-t tartalmaz vízben, de szakember más koncentrációkat is választhat.

így, mielőtt az ADP- és luciferáz/luciferin reagenseket hozzáadnánk ahhoz a vizsgálati mintához, amelyről feltételezzük, hogy mikroorganizmusokat tartalmaz, előnyös, ha ezeket intracelluláris tartalmuk luminometriás reagense számára való hozzáférhetőségének megkönnyítésére roncsolószerek alkalmazásával roncsoljuk. Ha azt kívánjuk, hogy a célsejteket és az olyan sejteket, mint a gombaspórák, meg tudjuk különböztetni, lehetőség van arra, hogy két külön vizsgálatot folytassunk, amelyek közül az egyikben csak a spórák és multicelluláris „szomatikus” állati sejtek roncsolására képes nemionos detergenst (például Triton® TX-100-t), a másikban kationos detergens „extrahálóanyagot” alkalmazzunk, amely utóbbit az előzőekben ismertettünk, és amely minden sejt roncsolására képes. Ezek a vizsgálatok ugyanazon a mintán elvégezhetők, ha a detergens/luciferáz/mérési ciklus között egy ATP-ázt, például apirázt adagolunk; az egyik ciklusban nemionos, a másikban kationos detergenst használunk az első cikluslépésben.

A találmány szerinti berendezésre jellemző, hogy eszközt tartalmaz a mikroorganizmus jelenlétére vizsgálandó, vizes szuszpenzió formájú minta befogadására, az ADP, a luciferáz és a luciferin szuszpenzióhoz való adagolására és a létrejött fény detektálására. Előnyösen a berendezés a detergens szuszpenzióhoz való adagolására szolgáló eszközt előbb tartalmazza, mint a luciferáz és luciferin adagolására szolgáló eszközöket. Előnyösen az ADP-t a luciferáz és luciferin adagolása előtt, például a detergenssel együtt adagoljuk, hogy időt hagyjunk az ATP-képződésre, de adagolhatunk minden reagenst együtt is, ha kisülési kinetikát alkalmazunk. Előnyösen a luciferáz/luciferin reagens(eke)t az ADP-től elkülönítve adagoljuk be.

Előnyösen a berendezés a szuszpenzióból a luciferáz és luciferin adagolásakor kibocsátott fény mennyiségének meghatározására szolgáló detektálóeszközt, és adott esetben egy komputerprocesszort tartalmaz, valamint egy vizuális kijelzőegységet a detektálóeszközből érkezei jel fogadására, amely a kibocsátott fény mennyiségének jelzésére, és ebből a mikroorganizmus esetleges jelenlétének és mennyiségének számítására és az eredmény kijelzésére alkalmas. Az ilyen számítás megkönnyíthető a processzor olyan programozásával, amely a bejövő jelek rendszerét veszi figyelembe, amelyek közül némelyik kontroll, beleértve a vakmintát, és a nemionos detergenssel végzett vizsgálat mintáját, vagy figyelembe veszi a betáplálást megelőző állandókat, például a hőmérsékletet.

Egy előnyös berendezés egy szállítószalagból áll, amely a mintát tartalmazó folyékony közeget egy vagy több reagensadagolótól a fénydetektáló eszközhöz viszi. így például egy szállítószalag egy sorozat mintatartóval van ellátva, előnyösen luminometriás tartóval, amelyek a mikroorganizmusok jelenlétére vizsgálandó anyag vizes szuszpenzióját tartalmazzák foszfátpufferben, vagy amelyek egy olyan adagoló előtt haladnak el amelyből ez a szuszpenzió bejut. Ezek a tartók lehetnek például nyitott tetejűek, és ezt követően elhaladhatnak a futószalagon egy detergensadagoló hely alatt, egy ADP- és egy luciferáz/luciferin adagolóhely alatt, majd áthaladnak a fénydetektor helyen. A fénydetektor lehet egy standard luminométer, például Biotrace Multi-lite vagy Biotrace M3.

A fény mérése történhet a mintatérfogatnak, például luminométercsőnek közvetlenül a luciferáz- és luciferinadagolás után, vagy azzal egyidejűleg a fény-detektorban való tartózkodása során. így egy előnyös berendezésben a luminometriás reagenst közvetlenül azt megelőzően adagoljuk be, hogy a minta belépne a fénydetektor helyre, vagy a fénydetektor helyen való tartózkodás során adagoljuk ezt a reagenst. Egy előnyös berendezés az emittált fényt azonnal méri a reagens adagolása után, majd ismételten méri meghatározott időtartam elteltével. Más megoldás szerint az emittált fényt egy megfelelően hosszú időtartamon át detektáljuk, hogy kumulatív értékeket nyerjünk, például ha kisüléskinetika mérésére használjuk.

A találmány szerinti vizsgálókit a találmány szerinti eljárás végrehajtásához szükséges lényeges reagense3

HU 218 156 Β két tartalmazza, azaz az adenozin-difoszfátot és luciferázt és luciferint. Előnyösen a kit mindezeket a reagenseket úgy tartalmazza, hogy a luciferáz és luciferin egyetlen reagensoldatként van jelen, és egy további detergens is jelen van a kitben, amely a vizsgálandó célsejtek roncsolására alkalmas. Szokásosan a mikroorganizmusok vizsgálatára csak kationos detergens szükséges, míg a gombaspórák és szomatikus sejtek vizsgálatának igénye esetén egy további nemionos detergens reagens is lehet a kitben ezek számának meghatározására. A kit egyetlen csomag formájában kerül kiszerelésre, és előnyösen a találmány szerinti eljárás végrehajtására vonatkozó instrukciókat is tartalmaz; a reagensek tartályokban vannak, és erősségük szerint közvetlen használatra vagy hígítás utáni használatra alkalmasak. A kit tartalmazhat foszfátpuffert is.

Egy előnyös találmány szerinti kit 99,95%-nál nagyobb tisztaságú ADP-reagenst és adenilát-kináz-aktivitástól lényegében mentes luciferázreagenst tartalmaz. Más megoldás szerint a luciferáz/luciferin arány, amely a kit felhasználási utasításaiból vagy relatív koncentrációiból látható, olyan, hogy a luciferáz elég gyorsan képes hatni a luciferinszubsztrátra ahhoz, hogy a luciferázzal kapcsolatos adenilát-kináz ATP-termelése akkor jelentkezik, amikor a kezdeti emisszió már lejátszódott; így a mikroorganizmus eredetű adenilát-kinázt villanásszerű kinetikai reakció jelzi, a szennyező DNS-t kisülés.

Az előnyös tisztított reagensek az előzőekben leírt eljárások szerint nyerhetők. Megjegyezzük, hogy az adenilát-kináz-aktivitás a luciferázból kiiktatható oly módon, hogy a luciferázt egy több hónapos vagy éves időtartamon át állni hagyjuk.

A találmány szerinti eljárásokat, berendezést, reagenseket és kiteket a következőkben példákra és ábrákra való hivatkozással mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül. További megvalósítási módok szakember számára ezek fényében nyilvánvalók.

1. ábra: az ábrán a 4. és 5. példák szerint vizsgált különböző mennyiségű E. coli esetén kapott növekvő percenkénti luminométer-beütésszámot mutatjuk be.

2. ábra: a 6. ábrában leírt berendezés folyamatábráját mutatja.

1. példa

Tisztított adenozin-difoszfát-reagens készítése

Kereskedelmi nagy tisztaságú (>99,95%) ADP (Sigma) további tisztítására folyadékkromatográfiás eljárást alkalmazunk. Kis oszlopokat készítünk 10 ml eldobható műanyag fecskendőtestből és üvegrost szűrőpapír (Whatman GF/A) karikákat helyezünk az oszlop belsejébe kijáratainak borítására. Kromatográfiás közegként dietil-amino-etil-cellulózt (Whatman DE-52) alkalmazunk, ezt gondosan töltjük be az egyes oszlopokba, és hagyjuk ülepedni, mintegy 4 ml-es ágytérfogatokat készítünk. Egy másik szűrőpapír karikát helyezünk az oszloptöltet tetejére.

Az oszlopot mintegy 15 ml eluenssel (0,02 mol/l-es HC1) mossuk, majd 100 mmol nagy tisztaságú ADP-t viszünk rá mintegy 0,5 ml 0,02 mol/l-es HCl-ban, és az eluálást 1 ml/perc sebességgel áramoltatott 0,02 mol/les HCl-alkalmazásával folytatjuk. Eldobható műanyag küvettákban 3-4 ml-es frakciókat szedünk, ezekben célszerűen mérhetjük az optikai denzitást (265 nm-nél), és ezáltal az ADP mennyiségét. Felhasználásra a kezdeti frakciókat őrizzük meg, amelyekben az ADP:ATP arány magas.

A tisztítás sikerességének ellenőrzésére kereskedelmi forgalomban kapható luciferin/luciferáz készítményeket (Enzymatrix, Cambridge, UK és HM, Biotrace, Biidgend, UK) alkalmazunk a gyártó utasítása szerint, hogy meghatározzuk a jelen lévő ATP mennyiségét. Hasonló vizsgálatokat végzünk adenilát-kináz jelenlétében az ADP mennyiségének meghatározására.

100 mmol/l-es kereskedelmi (Sigma) nagy tisztaságú ADP 1/3000-szeres hígításának 50 μΐ-e 8919 lum nométer-beütésszámot ad, ez az ATP-szennyeződés szintjének mértéke. 100 femtomól adenilát-kinázzal végzett inkubálást követően az azonos minta beütésszám.i 1 370 839, ez az ADP mennyiségére kapott érték. Egy ebből az ADP-oldatból kapott, oszlopon tisztított frakció ATP-beütésszáma 223, adenilát-kináz-beütésszáma 1 442 054 a fentivel azonos körülmények melleit. A háttérarányra vonatkozó jel ebben az esetben 153-ról 6466-ra javult.

2. példa

Adenozin-difoszfát-reagens készítésének más módja

Nagy tisztaságú ADP-t tovább tisztítunk a szennyező ATP-re apiráz hatását alkalmazva. Különböző fonásokból származó ADP-mintákból 0,1 mmol/l-es oldatokat készítünk. Az egyik minta (A) 98%-os tisztaságúként került forgalomba, a másik (B) 99%-osként. Kereskedelmi forgalomban kapható luciferin/luciferáz készítményeket alkalmazunk az ATP meghatározására, a luminométer-beütésszámok az A minta esetén 54 768, a B mintánál 305 500. Az A és B minták 0,1 mmol/l-es oldatainak 10-10 ml-éhez 8-8 pl 100 egység/ml-es apirázoldatot (burgonyaapiráz: Sigma) adunk. Az elegyeket szobahőmérsékleten mintegy 22 órán át inkubáljuk, majd felforraljuk az apiráz elbontására, az ezután kapott luminométer-beütésszámok 5100 az A, és 6600 a B mintára, ami azt mutatja, hogy a szennyező ATP mennyisége jelentősen csökkent.

3. példa

Szabad adenilát-kináz meghatározása

Adenilát-kináz-törzsoldatokat készítünk a vizsgálathoz 1 BSA-t és 0,25% Triton Χ-100-at tartalmazó, pH=7,2-es, foszfáttal pufferolt sóoldatban, és a vizsgálatot luminometriás célra alkalmas 3 ml-es eldobható műanyag csövekben végezzük. A vizsgálati csőbe 200 μΐ pH=7,8-as triszpuffert pipettázunk, és ehhez 100 μΐ, mintegy 1 mmol/l-es ADP-t (az előzőekben leírtak szerint tisztítottat) adunk. 10 μΐ pH=7,8-as triszpufferben hígított adenilát-kinázt adunk a csőbe, és ezzel megindítjuk a reakciót. A cső tartalmát keverjük, és szobahőmérsékleten inkubáljuk. 10 perces inkubálás után 100-150 μΐ luciferin/luciferáz reagenst adunk hoz4

HU 218 156 Β zá, és azonnal mérjük luminométerben az adenilát-kináz-aktivitás következtében képződött ATP-ből kibocsátott fényt (lásd az 1. táblázatban).

Megjegyezzük, hogy a vizsgálat érzékenysége növelhető, ha a reakcióközegben nagyobb ADP-koncentrációt alkalmazunk, mivel az adenilát-kináz K_m-értéke a millimól tartományba esik. A kereskedelmi forgalomban kapható, jelentős mennyiségű ATP-t tartalmazó ADP nemkívánatossá teszi az ilyen millimólos mennyiségű ADP alkalmazást, de a találmány szerinti tisztított ADP alkalmazásával ez a növelés előnyökkel jár. Hasonló módon növeli az érzékenységet az inkubálási idő növelése.

Az ismeretlen adenilát-kináz-mennyiségeket olyan kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg, amelyeket ismert adenilát-kináz-koncentrációk mellett 10 perces inkubálás során képződött ATP-értékek ismeretében veszünk fel. A vizsgálat érzékenysége miatt óvintézkedéseket célszerű tenni az ATP-vel vagy adenilát-kinázzal való véletlen szennyeződés elkerülésére. A vizsgálatokat lamináris áramlású fülkében végezzük ATPmentes oldatok, eldobható gumikesztyűk és alacsony ATP-tartalmú műanyag fogyóeszközök alkalmazásával, amennyiben lehetséges.

1. táblázat

A jelen lévő adenilát-kináz (AK) mennyisége és a kimutatott ATP-mennyiség közötti összefüggés: sokszorozás=képződött ATP/mol AK 10 perces inkubálás mellett

mól adenilát-kináz	pmol képződött ATP	Sokszorozás
1 femtomól	322	320 000
500 attomól	235	470 000
250 attomól	97,5	390 000
125 attomól	55,2	440 000
62 attomól	26,5	420 000
31 attomól	12,7	400 000
16 attomól	5,7	360 000
8 attomól	3,9	500 000
4 attomól	2,1	540 000
2 attomól	0,8	410 000
1 attomól	0,6	610 000
0,5 attomól	0,3	610 000

Tudatában kell annak lenni, hogy ha bizonyos organizmusok jelenlétének valószínűségét vizsgáljuk, a pontos mennyiségi meghatározás fokozható, ha a bennük várhatóan lévő adenilát-kináz mennyiségét megbecsüljük. Ezért legjobban használható az olyan kalibrációs görbe lehet, amelyet az adott sajátos célorganizmusok alkalmazásával veszünk fel.

4. példa

E. coli vizsgálata

Törzsoldatként 200 μΐ foszfáttal pufferolt, pH=7,4es törzsoldatban mintegy 2,2xlO⁷ mikroorganizmust tartalmazó, egyhetes E. coli folyékony tenyészetet alkalmazunk, és ezt egymást követő tízszeres hígításokban úgy hígítjuk, hogy 200 μΐ mintánként 10⁷ és 0,1 organizmus/minta koncentrációsort nyerjünk. A puffer adja az ATP-szintézishez szükséges foszfátreagenst.

Minden 200 μΐ-es mintát 3 ml-es luminométercsőbe viszünk, 10 μΐ 1 mmol/l-es ADP-t és 100 μΐ 0,1%-os vizes cetil-trimetil-ammónium-bromidot adunk hozzá, és a kapott elegyet szobahőmérsékleten 1 percig inkubaijuk. Az inkubálás befejeztével 100 μΐ öregített Biotrace HM-t (2 éves, kimutatható adenilát-kináz-aktivitást nem tartalmazó) adunk hozzá, és meghatározzuk első 10 másodperces időszakban, majd újabb 10 másodperces időszakonként 1 percig terjedő időig a kibocsátott fényt, hogy meghatározzuk a fény kumulatív módon való növekedését, Biotrace M3 luminométert alkalmazunk. A kezdeti jelértéket levonjuk a végső leolvasásból, így kapjuk a jel mértékét beütésszám/perc értékben.

Az egyperces inkubálás alatt kapott, a kontrollra nyert értéket meghaladó beütésszámérték az E. coli számmal a következő módon változott: 10⁶-39 297 cpm; 1<J⁵ —3199 cpm; 10⁴—189 cpm; 10³-67 cpm; 10²—26 cpm (cpm=beütésszám/perc).

További eredményeket az 1. ábrán mutatunk be.

Ismeretes, hogy az extrahálóanyag hatása a luciferáz/luciferin rendszerre fontos [Simpson és munkatársci, J. Biolumin Chemilumin 6(2) 97-106 (1991)]. Ismeretes, hogy a kationos detergensek potencírozzák a reakciót, de a luciferáz fokozatos inaktiválódását okozzak, míg az anionos detergensek gátolják a reakciót, a nemionos és az ikerionos detergensek ismerten széles tartományban potencírozzák a reakciót. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a detergens hatását E. coli sejtek adenilát-kináz-vizsgálata során, a vizsgálatok végrehajtásának fenti menetét annyiban megváltoztattuk, hogy különböző extrahálóanyagokat alkalmaztunk a 200 μΐ foszfáttal pufferolt sóoldatban lévő 10⁷ E. coli vizsgálatára.

A legmagasabb értékeket Lumac NRM alkalmazásával nyertük, míg CETAB alkalmazásakor 226 924 cpm értéket, két másik extrahálószer alkalmazásakor 79 280, il etve 29 280 cpm értéket értünk el. Ez nem meglepő S mpson és munkatársai felismerésének a fényében, ami a kationos és anionos detergensek luciferázra gyakorolt káros hatására vonatkozik; valószínűnek tekinthető, hogy ezek a reagensek, amelyeket ATP-vizsgálatra szántak csak luciferáz/luciferin alkalmazásával, gátló hatással bírnak az adenilát-kinázra.

5. példa

E. coli-vizsgálatban kimutatott adenilát-kináz lokalizációja

Annak érdekében, hogy a 4. példa szerinti vizsgálatban kimutatott adenilát-kináz lokalizációját meghatározzuk, meghatároztuk friss, mosatlan E. coli sejtek, friss mosott sejtek, 3 napon át 37 °C hőmérsékleten tárolt mosatlan sejtek és a friss sejtek tápközegének, mint mintának a beütésszám/perc értékét. A vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az adenilát-kináz többsége

HU 218 156 Β intracelluláris, kevesebb, mint 10%-a jut a tápközegbe, és az adenilát-kináz-szintek nem változnak jelentősen a sejt korával (lásd az 1. ábrán).

6. példa

A találmány szerinti berendezés

A találmány szerinti berendezés egy 2 nyitott tetejű luminométercsövek tartására alkalmas, ráerősített állvánnyal bíró 1 köijáratú szállítószalagból áll, amelynek mentén több reagensadagoló hely van elhelyezve a szalag haladási irányának különböző pontjain. A vizsgálandó mintát tartalmazó 2 luminométercsöveket a szalag kezdetén helyezzük a szállítószalagra, és az első adagolóhelyen egy komputerrel szabályozott 3 perisztaltikus pumpa működése révén adagoljuk a 4 kationos detergenst és az 5 ADP-reagenst, ezekből a szükséges 100 μΐ, illetve 10 μΐ mennyiséget adagoljuk. A körjáratú szállítószalag haladásának irányában a csövet a 6 luminométerhelyhez juttatja, ahol egyidejűleg 100 μΐ luciferáz/luciferin reagenst (például Biotrace HM-t) adagolunk egy komputerrel szabályozott perisztaltikus pumpa segítségével a 8 tárolóból. A cső legalább 1 percnyi utat tesz meg a detergens/ADP adagolóhelytől a luminométer/luciferáz/luciferin adagolóhelyig, hogy ezzel lehetőség legyen a mikroorganizmus roncsolására és az ATP-szintézisre.

A luciferáz/luciferin reagens hozzáadása után a cső 70 másodpercig a luminométerhelyen marad, mialatt hét leolvasás történik 10 másodperces időközönként, a 10 másodperc után kapott kumulatív értéket levonjuk a 70 másodperc után kapott hasonló beütésszám/perc értékből. A számítást egy, a berendezéssel kapcsolt 9 komputer végzi, amelybe a luminométerből kapott beütésszám/perc jelet betápláljuk, és a szállítószalagon haladó egyes csövekre vonatkozó eredmények egy 10 vizuális kijelzőegységen jelennek meg. Ily módon a komputer képes arra, hogy a reagensnek egy ismert csőhöz való adagolási idejét szabályozza, hogy kívánt esetben az inkubációs időt változtassa.

7. példa

A találmány szerinti vizsgálati kit

A találmány szerinti vizsgálati kit egy, az 1. vagy 2. példa szerint készített 10 mmol/l-es (vagy a 4. példában leírt eljárás szerint, az érzékenység fokozására ennél nagyobb koncentrációjú) tisztított ADP-oldatot (>99,95% tisztaságú) tartalmazó tartályt, egy öregített luciferáz/luciferin oldatot (Biotrace HM) tartalmazó tartályt és egy 0,1%-os vizes cetil-trimetil-ammónium-bromidot tartalmazó tartályt tartalmaz, amelyek mindegyike egybe van csomagolva egy utasítással együtt, amely a találmány szerinti eljárás megvalósítási módjára vonatkozik. Mobil laboratóriumokban való alkalmazás céljára a csomagolás lehet olyan formájú, hogy egy műanyag doboz az egyes tartályok rugalmas tárolását biztosítja, azaz habtöltettel bír, és a tartályok külső formájának megfelelő alakú bemélyedésekkel ellátott.

Adott esetben a csomagolás tartalmaz egy nemionos detergensoldat- (0,2%-os Triton X-100 vagy ekvivalense) tároló tartályt és/vagy egy ATP-ázt, például apirázt tartalmazó tartályt a nemionos detergens által egy mintából szabaddá tett ATP elbontására, hogy alkalmassá tegyük a mintát kationos detergens adagolása utáni ismételt vizsgálatra.

A kit tartalmazhat külön pufferként foszfátpuffert vagy a foszfátpuffer a detergenst vagy az ADP-reagenst tartalmazó tartályok valamelyikében lehet, különösen, ha ezek a végkoncentrációnak megfelelő koncentrációjúak. Más megoldás szerint a puffer a kitben a detergenssel és/vagy ADP-vel együtt lehet koncentrált, használat előtt hígítandó formában.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének egy mintában való meghatározására, azzal jellemezve, hogy adenozin-difoszfátot (ADP) adenozin-trifoszfáttá (ATP) átalakítóképességük alapján kimutatjuk adenilát-kináztartalmukat és/vagy azt mennyiségileg meghatározzuk, és ezt arányba állítjuk a mikroorganizmusok és/vagy azok intracelluláris anyagainak jelenlétével és/vagy mennyiségével.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként egy vizes oldatot vagy szuszpenziót alkalmazunk, és az adenilát-kináz meghatározását ebben ADP adagolásával végezzük olyan körülmények mellett, amelyeknél a jelen lévő adenilát-kináz az ADP-t ATP-vé alakítja, luciferáz- és luciferinreagenseket adagolunk az elegybe, majd meghatározzuk a mintából kibocsátott fény mennyiségét, és ezt az adenilát-kináz jelenlétével és mennyiségével arányosítjuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP-reagens ADP:ATP mólaránya legalább 2000:1.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kereskedelmi forgalomban kapható, legalább 98%-os tisztaságú ADP-t oszlopkromatográfiás tisztítást követően alkalmazunk, melynek során az ADP-ben lévő ATP-tartalmat tovább csökkentjük, az oszlopkromatográfiás tisztítást dietil-amino-etil-cellulózon végezzük 1 ml/perc áramlási sebességű, 0,02 mol/l-es hidrogen-klorid-eluens alkalmazásával.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan ADP-t alkalmazunk, amelynek tisztasága ATP-re vonatkoztatva olyan, hogy egy 100 mmol/l-es ADP-oldat 50 μΐ 1:3000-szeres hígításának 100 μΐ kereskedelmi forgalomban beszerezhető luciferáz- és luciferinreagens alkalmazásával végzett vizsgálatában 1000/perc alatti beütésszámot mérünk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 100 μΐ, kereskedelmi forgalomban beszerezhető luciferáz- és luciferinreagensek alkalmazásával végzett vizsgálat mellett az ADP jelenlétében kevesebb, mint 300 beütésszám/perc értéket mérünk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan ADP-t alkalmazunk, amelynek tisztasága az ATP-tartalom tekintetében legalább az ADP: ATP=6000 mólaránynak megfelelő.

HU 218 156 Β
8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 98%-os vagy ezt meghaladó tisztaságú ADP-nek ATP-áz enzimmel való elegendő idejű kezelésével 0,1 mol% vagy ez alatti ATP-tartalomig csökkentett ADP-t alkalmazunk.
9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan luciferázreagenst alkalmazunk, amelynek adenilát-kináz-aktivitását előzetes kezeléssel elimináltuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a luciferáz adenilát-kináz-aktivitását méretkizárásos kromatográfiás eljárással, fordított fázisú kromatográfiás eljárással vagy a kettő kombinálásával eltávolítjuk.
11. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a luciferázt és/vagy luciferint közvetlenül a mérést megelőzően vagy a mérés során adagoljuk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adenilát-kináz kimutatása és/vagy mennyiségi meghatározása előtt a mintában lévő mikroorganizmusok roncsolókezelésével az intracelluláris anyagot szabaddá tesszük.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a roncsolókezelést detergensek alkalmazásával végezzük.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként kationos detergenst alkalmazunk.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálatot egy nemionos detergenssel előkezelt mintán végezzük, és a képződött ATP mennyiségét levonjuk abból, ami a kationos detergenssel végzett vizsgálat során képződik.
16. Berendezés mikroorganizmusok jelenlétének és/vagy mennyiségének, és/vagy intracelluláris anyagának valamely mintában az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárással való kimutatására, azzal jellemezve, hogy a berendezés a vizes szuszpenzió vagy oldat formájában lévő analizálandó minta befogadására (2) és ADP, luciferáz és luciferin fenti mintához való adagolására szolgáló eszközöket (3), (4) és (5) és a képződött fény kimutatására szolgáló eszközt (6) tartalmaz, és a berendezésben egy szállítószalag (1) mozgatja a mintát és a fenti eszközöket egymáshoz képest az egymást követő műveleteknek megfelelően.
17. A 16. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a luciferázt és luciferint adagoló eszköz (6) előtt egy, a szuszpenzióhoz detergens adagolására szolgáló eszközt (4) tartalmaz.
18. A 17. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy benne az ADP-reagens és a detergens együtt kerül adagolásra.
19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy továbbá tartalmaz egy fénydetektáló helyet, ahol a luciferázt és a luciferint a mintához adjuk azt megelőzően, hogy a mintából kibocsátott fényt a fény kimutatására szolgáló eszközzel mérnénk.
20. A 16. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy egy szállítószalagot (1) tartalmaz, amely befogadja a folyékony közeget tartalmazó mintákat, és ezeket egy vagy több reagensadagoló helyen át a fénydetektáló eszközhöz viszi.
21. A 20. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy olyan szállítószalagot (1) tartalmaz, amely arra van kialakítva, hogy olyan luminometriás tartályok sorozatát fogadja magába, amelyek előzetesen már tartalmazzák a mikroorganizmus jelenlétének kimutatására vizsgálandó anyagok vizes, folyékony szuszpenzióját, vagy amelyekbe a berendezés megfelelő helyén való áthaladás közben jut bele az ilyen szuszpenzió.
22. Vizsgálati kit mikroorganizmusoknak az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására, azzal jellemezve, hogy adenozin-difoszfátot, luciferázt és luciferint tartalmaz.
23. A 22. igénypont szerinti vizsgálati kit, azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egy olyan detergenst is, amely a kimutatandó és/vagy mennyiségileg meghatározandó cél-mikroorganizmussejtek roncsolására alkalmas.
24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti vizsgálati kit, azzal jellemezve, hogy egy kationos és egy nemionos detergens reagenst tartalmaz.
25. ADP-reagens mikroorganizmusoknak vagy intracelluláris tartalmuknak az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására, azzal jellemezve, hogy ATP-tartalom tekintetében olyan tiszta ADP-t tartalmaz, amelyben az ADP: ATP mólarány legalább 2000:1.
26. A 25. igénypont szerinti ADP-reagens, azzal jellemezve, hogy benne az ADP: ATP mólarány legalább 99,99:0,01.
27. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati kit, azzal jellemezve, hogy a 25. vagy 26. igénypont szerinti ADP-reagenst tartalmazza.
28. A 22-24. vagy 27. igénypontok szerinti vizsgálati kit, azzal jellemezve, hogy a benne lévő luciferáz mentes az adenilát-kináz-aktivitástól.
29. A 22-24. vagy 27. igénypontokok bármelyike szerinti vizsgálati kit, azzal jellemezve, hogy a benne alkalmazott luciferáz/luciferin arány vagy egy vagy több ilyen reagens hígítására vonatkozó, megadott utasítás olyan, hogy a luciferáz a luciferinszubsztrátra megfelelően gyorsan tud hatni ahhoz, hogy a luciferázhoz kapcsolódó adenilát-kináz csak a kezdeti emisszió befejeződése után termeljen ATP-t.