CN116042777A - 多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法 - Google Patents

多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于多交叉扩增结合生物传感(MCDA‑LFB)检测结核分枝杆菌复合群的引物组合，所述引物组合能够同时检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)的特异基因IS6110和IS1081。本发明还公开了多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的的方法，能在30分钟内完成整个MCDA扩增，同时对两种基因的检测范围为10ng～10fg，具有极高的灵敏度，并且只有属于MTBC的成员，经MTBC‑MCDA‑LFB检测才能产生阳性结果，其他常见致病菌和机会致病菌未出现非特异性扩增，所述方法具有极高的特异性。

Description

多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法
本申请是申请日为2019年03月15日、申请号为201910199719.5、发明名称为《多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法》的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了多交叉扩增结合生物传感(MCDA-LFB)检测结核分枝杆菌复合群用引物组合和检测方法。
背景技术
结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和卡介苗，其中人类感染的结核病90％以上为结核分枝杆菌所致。结核病是严重危害人类健康的重要传染性疾病，结核病的早期鉴别诊断是决定病人临床结局的重要因素。
目前结核病的检测手段主要包括涂片、培养，以及以PCR为基础的诊断技术(如XpertMTB/RIF，LAMP，荧光PCR技术，荧光PCR熔解曲线法等)。涂片检测的阳性率低，尤其是在儿童中，敏感性低于15％。培养是结核病检测的金标准，敏感性约为50％，但是需时较长，改良罗氏固体培养法需4～6周，快速液体培养法需1～3周，且操作复杂，对实验室要求高，限制了其结果对临床的指导意义。近年来，随着分子生物学技术的发展和普及，越来越多的分子生物学方法被用于结核病的快速检测，如Xpert MTB/RIF和环介导恒温扩增(LAMP)是WHO推荐的结核病快速诊断方法。但前者依赖于昂贵的仪器和耗材，后者的结果判读主要依赖于反应体系颜色变化，在载菌量少的标本中，容易出现结果不易判定的情况。其它荧光PCR相关技术也都依赖于昂贵的仪器设备、探针合成和熟练的操作人员。因此，上述因素限制了这些技术在不发达地区的推广和应用。研发一个省时省力、特异性好、敏感性高的结核病快速检测方法，同时该方法又不依赖于昂贵的仪器设备和苛刻的实验条件，成为临床上的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于将MCDA-LFB技术用于MTBC的检测，针对MTBC的特异基因IS6110和IS1081设计了MCDA扩增引物，进行联合检测，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对MTBC的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。
基于上述目的，本发明首先提供了一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110-F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物6110-F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110-CP1和序列如SEQIDNO:4所示的交叉引物6110-CP2；提供序列如SEQ ID NO:5所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物6110-C1*和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110-C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物6110-D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110-D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物6110-R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110-R2(该组引物序列是针对MTBC的特异基因IS6110设计的)，和/或
提供序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081-F1和序列如SEQ ID NO:12所示的置换引物1081-F2，提供序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081-CP1和序列如SEQ IDNO:14所示的交叉引物1081-CP2；提供序列如SEQ ID NO:15所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物1081-C1*和序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081-C2，序列如SEQ ID NO:17所示的扩增引物1081-D1和序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081-D2，序列如SEQ IDNO:19所示的扩增引物1081-R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081-R2(该组引物序列是针对MTBC的特异基因IS1081设计的)；
(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
在一个优选的实施方案中，在所述扩增引物6110-C1*和/或1081-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素(FITC)。
在一个更为优选的实施方案中，所述纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、纳米分子垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在纳米分子垫、检测线及控制线区域依次包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
在另一个优选的实施方案中，所述恒温扩增是在65-68℃的环境中进行的。
在一个更为优选的实施方案中，所述恒温扩增是在67℃的环境中进行的。
在又一个优选的实施方案中，所述恒温扩增的时间为30分钟。
其次，本发明还提供了一组用于恒温扩增MTBC的IS6110的引物，该组引物是针对MTBC的特异基因IS6110设计的，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110-F1和序列如SEQ ID NO:2所示的6110-F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110-CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的6110-CP2；提供序列如SEQ ID NO:5所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物6110-C1*和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110-C2，序列如SEQIDNO:7所示的扩增引物6110-D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110-D2，序列如SEQID NO:9所示的扩增引物6110-R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110-R2。
在一个优选的实施方案中，在所述扩增引物6110-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素。
本发明还提供了另一组用于恒温扩增MTBC的IS1081的引物，该组引物是针对MTBC的特异基因IS1081设计的，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081-F1和序列如SEQ ID NO:12所示的1081-F2，提供序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081-CP1和序列如SEQ ID NO:14所示的1081-CP2；提供序列如SEQ ID NO:15所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物1081-C1*和序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081-C2，序列如SEQID NO:17所示的扩增引物1081-D1和序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081-D2，序列如SEQ ID NO:19所示的扩增引物1081-R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081-R2。
在一个优选的实施方案中，在所述扩增引物1081-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素。
本发明首次将近期建立的一种新型体外核酸恒温扩增技术(Multiple CrossDisplacementAmplification，MCDA)应用到MTBC的检测，实现对MTBC的便捷、快速、敏感及特异诊断。MCDA(多交叉恒温扩增)在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。为了进一步提高诊断效率、准确性及便捷性，本发明以MCDA为基础，针对MTBC的多个特异保守基因设计引物，将MCDA技术与纳米生物传感检测技术(Nanoparticles-based Lateral Flow Biosensor,LFB)相结合，首次建立了快速诊断MTBC的MCDA-LFB技术，具有便捷、快速、敏感、特异的优点，实现了对MTBC的便捷、稳定、可靠及敏感性检测，并消除单基因检测导致的假阳性结果。
首先，本发明提供的扩增方法可以在30分钟内完成整个MCDA扩增，能够高效、快速地扩增靶序列。
其次，本发明提供的MTBC-MCDA能够同时对IS6110和IS1081两种基因进行扩增和检测，从而极大程度地提高了检测MTBC的灵敏度，在其对IS6110的检测中，检测范围为10ng～10fg，而对IS1081的检测范围为10ng～100fg，同时对两种基因的检测范围为10ng～10fg，因此本方法均具有极高的检测能力。
第三，本发明提供的扩增方法具有很高的扩增特异性。
在对常见的致病菌、条件致病菌及非结核分枝杆菌DNA的检测中，只有属于MTBC的成员，经MTBC-MCDA-LFB检测才能产生阳性结果，其他常见致病菌和机会致病菌未出现非特异性扩增，说明所建立的方法具有极高的特异性，能准确地鉴定MTBC，无假阳性及假阴性结果产生。
附图说明
图1为MTBC-MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；
图2为MTBC-MCDA-LFB引物验证及检测结果图谱；
图3为MTBC-MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱，其中A为针对IS6110的MTBC-MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；B为针对IS1081的MTBC-MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；
图4为MTBC-MCDA-LFB检测结核分枝杆菌复合群的灵敏度结果图谱；
图5为MTBC-MCDA-LFB技术的特异性检测评价图谱；
图6为MTBC-MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试结果图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
材料方法
1.本发明中所涉及的试剂：
抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Abcam公司。高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-NP)购于北京海泰正元科技有限公司。背板，样品垫，纳米分子垫，纤维膜及吸水垫购于上海杰一公司。脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒(DNA Amplication Kit)及恒温扩增可视染料(Visual Reagent,VR)购于天津捷易特生物科技有限公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。其余试剂均为市售分析纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为东胜龙EDC-810，北京东胜创新生物科技有限公司。
基因组提取：MTBC及其他细菌的基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，结核分枝杆菌DNA用TE缓冲液连续稀释(从10ng/微升，1ng/微升，100pg/微升，10pg/微升，1pg/微升，100fg/微升，10fg/微升到1fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
连续稀释的结核分枝杆菌DNA用于MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的致病菌、条件致病菌及非结核分枝杆菌DNA为模板评价MTBC-MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息见表2。
2.引物设计
为了验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对MTBC的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。本发明针对MTBC的特异基因IS6110和IS1081设计了两套MCDA扩增引物，旨在验证MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。
IS6110和IS1081只存在于MTBC中，在大多数MTBC中拷贝数较高，其保守性和特异性良好，可以将MTBC与其他相近的菌种区分开。考虑到有些地区的少数菌株中仅含有1个拷贝IS6110，因此采用了IS6110和IS1081两个靶标联合检测，以提高检测的灵敏度。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列及修饰见表1。
表1引物序列及修饰
Figure BDA0003906396030000061
6110-C1*和1081-C1*为在5’端被FITC(异硫氰酸荧光素)修饰的引物。
3.纳米生物传感检测器(LFB)的设计
LFB一共包含五个部分，背板、样品垫、纳米垫、纤维膜及吸水垫。首先将样品垫、纳米垫、纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-NP(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-FITC(抗异硫氰酸荧光素抗体)及B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在纳米垫、检测线(Test Line，TL)及质控线(Control Line，CL)，待干燥后备用。
LFB的检测原理：将MTBC-MCDA产物直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将80μL的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到纳米分子垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-NP反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-NP进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-NP可与CL区域的B-BSA进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。
LFB结果的判读(图2中的Ab,Bb,Cb)：仅仅CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(图2中的Ab2-Ab4，Bb2-Bb4，Cb2-Cb4)；CL及TL区域出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果(图2中的Ab1，Bb1，Cb1)；当LFB不出现红色条带时，表示LFB失效；仅TL出现红色条带，而CL无红色条带，代表结果不可行，需要重新检测。
实施例1.MCDA引物的可行性验证
MCDA扩增(详见专利CN106544434A)。
标准的MCDA反应体系(一套引物)：交叉引物6110-CP1、6110-CP2(或1081-CP1、1081-CP2)的浓度为60pmol，置换引物6110-F1、6110-F2(或1081-F1、1081-F2)的浓度为10pmol，扩增引物6110-R1、6110-R2、6110-D1、6110-D2(或1081-R1、1081-R2、1081-D1和1081-D2)的浓度为30pmol，扩增引物6110-C1*、6110-C2(或1081-C1*和1081-C2)的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在67℃1小时，85℃5min终止反应。
改良的MCDA反应体系(两套引物)：交叉引物6110-CP1、6110-CP2、1081-CP1和1081-CP2的浓度为30pmol，置换引物6110-F1、6110-F2、1081-F1和1081-F2的浓度为5pmol，扩增引物6110-R1、6110-R2、1081-R1、1081-R2、6110-D1、6110-D2、1081-D1和1081-D2的浓度为15pmol，扩增引物6110-C1*、6110-C2、1081-C1*和1081-C2的浓度为10pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在67℃1小时，85℃5min终止反应。
MCDA扩增之后，采用两种检测方法进行判别。首先，在反应混合物中加入可视染料(VR)，阳性反应管的颜色为绿色(图2中的Aa1,Ba1,Ca1)，阴性反应管为无色(图2中的Aa2-Aa4，Ba2-Ba4，Ca2-Ca4)。图2中的Aa1,Ba1和Ca1表示阳性扩增(反应管中加入1ng的结核分枝杆菌模板，作为阳性对照)，图2中的Aa2，Ba2和Ca2表示阴性扩增(反应管中加入1ng的Gram+肺炎链球菌模板，作为阴性对照)，图2中的Aa3，Ba3和Ca3表示阴性扩增(反应管中加入1ng的Gram-肺炎克雷伯菌模板，作为阴性对照)，图2中的Aa4，Ba4和Ca4表示空白对照反应(1μL的双蒸水代替1ng的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对IS6110或IS1081设计的检测MTBC的MCDA引物可用。
其次，可通过LFB对产物进行检测，当TL和CL出现红色条带时表示为MTBC检测阳性，仅有CL条带出现为MTBC检测阴性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图2中的Ab，Bb和Cb)。
实施例2.MCDA技术的最佳反应温度测定
在标准反应体系条件下，分别加入结核分枝杆菌DNA模板及所设计的MCDA引物(IS6110或IS1081)，其模板浓度为1ng/μL。反应在恒温条件下进行(61-68℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图3A和图3B，图3A表示针对IS6110，图3B表示针对IS1081基因序列设计的检测MTBC的MCDA引物温度动态曲线图。65-68℃(图3A5-3A8，图3B5-B8)被推荐作为IS6110或IS1081的MCDA引物的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择67℃作为恒温条件进行MCDA扩增。
实施例3.MCDA-LFB检测MTBC的灵敏度测定
采用连续稀释好的结核分枝杆菌DNA进行MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：(1)MCDA-LFB(IS6110)的检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图4中的Aa1-Aa7)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图4中的Aa8)。图4中的Aa运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图4中的Aa1到Aa8表示结核分枝杆菌的模板量为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg和1fg，图4中的Aa9为空白对照(1μL双蒸水)。(2)MCDA-LFB(IS1081)的检测范围为10ng～100fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图4中的Ba1-Ba6)。当反应体系中基因组模板量降低至100fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图4中的Ba7-Ba8)。图4中的Ba运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图4中的Ba1到Ba8表示结核分枝杆菌的模板量为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg和1fg，图4中的Ba9为空白对照(1μL双蒸水)。(3)MCDA-LFB(IS6110和IS1081)的检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图4中的Ca1-Ca7)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图4中的Ca8)。图4中的Ca运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图4中的Ca1到Ca8表示结核分枝杆菌的模板量为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg和1fg，4Ca9为空白对照(1μL双蒸水)。
为了进一步验证MCDA-LFB检测MTBC的敏感性，采用可视化染料确认MCDA-LFB的检测灵敏度。在反应混合物中预先加入可视染料(VR)，阳性反应管的颜色为绿色，阴性反应管则为无色。检测显示：(1)MTBC-MCDA(IS6110)的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增管变为绿色(图4中的Ab1-Ab7)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，反应为无色，表示阴性结果(图4中的Ab8)。(2)MTBC-MCDA(IS1081)的检测范围为10ng～100fg，阳性扩增管变为绿色(图4中的Bb1-Bb6)。当反应体系中基因组模板量降低至100fg以下时，反应为无色，表示阴性结果(图4中的Bb7-Bb8)。(3)MTBC-MCDA(IS6110和IS1081)的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增管变为绿色(图4中的Cb1-Cb7)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，反应为无色，表示阴性结果(图4中的Cb8)。
实施例5.MTBC-MCDA-LFB技术的特异性测定
以常见的致病菌、条件致病菌及非结核分枝杆菌DNA为模板评价MTBC-MCDA-LFB技术的特异性(菌株信息详见表2)。MTBC-MCDA-LFB技术能准确的鉴别MTBC，说明MCDA-LFB方法的特异性良好，见图5。图5A、图5B和图5C分别代表单独采用针对IS6110的引物、单独采用针对IS1081的引物、联合采用针对IS6110和IS1081的引物，三个图中所采用的菌株信息一致，均为：LFB1-8:MTBC模板(其中LFB1为MTB标准菌株H37Rv，LFB2-7为MTB临床分离株，LFB8为BCG菌株)；LFB9-29：常见的致病菌、条件致病菌(肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞杆菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、类志贺单胞菌、沙门氏菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、稀氏肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、腐生葡萄球菌)；LFB30-38：非结核分枝杆菌临床株(偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌)，LFB39：空白对照。结果表明，MCDA-LFB能够正确的检测靶序列。
表2菌株及特异性检测结果
Figure BDA0003906396030000101
Figure BDA0003906396030000111
BCH:Beijing Children’s Hospital(北京儿童医院)；CP-CDC:ChangpingDistrict Center for Disease Control and Prevention(昌平区疾病预防控制中心)；BCH-NTCL:National Tuberculosis Clinical Laboratory,Beijing ChestHospital(北京胸科医院国家结核病临床实验室)。
P,positive(MTBC-MCDA-LFB检测阳性)；N,negative(MTBC-MCDA-LFB检测阴性)。表2中检测结果说明，只有属于MTBC的成员，经MTBC-MCDA-LFB检测才能产生阳性结果，说明所建立的方法能够准确地鉴定MTBC，无假阳性及假阴性结果产生。
实施例6.MTBC-MCDA-LFB技术的最佳反应时间测定
MTBC-MCDA-LFB中针对IS6110和IS1081两套引物的最佳反应温度一致，敏感性和特异性好，且两套引物在一个反应体系中无相互影响，因此，仅在两套引物联合使用的条件下，进行最佳反应时间的优化。在改良的反应体系条件下，加入结核分枝杆菌DNA模板(连续稀释)及针对IS6110和IS1081基因所设计的MCDA引物。运用连续稀释好的MTB基因组DNA作为模板。反应在恒温条件下进行(67℃)，恒温时间分别10分钟，20分钟，30分钟和40分钟。运用LFB检测显示：MCDA-LFB技术在检测MTBC时，最佳反应时间为30分钟(图6)。当MCDA体系在扩增步骤恒温30分钟时，检测限水平的模板能够被检出(图6C)。图6C中，LFB检测范围为10pg～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(LFB1-LFB4)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB5)。图6运用LFB可视化读取MCDA体系从10分钟到40分钟的扩增结果；LFB1到LFB5表示MTBC的模板量分别为10pg，1pg，100fg，10fg和1fg，LFB6-7为阴性对照，Gram+肺炎链球菌和Gram-肺炎克雷伯菌，LFB8为空白对照。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种用于多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括置换引物、交叉引物和扩增引物；
所述置换引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110-F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物6110-F2；和/或序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081-F1，和序列如SEQ ID NO:12所示的置换引物1081-F2
所述交叉引物包括序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110-CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物6110-CP2；和/或序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081-CP1和序列如SEQ ID NO:14所示的交叉引物1081-CP2
所述扩增引物包括序列如SEQ ID NO:5所示的，并在SEQ ID NO:5所示序列的5’端标记半抗原的扩增引物6110-C1*，序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110-C2，序列如SEQ IDNO:7所示的扩增引物6110-D1，序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110-D2，序列如SEQ IDNO:9所示的扩增引物6110-R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110-R2；和/或序列如SEQ ID NO:15所示的，并在SEQ ID NO:15所示序列的5’端标记半抗原的扩增引物1081-C1*，序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081-C2，序列如SEQ ID NO:17所示的扩增引物1081-D1，序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081-D2，序列如SEQ ID NO:19所示的扩增引物1081-R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081-R2。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，在所述扩增引物6110-C1*和/或1081-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素。
3.权利要求1或2所述的引物组合在制备检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒中的应用。
4.一种基于非诊断目的的多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供权利要求1或2所述的引物组合；
(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、步骤(2)引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、纳米分子垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在纳米分子垫、检测线及控制线区域依次包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗异硫氰酸荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在65-68℃恒温环境中进行的；所述恒温扩增的时间为30分钟。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在67℃的环境中进行的。
8.一组用于恒温扩增结核分枝杆菌复合群的IS6110的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110-F1和序列如SEQ ID NO:2所示的6110-F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110-CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的6110-CP2；提供序列如SEQ ID NO:5所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物6110-C1*和序列如SEQ IDNO:6所示的扩增引物6110-C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物6110-D1和序列如SEQID NO:8所示的扩增引物6110-D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物6110-R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110-R2。
9.一组用于恒温扩增结核分枝杆菌复合群的IS1081的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081-F1，和序列如SEQ ID NO:12所示的1081-F2，提供序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081-CP1和序列如SEQ ID NO:14所示的1081-CP2；提供序列如SEQ ID NO:15所示的，并在5’端标记半抗原的扩增引物1081-C1*和序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081-C2，序列如SEQ ID NO:17所示的扩增引物1081-D1和序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081-D2，序列如SEQ ID NO:19所示的扩增引物1081-R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081-R2。
10.根据权利要求8或9所述的引物，其特征在于，在所述扩增引物6110-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素；
在所述扩增引物1081-C1*的5’端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素。
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