CN116024359A - 基于非对称pcr和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，属于生物学检测技术领域，本发明设计用生物素标记的耐药基因KPC和NDM的下游引物（Biotin‑R）对目标基因进行不对称PCR扩增，获得生物素化的目标单链DNA（Biotin‑ssDNA）。通过胶体金侧流层析试纸条试验与其互补的生物编码DNA探针相互作用形成可视的显色条带，从而判断有无该耐药基因。提出的诊断测试的主要优点是简单、安全和成本效益，快速分析在15 min内完成，高检测性、灵敏度、特异性和再现性、普遍性和便携性，而检测是通过肉眼完成的，不需要昂贵的仪器或训练有素的人员。结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的目的，适用于基层医疗使用。

Description

基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体为一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法。

背景技术

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌检出率呈逐年上升的态势，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌上升幅度明显。我国 CRE 以肺炎克雷伯菌为主，而 CRE 导致的感染病死率达到 47% ，且 CRE的定植率、检出率、耐药率、死亡率一直呈上升趋势给感染治疗带来极大的挑战。据全国耐药检测网数据，CR-KP检出率从2013年的4.9%上升至2020年的10.9%，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR-KP）的耐药率也呈现明显上升趋势。CRKP感染在国内呈现出持续高发的现象，严重威胁人类健康。

经检索，中国专利号：CN202120018817.7，公开了一种肺炎克雷伯菌粘丝实验检测装置，该装置具有便于将放置板拆卸下来进行消毒，且便于将其固定在装置上，便于对一些盛装检测药剂的试管进行限位固定，便于对一些检测用的工具进行存放的一种肺炎克雷伯菌粘丝实验检测装置，使其提高检测的准确性，提高检测的效率，便与检测人员进行使用。当该发明仍存在以下问题：

该发明中检测方法通量有限，检测时受限于琼脂糖凝胶电泳的低分辨率和荧光素的种类，而且检测时会受到用到的仪器昂贵和检测条件要求高的限制，不利于现场即时检测和条件落后地区的开展。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，包含以下步骤：

（1）筛选引物：根据GeneBank的已发表序列，利用DNAMAN软件进行多重比对，获得KPC和NDM基因保守区，利用Primer Premier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合为 KPC-F/R和NDM-F/R；

（2）菌株的培养和DNA提取：选用携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，将细菌接种于血平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100μＬ灭菌去离子水，然后按照天隆核酸提取试剂盒说明书用全自动核酸提取仪进行提取DNA,至-20℃ 保存备用；

（3）制备不对称PCR体系：分别以KCP和NDM 基因组的DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA，在PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量生物素化的单链DNA（ Biotin-modified single-strained DNA，ssDNA）备用；

（4）制备核酸免疫层析试纸条：在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(SA-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用，将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存；

（5）进行胶体金核酸免疫侧流层析检测，并读取结果。

进一步的，所述常规PCR扩增耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌KCP和NDM基因采用扩增上、下引物量1：1，以常规PCR成功扩增出基因的KCP为131bp和NDM为133 bp条带，最终得出两种基因的上、下游引物添加浓度比为1∶20时，制目标单链DNA产量多，进行免疫层析时的灰度值最高。因此，得出KCP和NDM最佳上、下游引物浓度比为1：20。

进一步的，所述在制备不对称PCR体系过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，结果表明KCP和NDM选取循环数为35最优。

进一步的，在进行KPC、NDM不对称PCR不同退火温度的核酸免疫层析检测时，KPC和NDM在退火温度为55 ℃的条带较量亮，产生的二聚体较少，其检测线的平均灰度值最高分别为585和435.3，所以最优选取55 ℃作为不对称PCR反应的退火温度。

进一步的，所述不对称PCR体系中引物的添加量影响整个扩增过程中目标单链DNA产物的生成量，适当提升引物加入量能够增加扩增末期时所产生目标单链DNA，因此，对不对称PCR体系中引物加入量进行优化，随着体系中引物浓度的增加，目标单链DNA产物的生成量也随之增加，当KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L时，双链DNA被消耗较多，产生目的单链DNA较多，不浪费引物量，继续提高引物的浓度，对免疫层析效果没有显著影响，故选择KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L。

进一步的，所述检测菌株为携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，所述引物组合物包含KPC-F/R和NDM-F/R，所述引物反应体系为：2xPCR MIX DNA聚合酶混合物10 μL、KCP和NDM 基因组的DNA模板1ng/μL，2μL、稀释后的KPC-F 和NDM-F上游引物0.4μmoL/L，1 μL，同时加入生物素标记的下游引物Biotin-KPC-R、Biotin-NDM-R，补充超纯水至20 μL。

进一步的，所述胶体金核酸免疫侧流层析检测时1mL的胶体金溶液添加浓度为1mg/mL 链霉亲和素（SA）为20μL最佳。

进一步的，所述核酸免疫层析试纸条的制备还包括胶体金的制备、链霉亲和素修饰性金纳米颗粒（SA-AuNPs）的制备、链霉亲和素−生物素−DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）的制备、、交联胶体金的链霉亲和素添加量的优化和修饰生物编码探针的链霉亲和素添加量的优化。

采用上述方案的有益效果为：这种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，本发明使用生物素标记的耐药基因KPC和NDM的下游引物（Biotin-R）对目标基因进行不对称PCR扩增，获得生物素化的单链DNA（Biotin-ssDNA）。通过胶体金侧流层析试纸条试验与其互补的DNA探针相互作用形成可视的显色条带，从而判断有无该耐药基因。提出的诊断测试的主要优点是简单、安全和成本效益，快速分析在15 min内完成，高检测性、灵敏度、特异性和再现性、普遍性和便携性，而检测是通过肉眼完成的，不需要昂贵的仪器或训练有素的人员。结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的目的，适用于基层医疗使用。

附图说明

图1为PCR 核酸免疫层析试纸条的检测原理及判定结果示意图。

图2为PCR扩增KCP和NDM基因电泳图。

图3为KPC（A）和NDM（B）不同引物浓度添加比的不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图4为KPC和NDM不同引物浓度添加比的免疫层析检测灰度值。

图5为KPC和NDM不对称PCR不同循环数的免疫层析检测灰度值。

图6为KPC（A）和NDM（B）不同退火温度的不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图7为KPC、NDM不对称PCR不同退火温度的免疫层析检测灰度值。

图8为KPC（A）和NDM（B）不同上游引物加入量的不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图9为KPC（A）和NDM（B）不对称PCR不同引物加入量的免疫层析检测灰度值。

图10为胶体金的制备及其与链霉亲和素（SA）交联结果表征图。

图11为不同浓度的链霉亲和素与胶体金交联的试纸条检测结果图。

图12不同浓度的链霉亲和素修饰检测线探针的试纸条检测结果图。

图13免疫层析法检测KCP和NDM基因灰度值图。

图14PCR 核酸免疫层析试纸条及其灰度值对KPC和NDM的特异性检测结果图。

图15为荧光定量PCR验证KPC和NDM的特异性图。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，包含以下步骤：（1）筛选引物：根据GeneBank的已发表序列，利用DNAMAN软件进行多重比对，获得KPC和NDM基因保守区，利用Primer Premier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合为 KPC-F/R和NDM-F/R；

（2）菌株的培养和DNA提取：选用携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，将细菌接种于血平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100μＬ灭菌去离子水，然后按照天隆核酸提取试剂盒说明书用全自动核酸提取仪进行提取DNA，至-20℃ 保存备用；

（3）制备不对称PCR体系：分别以KCP和NDM 基因组的DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA，在PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量生物素化的目标单链DNA（Biotinylated -single-strained DNA，Biotin- ssDNA）备用；

（4）制备核酸免疫层析试纸条：在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA（SA-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(SA-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用，将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存；

（5）进行胶体金免疫侧流层析检测，并读取结果。

其中，菌株来源 携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，碳青霉烯类抗菌药物敏感的标准菌株及常见呼吸道标准菌株均由贵州省人民医院检验科微生物室提供保存。菌种来源及编号见表1：

表 1 实验菌株

Table 1 Bacterial strains for detection

其中，在本发明中实验时，所用的试剂分别为下列preｍix TaqTM（TaKaRaTqTMVersion2.0 plusdye）；PCR分析试剂盒（Takra公司）和 DL500DNA 标记物（Takra公司）；核酸染料 GelRed（美国 biotium公司）；链霉亲和素（SA）、聚乙二醇20000、吐温-20 北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美国Sigma公司；天隆科技核酸提取试剂盒；HAuCl4·4H2O和柠檬酸三钠（购自 Sigma 公司）；11342-025N硝酸纤维膜（NC膜，流速为570 mL/（min·cm²）） 德国Sartorius公司；聚酯膜（滤纸）、样本垫、结合垫、吸水纸、PVC底板 上海金标生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

其中，在本发明实验时，所用到的实验器材为VITEK-2 微生物鉴定仪（梅里埃，法国）、生物质谱仪（江苏天瑞，中国）、全自动核酸提取仪 （天隆科技公司）、 BiometraTAdvanced 96 SG PCR仪 （德国analytikjena)公司；荧光定量 PCR 分析采用ABI7500仪器（购自 Applied Biosystems 公司）；微量分光光度计（美国 ThermoFisherScientific公司）、电泳仪 （美国 BioRad公司）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad XR+） HZ100R高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HM3035 XYZ划膜喷金机（上海金标生物科技有限公司）、胶体金试纸条定量分析仪 （苏州和迈精密仪器有限公司）。

其中，在进行制备不对称PCR体系时，对引物的选择参考 GeneBank中已发表序列，利用 DNAMAN 软件进行多重比对，获得 KPC和NDM基因保守区，而后利用 PrimerPremier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合： KPC-F/R和NDM-F/R。由北京引擎生物股份有限公司合成测序，如表2所示：

表 2 引物及探针序列

Table 2 Sequences of primers and probes used in this study

注：F.上游引物；R：下游引物；P.捕获探针；C：质控探针；斜体和下划线的碱基表示互补的序列。

继而接着不对称PCR体系的建立：分别以KCP和NDM 基因组DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA。在普通PCR条件的基础上，加入不同浓度的上游引物与下游引物；反应体系为：2xPCR MIX DNA聚合酶混合物，10 μL；模板1ng/μL，2μL；稀释后的KPC-F 和NDM-F上游引物0.4μmoL/L,1 μL，同时加入生物素标记的下游引物Biotin-KPC-R、Biotin-NDM-R，补充超纯水至20 μL。PCR反应条件为9 5 ℃预变性3 min；变性、退火、延伸（95 ℃，30 s；55℃、30 s，72 ℃，20 s）×35 个循环；最后72 ℃，延伸5 min。PCR产物用2．0％琼脂凝胶上120 V电泳30 min，Green染色，在凝胶成像仪上观察记录结果。实验对不对称PCR上、下游引物浓度添加比例进行优化，上游引物与相应的下游引物浓度比例为1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100；对不对称PCR循环数进行优化，循环数梯度设置为n=30、35、40、45、50、55；对不对称PCR退火温度进行优化，退火温度梯度设置为55～65 ℃；上游引物加入量终浓度设置为0、10、20、30、40、50 nmol/L，KCP和NDM生物素化的下游浓度与上游引物相对应，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳仪进行观察。

核酸免疫层析试纸条的构建：

①侧流层析试纸条的制备

利用MH3035划膜喷金机在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(SA-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用。将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制成试纸条如图1B 所示。制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存。

②胶体金的制备

采用柠檬酸还原法制备金纳米粒子，在 96 mL 0.01％氯金酸溶液中加入4mL的1％柠檬酸三钠，得到30-40nm粒径的胶体金溶液，拍摄透射电镜。取1mL制备好的胶体金溶液，加入链霉亲和素（SA）（1mg/mL）20μL混匀制备链霉亲和素修饰的金纳米颗粒(SA-AuNPs)，取(SA-AuNPs)溶液 200μL加入 10％氯化钠溶液 20uL 混匀，静置 30 min 后使用紫外分光光度计进行扫描验证。

③链霉亲和素修饰性金纳米颗粒（SA-AuNPs）的制备

偶联反应采用体积为10 mL制备好的金纳米颗粒（AuNPs）溶液。首先，将1.5mLo1gL1值的链霉亲和素（1.5 mg）干粉用水稀释至1 mg/mL。然后，用0.1 mM K₂CO₃调整AuNPs溶液的pH至8.0。将200ul的链霉亲和素（1 mg/mL）加入10 mL的AuNPs（pH8.0）溶液中，在室温、摇床上振动反应混合物1h。然后加入终浓度为1％BSA作为封闭剂，将混合物继续孵育30 min。将链霉亲和素功能化的AuNPs 用高速离心机10000r/min离心20 min，最后在1mL适当的缓冲液（1 PBS，1% BSA，0.25%蔗糖，1% Tween-20）中重组。该共轭物最终储存在4℃下供进一步使用。

④链霉亲和素−生物素−DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）的制备

设计了测试区探针DNA（T2 DNA和T1 DNA）与KPC和NDM两种基因的扩增产物目标ssDAN链的部分碱基互补配对，T1 DAN和T2 DAN探针能分别捕获测试区内的胶体金-链霉亲和素-生物素功能化的目标单链DNA复合物： AuNP−DNA1（AuNPs-SA-Biotin-ssDNA_NDM）和AuNP−DNA2（AuNPs-SA-Biotin-ssDNA_KPC）。制备了KPC和NDM两种基因的链霉亲和素−生物素化的T DNA（SA-Biotin-DNA）偶联物，以固定在测试区。链霉亲和素在10 mM PBS（pH 7.4）中溶解，最终浓度为1 mg/mL。链霉亲和素与T DNA（50μM）以2：1的比例混合，在室温下孵育1小时，以提供稳定的结合。将样品溶液（30 kDa，微孔Amicon Ultra）在6000rpr下过滤30 min，以去除剩余的游离T DNA。结合链霉亲和素−T DNA由于链霉亲和素（55 kDa）而保留在过滤器中，从过滤膜中去除，用PBS重悬至其初始体积。混合物在4℃下保存以备将来使用。以同样的方法，将10 μL C DNA（50μM）与30 μL链霉亲和素（1 mg/mL）混合，制备对照区的捕获探针。

⑤交联胶体金的链霉亲和素添加量的优化

考察链霉亲和素（SA）添加量对胶体金交联效果的影响，1mL的胶体金溶液添加浓度为1mg/mL SA，添加量分别为0、10、20、30、40、50 μL。选取KPC不对称PCR产物作为实验组。

⑥修饰生物编码探针的链霉亲和素添加量的优化

考察链霉亲和素（SA）添加量对生物编码探针效果的影响，1uL的捕获探针或质控探针（50umoL/L）溶液添加浓度为1mg/mL SA，添加量分别为0、0.5、1、2、3、4 μL。选取KPC不对称PCR产物作为实验组。

核酸层析实验：利用建立的不对称PCR 体系对携带KPC和NDM基因的肺炎克雷伯菌株进行扩增, 并使用 ddH₂O 作为空白对照。在小EP管中加入10uL不对称PCR扩增产物和90uL稀释液混匀，加入侧流层析试纸条样本垫，反应15 min，使用胶体金免疫分析仪读取检测线灰度值。稀释液其成分为: 10 mmol/L Tris、1% BSA、1%(v/v)Tween20、5%蔗糖溶液以及浓度为 0.01 mol/L 的 PBS, 该稀释液可以减少引物二聚体对实验结果的干扰。

结果判断：C点和T点都显色，KPC和NDM基因检测结果阳性；C点显色，KPC和NDM基因其中一个显色，对应的基因检测结果阳性；C点显色而T点不显色则检测结果阴性；若C点和T点都不显色则结果不能判断(如图1E)。

从结果可以看出，图1A为耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌KPC和NDM基因的不对称PCR的构建。图1B、C、D基于不对称PCR的胶体金试纸条检测的设计：(图1B)测试条的配置；(图1C)有KPC和NDM基因的结合和显色信号（阳性检测）；(图1D)在没有KPC和NDM基因的情况下的结合和显色信号（阴性测试）。(图1E)测试条的结果判读。

实施例2

不对称PCR上、下游引物添加比例的优化：

如图2、图4所示，常规PCR扩增耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌KCP和NDM基因采用扩增上、下引物量1：1，以常规PCR成功扩增出基因的KCP为131bp和NDM为133 bp条带。

利用不对称PCR技术制备目标单链DNA的过程中，当限制性引物（上游引物）耗尽时，剩余过量的下游引物则以扩增前期所产生的双链DNA为模板，扩增出所对应的目标单链DNA，因此上、下游引物的添加比例是影响单链DNA产量的关键因素。考察KCP和NDM的最佳引物浓度添加比，结果如图3、4所示。随着下游引物添加量的增加，KPC相应单链PCR的产量随之升高（图3A），KPC在KPC-F∶Biotin-KPC-R浓度比为1∶20时，其制备的目标单链DNA产量多，且产生的引物二聚体较少。进行免疫层析时的灰度值最高（图4），灰度平均值为544.6。继续提高NDM基因下游引物的添加量，相应目标单链DNA的随之减少，并出现了其他副产物。导致免疫层析效果下降。当NDM-F∶Biotin-NDM-R添加浓度比为1∶20时，制备的NDM的目标单链DNA产量多（图3B），进行免疫层析时的灰度值最高结果，灰度平均值为515.3。所以KCP和NDM最佳上、下游引物浓度比为1：20。

所述常规PCR扩增耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌KCP和NDM基因采用扩增上、下引物量1：1，以常规PCR成功扩增出基因的KCP为131bp和NDM为133 bp条带，最终得出当NDM-F∶Biotin-NDM-R添加浓度比为1∶20时，制备的NDM的目标单链DNA产量多，进行免疫层析时的灰度值最高结果为灰度平均值为515.3，得出KCP和NDM最佳上、下游引物浓度比为1：20。

在不对称PCR过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，结果如图5、6所示。实验结果显示随着循环数的增加，KPC目标单链DNA产物含量越多，当循环数为35，电泳目的单链DNA条带最亮（图6A）；此时免疫层析法检测KPC的结果（图5）灰度平均值最高为533.3；而之后随着不对称PCR循环数增加，但单链扩增效率不高，因此目标单链DNA产物浓度下降；对于NDM组，当循环数为40时，电泳目的单链DNA条带较亮，且引物二聚体较少（图6B），此时免疫层析法检测NDM的灰度平均值最高为505.3；综合考虑KCP和NDM选取循环数为35。

所述在制备不对称PCR体系过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，结果表明KCP和NDM选取循环数为40最优。

在进行KPC、NDM不对称PCR不同退火温度的免疫层析检测时，如图6所示，KPC和NDM在退火温度为55 ℃的条带较量亮，产生的二聚体较少，其检测线的平均灰度值（图7）最高分别为585和435.3，所以最优选取55 ℃作为不对称PCR反应的退火温度。

所述不对称PCR体系中引物的添加量影响整个扩增过程中目标单链DNA产物的生成量，适当提升引物加入量能够增加扩增末期时所产生目标单链DNA。因此，对不对称PCR体系中引物加入量进行优化，结果如图8、9所示。随着体系中引物浓度的增加，目标单链DNA产物的生成量也随之增加，当KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L时，双链DNA被消耗较多，产生目的单链DNA较多，不浪费引物量，继续提高引物的浓度，对免疫层析效果没有显著影响，故选择KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L。

所述检测菌株为携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，所述引物组合物包含KPC-F/R和NDM-F/R，所述引物反应体系为：2xPCR MIX DNA聚合酶混合物10 μL、KCP和NDM 基因组的DNA模板1ng/μL，2μL、稀释后的KPC-F 和NDM-F上游引物0.4μmoL/L，1 μL，同时加入生物素标记的下游引物Biotin-KPC-R、Biotin-NDM-R，补充超纯水至20 μL。

所述核酸免疫层析试纸条的制备还包括胶体金的制备、链霉亲和素修饰性金纳米颗粒（SA-AuNPs）的制备、链霉亲和素−生物素−DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）的制备、、交联胶体金的链霉亲和素添加量的优化和修饰生物编码探针的链霉亲和素添加量的优化。

免疫层析实验：

①胶体金的制备和表征

采用柠檬酸还原法制备胶体金溶液呈酒红色（图10A）；胶体金溶液粒子大小、分散均匀，透射电镜图证实这点（图10B）。链霉亲和素交联的胶体金溶液与未交联胶体金溶液分别加10％氯化钠溶液进行对比，其表观图及紫外分光光度计扫描图结果显示（图10C）。未交联的胶体金溶液加氯化钠溶液后发生聚集沉淀，由酒红色变为灰色。金-SA复合物加氯化钠溶液前后与未加氯化钠溶液纯胶体金的紫外分光光度计扫描图结果差不多，说明胶体金与链霉亲和素交联成功。

②交联胶体金的链霉亲和素添加量的优化

如图11所示：当链霉亲和素的添加量增高到20uL时检测线和质控线的显色最明显，之后随着链霉亲和素的添加量越高，试纸条显色反而逐渐减弱。链霉亲和素过多会引发金纳米粒子间聚集，主要通过其表面的正电荷与金纳米粒子表面的负电荷间的电荷中和减小纳米粒子间静电斥力导致粒子间距离减小而聚集，所以颜色由红变紫。说明1mL的胶体金溶液添加浓度为1mg/mL SA为20μL最佳。

所述胶体金免疫侧流层析检测时1mL的胶体金溶液添加浓度为1mg/mL SA为20μL最佳。

③修饰生物编码探针的链霉亲和素添加量的优化

如图12所示，考察链霉亲和素（SA）添加量对生物编码探针效果的影响，1uL的捕获探针或质控探针（50umoL/L）溶液添加浓度为1mg/mL SA，添加量为2μL最佳。

④免疫层析试纸条检测KCP和NDM基因

利用所建立的方法对4株菌株进行KCP和NDM基因检测，结果如图13所示，利用该方法可快速分型检测到CRKP。

⑤特异性实验

为验证本实验建立并优化的快速检测KPC和NDM的特异性，选取10株菌株使用基因组提取试剂盒提取 DNA，分别进行KCP和NDM基因不对称荧光定量PCR扩增及 胶体金侧流层析试纸条检测，使用 ddH2O 作为空白对照。结果分别见图14和15。携带KCP和NDM株菌分别呈阳性，其他非携带KCP和NDM基因的菌株及对照为阴性；结果显示该方法可准确检测到含有KCP和NDM标志性耐药基因的肺炎克雷伯菌菌株，且具有良好的特异性。证明该方法具有可行性。

根据实施例1与实施例2获得结论，PCR 技术由于具有较高的特异性，可以在数小时内得出结果，在现场应用有着巨大的优势， 然而扩增后产物的检测需要结合电泳槽、核酸分析仪等，这阻碍了在一线单位和现场的普及。本发明通过建立一种基于不对称 PCR结合胶体金核酸层析技术快速检测肺炎克雷伯菌的耐药基因KCP和NDM的方法，简化了 PCR扩增后产物检测的复杂操作流程，直接把核酸扩增后的稀释样品滴到试纸条上即可观察结果，且试纸条的检测灵敏度要比普通凝胶电泳的高。此外，可同时检测多重耐药基因。这实现快速、准确区分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的酶型，以便临床及时、规范用药。该方法操作简便、检测成本低、检测结果准确以及特异性良好等特点，适用于基层实验室使用。并且可为进一步检测不同的耐药菌和病原微生物提供重要的方法参考。

实施例3

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem－resistant Enterobacteriaceae，CRE) 检出率呈逐年上升的态势，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae，CR-KP）上升幅度明显。我国 CRE 以肺炎克雷伯菌为主，而 CRE 导致的感染病死率达到 47% ，且 CRE的定植率、检出率、耐药率、死亡率一直呈上升趋势^［6］给感染治疗带来极大的挑战。据全国耐药检测网数据，CR-KP检出率从2013年的4.9%上升至2020年的10.9%，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR-KP）的耐药率也呈现明显上升趋势。CRKP感染在国内呈现出持续高发的现象，严重威胁人类健康。

碳青霉烯酶的出现是造成CRE对碳青霉烯类抗生素耐药的最为关键的机制。碳青霉烯酶按 Ambler 分类法分为 A、B 和 D 三类。其中，A类基因型主要包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneumoniae car- bapenemase，KPC)、SME、IMI、NMC、GES；B 类主要包含的基因型为新德里金属β－内酰胺酶( New Delhi Metallo-β-Lacta- mases，NDM)、VIM 和IMP ；D 类由苯唑西林酶( oxacillinase，OXA)等位基因编码。其中 A类与 D 类一般借助水解丝氨酸的活性位点让药物失去活性，B 类则属于金属酶，而产 KPC酶 和NDM酶的肺炎克雷伯菌是目前研究最多也最为常见的碳青霉烯酶，且正在增长。这有可能随时引起院内感染，带来不可估量的后果，应引起相关专家和临床医生的关注。

现临床上主要采用常规实验室的分离培养、鉴定及药敏试验方法指导临床用药，该方法检测周期长、操作繁琐，严重影响了临床治疗时效性。为了适应临床治疗对快速检测的需求，低成本、快速的侧流层析（LF）技术得到进一步发展。本研究基于不对称PCR 技术，利用胶体金试纸条建立一种灵敏、快速、准确可同时检测 KPC和NDM基因的即时检测方法，用以检测碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌，指导临床抗感染治疗。

不对称PCR技术是向PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量目标基因单链DNA（single-strained DNA，ssDNA）。利用不对称PCR技术产生带有标记物的单链DNA，通过结合其他技术如光学SPR生物传感器、纳米金比色法、电化学DNA生物传感器等实现快速灵敏检测目标基因片段的目的。本实验使用生物素标记的耐药基因KPC和NDM的下游引物（Biotin-R）对目标基因进行不对称PCR扩增，获得生物素化的目标单链DNA（Biotin-ssDNA）。通过胶体金侧流层析试纸条试验与其互补的DNA探针相互作用形成可视的显色条带，从而判断有无该耐药基因。提出的诊断测试的主要优点是简单、安全和成本效益，快速分析在15 min内完成，高检测性、灵敏度、特异性和再现性、普遍性和便携性，而检测是通过肉眼完成的，不需要昂贵的仪器或训练有素的人员。结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的目的，适用于基层医疗使用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：包含以下步骤：

（1）筛选引物：根据GeneBank的已发表序列，利用DNAMAN软件进行多重比对，获得KPC和NDM基因保守区，利用Primer Premier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合为 KPC-F/R和NDM-F/R；

（2）菌株的培养和DNA提取：选用携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，将细菌接种于血平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100μＬ灭菌去离子水，然后按照天隆核酸提取试剂盒说明书用全自动核酸提取仪进行提取DNA,至-20℃ 保存备用；

（3）制备不对称PCR体系：分别以提取的KCP和NDM 基因组的DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA，在PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量的生物素化的单链DNA（Biotin-modifiedsingle-strained DNA，Biotin-ssDNA）备用；

（4）制备核酸免疫层析试纸条：在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA偶联物（Streptavidin-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(Streptavidin-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用，将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存；

（5）进行胶体金核酸免疫免疫层析检测，并读取结果。

2.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述常规PCR扩增耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌KCP和NDM基因采用扩增上、下引物量1：1，以常规PCR成功扩增出基因的KCP为131bp和NDM为133 bp条带；最终优化得出当两种基因上游引物与下游引物添加浓度比为1∶20时，制备的目标单链DNA产量多，因此，得出KCP和NDM最佳上、下游引物浓度比为1：20。

3.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述在制备不对称PCR体系过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，综合考虑KCP和NDM选取循环数为35最优。

4.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：在进行KPC、NDM不对称PCR不同退火温度的胶体金免疫层析检测时，KPC和NDM在退火温度为55 ℃的条带较量亮，产生的二聚体较少，其检测线的平均灰度值最高分别为585和435.3，所以最优选取55 ℃作为不对称PCR反应的退火温度。

5.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述不对称PCR体系中引物的添加量影响整个扩增过程中目标单链DNA产物的生成量，适当提升引物加入量能够增加扩增末期时所产生目标单链DNA，因此，对不对称PCR体系中引物加入量进行优化，随着体系中引物浓度的增加，目标单链DNA产物的生成量也随之增加，当KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L时，双链DNA被消耗较多，产生目的单链DNA较多，不浪费引物量，继续提高引物的浓度，对免疫层析效果没有显著影响，故选择KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L。

6.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述检测菌株为携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，所述引物组合物包含KPC-F/R和NDM-F/R，所述引物反应体系为：2xPCR MIX DNA聚合酶混合物10 μL、KCP和NDM 基因组的DNA模板1ng/μL，2μL、稀释后的KPC-F 和NDM-F上游引物0.4μmoL/L，1 μL，同时加入生物素标记的下游引物Biotin-KPC-R、Biotin-NDM-R，补充超纯水至20 μL。

7.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述胶体金核酸免疫层析检测时1mL的胶体金溶液添加浓度为1mg/mL 链霉亲和素为20μL最佳。

8.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述核酸免疫层析试纸条的制备还包括胶体金的制备、链霉亲和素修饰性金纳米颗粒（SA-AuNPs）的制备、链霉亲和素−生物素−DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）的制备、交联胶体金的链霉亲和素添加量的优化和修饰生物编码探针的链霉亲和素添加量的优化。

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