CN116904630A - 一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116904630A CN116904630A CN202311170303.3A CN202311170303A CN116904630A CN 116904630 A CN116904630 A CN 116904630A CN 202311170303 A CN202311170303 A CN 202311170303A CN 116904630 A CN116904630 A CN 116904630A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mycobacterium tuberculosis
- detecting
- detection
- kit
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 22
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229910021485 fumed silica Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 12
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 7
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 7
- JCBJVAJGLKENNC-UHFFFAOYSA-M potassium ethyl xanthate Chemical compound [K+].CCOC([S-])=S JCBJVAJGLKENNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 4
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 20
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 19
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 19
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 5
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011976 chest X-ray Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229940051841 polyoxyethylene ether Drugs 0.000 description 2
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000015355 drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 206010029410 night sweats Diseases 0.000 description 1
- 230000036565 night sweats Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/32—Mycobacterium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒。本发明提供了用于实时荧光定量PCR检测结核分支杆菌的2组引物探针组合，分别针对IS6110序列和IS1081序列。本发明提供的试剂盒适用于舌拭子，并对核酸提取试剂和扩增反应试剂进行了优化，灵敏度和特异性高，能有效实现对样品的定性定量检测，极大的降低了结核的漏诊率。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒。
背景技术
目前对于结核病可疑症状者和结核病发病高危人群等最常用的筛查方法即症状筛查和胸部X线检查。结核病常见的症状包括咳嗽、咳痰、发热、盗汗及体质量减轻等。症状常来自可疑者的主诉，主观性强，不同的疾病常表现出相同或相似的症状，这种方法症状筛查虽然成本低，但不足以识别真正的结核病可疑者，也无法区分结核病可疑者和其他疾病患者。胸部X线检查也是目前最为广泛的肺部疾病检查方法，胸部X线片上正常、异常的组织和结构并存，即使有经验的医务人员花费足够的时间阅片也不能保证读片结果的准确性。因此，实际工作中，常常将症状筛查或胸片X线检查结果异常者推介到结核病定点医疗机构进行进一步的检查。
目前用于结核病患者发现的方法包括传统诊断方法和快速诊断方法两大类，这两种方法大多数基于检测结核病可疑者的痰标本。传统涂片、培养和药敏试验仍然是诊断结核病和耐药结核病的主要方法。传统涂片和培养检查均需要检测的痰标本中有一定的细菌载量，并且对检验人员有一定的技术要求。当痰标本不合格或患者处于发病早期导致标本中细菌载量低的情况下可影响检测结果，有可能造成患者漏诊。大多数新诊断技术包括结核病快速诊断技术和基因组测序技术，这些方法检测的标本大多数是痰标本或者培养阳性的菌株，新技术的检测结果仍然受到痰标本质量或培养工作质量的影响。目前临床上重症结核病患者的比例下降，轻症或无明显症状的结核病患者的比例增加，采集到合格痰标本的概率降低，同时部分患者如儿童、结核病合并艾滋病病毒感染者等采集到合格的痰标本非常困难，因此，基于痰标本检测方法来发现这部分患者存在一定的局限性。
结核分枝杆菌感染人体后，从潜伏感染状态进展到临床前期、临床期的时间周期较长，不同时期的可疑者采集到合格痰标本的概率不同，加上现有检测技术灵敏度的限制，有可能不能及时发现患者。对于部分没有痰标本的结核病可疑者，可通过在舌背用拭子采集标本进行检测。标本的检测可采用现有检测技术。有研究通过采用Xpert MTB/RIF Ultra检测舌拭子，结果显示其灵敏度低于痰标本。因Xpert MTB/RIF Ultra目前的标本处理流程是基于检测痰标本的方法，如果用来处理舌拭子标本，后期还需要进一步的优化。但在大规模筛查时，对于无痰标本的可疑者，舌拭子标本可作为患者发现的一种补充手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法，舌拭子标本相对于痰标本更容易收集和获取。
基于上述目的，本发明提供了一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒来解决舌拭子采集样本灵敏度低的问题。
一方面，本发明涉及一种用于结核分支杆菌检测的引物组，其包括用于检测IS6110序列的引物组和用于检测IS1081序列的引物组；
所述用于检测IS6110序列的引物组：
IS6110-F1，如SEQ ID NO .1所示；
IS6110-R1，如SEQ ID NO .2所示；
IS6110-P1，如SEQ ID NO .3所示；
所述用于检测IS1081序列的引物组：
IS1081-F2，如SEQ ID NO .4所示；
IS1081-R2，如SEQ ID NO .5所示；
IS1081-P2，如SEQ ID NO .6所示。
另一方面，本发明涉及一种用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其包括结核分支杆菌检测组件，所述结核分支杆菌检测组件包括：上述用于结核分支杆菌检测的引物组、烷基酚聚氧乙烯醚、PCR缓冲液、dNTPs、热启动酶、UDG酶、逆转录酶。
进一步地，本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒中，所述结核分支杆菌检测组件中，以烷基酚聚氧乙烯醚、PCR缓冲液、dNTPs构成反应液，烷基酚聚氧乙烯醚在所述反应液中的浓度为0.5~1μg/mL。
进一步地，本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒中，还包括舌拭子提取组件，所述舌拭子提取组件包括：β巯基乙醇、裂解液、疏水性气相二氧化硅、锆珠或玻璃珠、羟基琼脂糖磁珠、蛋白酶K、第一洗涤液、第二洗涤液、无酶无菌水；
所述裂解液包括KCl、异硫氰酸胍、乙基黄原酸钾、疏水性气相二氧化硅、烷基酚聚氧乙烯醚、曲拉通X-100、Tris溶液；
所述第一洗涤液包括异硫氰酸胍、Tris溶液、无酶无菌水和无水乙醇；
所述第二洗涤液包括Tris溶液和无水乙醇。
进一步地，本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒中，所述裂解液由3~5mol/L氯化钾、3~5mol/L异硫氰酸胍、1w%乙基黄原酸钾、0.5~3w%烷基酚聚氧乙烯醚、4~8w%曲拉通X-100、0.5~1mol/L Tris溶液构成；
所述第一洗涤液由6mol/L异硫氰酸胍、20mM Tris溶液、无酶无菌水和无水乙醇依照7:12.5:8.5:22的体积比混合制成；
所述第二洗涤液由25mM Tris溶液和无水乙醇依照22:28的比例混合；
羟基琼脂糖磁珠吸附前加入疏水性气相二氧化硅至疏水性气相二氧化硅的终浓度为0.2~0.5w%。
进一步地，本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒中，探针P1用FAM标记，探针P2用Cy5标记。
另一方面，本发明涉及一种结核分支杆菌的检测方法，条件是排除以非疾病诊断或治疗为目的，采用上述的试剂盒检测。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
本发明提供了一种用于结核分支杆菌检测的引物组，其基于结核分支杆菌的IS6110序列和IS1081序列设计，两个靶基因和位点检测能有效降低漏检和错检的概率，提高试剂盒检测的准确性。本发明还提供了用于结核分支杆菌检测的试剂盒，基于实时荧光定量PCR技术，检测样本中结核分支杆菌，不仅可以对样品进行定性定量的检测，还可以实时观测数据的变化，有利于对样品数据的全面收集，方便进行下一步的研究。因此本发明不仅适用于现场快速检测，还适用于以科研为目的的检测。本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒通过在裂解液中加入疏水性气相二氧化硅和烷基酚聚氧乙烯醚，有利于结核分支杆菌的裂解，提高舌拭子样本的核酸质量，从而解决舌拭子采集样本灵敏度低的问题，并在结核分支杆菌检测组件中加入了烷基酚聚氧乙烯醚，改善了来源于舌拭子样本的检出限。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1为对含IS1081序列和IS6110序列基因片段的质粒的扩增结果。
其中，1为实施例1的扩增结果，2为对比例1的扩增结果，3为对比例2的扩增结果，4为阴性对照的扩增结果。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例提供了引物的设计筛选。
根据结核感染诊断测试方法的综合指南，为了确保结核分支杆菌的检出并且避免出现假阳性或假阴性，选择致病区域IS1081序列和保守区域IS6110序列的为靶点进行检测。
本发明中选择了IS1081序列和IS6110序列多个不同位置分别设计了10组引物，分别对每组引物进行测试并筛选。基于大量引物设计和筛选工作，最终优选出的两组最佳引物。
用于检测IS6110序列的引物组：IS6110-F1，如SEQ ID NO .1所示；IS6110-R1，如SEQ ID NO .2所示；IS6110-P1，如SEQ ID NO .3；
用于检测IS1081序列的引物组：IS1081-F2，如SEQ ID NO .4所示；IS1081-R2，如SEQ ID NO .5所示；IS1081-P2，如SEQ ID NO .6所示。
由于内容过多，仅选择部分结果作为对比例进行呈现：
对比例1
用于检测IS6110序列的引物组：IS6110-F3，如SEQ ID NO .7所示；IS6110-R3，如SEQ ID NO .8所示；IS6110-P3，如SEQ ID NO .9；
用于检测IS1081序列的引物组：IS1081-F4，如SEQ ID NO .10所示；IS1081-R4，如SEQ ID NO .11所示；IS1081-P4，如SEQ ID NO .12所示。
对比例2
用于检测IS6110序列的引物组：IS6110-F5，如SEQ ID NO .13所示；IS6110-R5，如SEQ ID NO .14所示；IS6110-P5，如SEQ ID NO .15所示；
用于检测IS1081序列的引物组：IS1081-F6，如SEQ ID NO .16所示；IS1081-R6，如SEQ ID NO .17所示；IS1081-P6，如SEQ ID NO .18所示。
在IS1081序列和IS6110序列检测引物组的基础上，还设置了内参基因：RNase P-F7，如SEQ ID NO .19所示；RNase P-R7，如SEQ ID NO .20所示；RNase P-P7，如SEQ ID NO.21所示。内参用rox通道。
鉴定试剂（50μL的反应体系）组成：
在实时荧光定量PCR仪7500中进行扩增反应，荧光通道选择为：FAM和Cy5；
PCR扩增程序如下：
37℃ 2min；95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，40个循环；Hold 4℃ ∞。
结果判定：PCR结束后，通过不同通道荧光曲线及CT值判断结核分支杆菌核酸阴、阳性。
应用dsDNA HS Assay Kit试剂盒，对含IS1081序列和IS6110序列基因片段的质粒溶液进行浓度测定，具体操作步骤详见试剂盒说明书。每次检测同时检测阴性对照品、阳性对照品，当检测结果的阳性对照品为阳性，阴性对照品为阴性，表明结果有效。
检测结果如图1所示。从图1可以看出，检测样品与阳性对照品同时出现典型的扩增曲线且CT值≤36，因此样品为结核分支杆菌阳性。说明本发明用于结核分支杆菌检测的试剂盒具有检测结核分支杆菌的能力。
实施例2
本实施例提供了用于结核分支杆菌检测的试剂盒的灵敏度试验。
对含IS1081序列和IS6110序列基因片段的质粒梯度稀释至106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL，10copies/mL。参照实施例1的反应体系，设以下试验组，试验组1：在反应体系中加入烷基酚聚氧乙烯醚，使得烷基酚聚氧乙烯醚在所述反应液中的浓度为0.5μg/mL；试验组2：在反应体系中加入烷基酚聚氧乙烯醚，使得烷基酚聚氧乙烯醚在所述反应液中的浓度为0.8μg/mL；试验组3：在反应体系中加入烷基酚聚氧乙烯醚，使得烷基酚聚氧乙烯醚在所述反应液中的浓度为1.0μg/mL；对比组1：在反应体系中加入SDS，使得SDS在所述反应液中的浓度为0.8μg/mL；对比组2：在反应体系中加入甘油，使得甘油在所述反应液中的浓度为0.8μg/mL；对比组3：不额外添加。使用试验例1所述的方法对上述稀释后的样品分别进行扩增，将扩增结果转换为灵敏度结果，具体如表1所示。灵敏度判断标准：优，准确检测到目的基因片段；良，可以检测出目的基因片段；差，无法检测出目的基因片段。
表1，灵敏度试验结果
由表1可知，对照对比组1和2的试验结果，采用烷基酚聚氧乙烯醚相对于SDS和甘油更能有效提高对目的基因的检测灵敏度，本申请实施例认为通过表面活性剂的添加能够改善反应体系的发散情况，但由于表面活性剂的性质不同，改善情况也不尽相同，但烷基酚聚氧乙烯醚表现出更为优异的试验结果，这可能与烷基酚聚氧乙烯醚能改善荧光有关。
实施例3
本实施例提供了用于结核分支杆菌检测的试剂盒的应用试验。
试验样本：医院提供的结核分支杆菌疑似患者样本（50名），对于同一患者，分别采集舌拭子标本（舌背用拭子采集标本，使用的拭子同咽拭子）、痰标本，以痰液培养作为肺结核病诊断金标准，判断舌拭子标本的试验准确性。
试验组4：380μLTE缓冲液（pH7.5~8,5）装入300 mg的锆珠，投入舌拭子标本或痰标本，机械打断（6m/s, 匀浆6次，30s间隔） ，取200μL上清液；向上清液中加入200μL裂解液1（3mol/L氯化钾、3mol/L异硫氰酸胍、1w%乙基黄原酸钾、0.5w%烷基酚聚氧乙烯醚、4w%曲拉通X-100、0.5mol/L Tris溶液），混匀后按其1/10的体积加入蛋白酶K；向待处理液中加入疏水性气相二氧化硅至疏水性气相二氧化硅（品牌：Sigma-Aldrich）的终浓度为0.2w%，然后加入30μL羟基琼脂糖磁珠（规格：10mg/mL，500nm；购自北京百奥莱博科技有限公司），上下颠倒混匀，静置5min，磁珠吸附完成后，加入800μL第一洗涤液（6mol/L异硫氰酸胍、20mMTris溶液、无酶无菌水和无水乙醇依照7:12.5:8.5:22的体积比混合制成）振荡混匀20秒洗涤然后静置1min，800μL第二洗涤液（由25mM Tris溶液和无水乙醇依照22:28的比例混合制得）振荡混匀20秒洗涤然后静置1min，800μL第二洗涤液1振荡混匀20秒洗涤然后静置1min，加入40 µL洗脱缓冲液（购自北京百奥莱博科技有限公司），振荡混匀，置于75℃，孵育5min，期间颠倒混匀3次。
试验组5：试验方法同试验组4，区别在于将锆珠替换为玻璃珠，采用裂解液2（4mol/L氯化钾、4mol/L异硫氰酸胍、1w%乙基黄原酸钾、1w%烷基酚聚氧乙烯醚、6w%曲拉通X-100、0.8mol/L Tris溶液），向待处理液中加入疏水性气相二氧化硅至疏水性气相二氧化硅的终浓度为0.4w%。
试验组6：试验方法同试验组4，区别在于采用裂解液3（5mol/L氯化钾、5mol/L异硫氰酸胍、1w%乙基黄原酸钾、3w%烷基酚聚氧乙烯醚、8w%曲拉通X-100、1.0mol/L Tris溶液），向待处理液中加入疏水性气相二氧化硅至疏水性气相二氧化硅的终浓度为0.5w%。
对比组4：试验方法同试验组4，区别在于未加入疏水性气相二氧化硅；
对比组5：试验方法同试验组4，区别在于将羟基琼脂糖磁珠替换为Amersham即用型RT-PCR磁珠（非琼脂糖磁珠）；
对比组6：试验方法同试验组4，区别在于未加入疏水性气相二氧化硅，且将羟基琼脂糖磁珠替换为Amersham即用型RT-PCR磁珠（非琼脂糖磁珠）。
参照实施例1的反应体系，根据实时荧光定量PCR仪检测结果判断阳性检出率（判断为阳性占总检测人数的比例）和检验漏诊率（针对同一患者标准，判断结果与痰液培养结果不一致在痰液培养结果为阳性的人中的占比），试验结果如表2所示。
表2，应用试验结果
由表2可知，本发明提供的试剂盒适用于舌拭子，并对核酸提取试剂和扩增反应试剂进行了优化，极大地降低了检验漏诊率。由表2可知，疏水性气相二氧化硅的加入，有利于羟基琼脂糖磁珠对核酸的吸附，进而降低了检验漏诊率，但疏水性气相二氧化硅的加入对非琼脂糖的磁珠的改善效果则不太明显。
综上，本发明提供的用于结核分支杆菌检测的试剂盒通过在裂解液中加入疏水性气相二氧化硅和烷基酚聚氧乙烯醚，有利于结核分支杆菌的裂解，提高舌拭子样本的核酸质量，从而解决舌拭子采集样本灵敏度低的问题，并在结核分支杆菌检测组件中加入了烷基酚聚氧乙烯醚，改善了来源于舌拭子样本的检出限。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于结核分支杆菌检测的引物组，其特征在于，包括用于检测IS6110序列的引物组和用于检测IS1081序列的引物组；
所述用于检测IS6110序列的引物组：
IS6110-F1，如SEQ ID NO .1所示；
IS6110-R1，如SEQ ID NO .2所示；
IS6110-P1，如SEQ ID NO .3所示；
所述用于检测IS1081序列的引物组：
IS1081-F2，如SEQ ID NO .4所示；
IS1081-R2，如SEQ ID NO .5所示；
IS1081-P2，如SEQ ID NO .6所示。
2.一种用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其特征在于，包括结核分支杆菌检测组件，所述结核分支杆菌检测组件包括：权利要求1所述的用于结核分支杆菌检测的引物组、烷基酚聚氧乙烯醚、PCR缓冲液、dNTPs、热启动酶、UDG酶、逆转录酶。
3.根据权利要求2所述的用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其特征在于，以烷基酚聚氧乙烯醚、PCR缓冲液、dNTPs构成反应液，烷基酚聚氧乙烯醚在所述反应液中的浓度为0.5~1μg/mL。
4.根据权利要求2所述的用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其特征在于，还包括舌拭子提取组件，所述舌拭子提取组件包括：
β巯基乙醇、裂解液、疏水性气相二氧化硅、锆珠、羟基琼脂糖磁珠、蛋白酶K、第一洗涤液、第二洗涤液、无酶无菌水，
或β巯基乙醇、裂解液、疏水性气相二氧化硅、玻璃珠、羟基琼脂糖磁珠、蛋白酶K、第一洗涤液、第二洗涤液、无酶无菌水；
所述裂解液包括KCl、异硫氰酸胍、乙基黄原酸钾、烷基酚聚氧乙烯醚、曲拉通X-100、Tris溶液；
所述第一洗涤液包括异硫氰酸胍、Tris溶液、无酶无菌水和无水乙醇；
所述第二洗涤液包括Tris溶液和无水乙醇。
5.根据权利要求4所述的用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其特征在于，所述裂解液由3~5mol/L氯化钾、3~5mol/L异硫氰酸胍、1w%乙基黄原酸钾、0.5~3w%烷基酚聚氧乙烯醚、4~8w%曲拉通X-100、0.5~1mol/L Tris溶液构成；
所述第一洗涤液由6mol/L异硫氰酸胍、20mM Tris溶液、无酶无菌水和无水乙醇依照7:12.5:8.5:22的体积比混合制成；
所述第二洗涤液由25mM Tris溶液和无水乙醇依照22:28的比例混合；
羟基琼脂糖磁珠吸附前加入疏水性气相二氧化硅至疏水性气相二氧化硅的终浓度为0.2~0.5w%。
6.根据权利要求2所述的用于结核分支杆菌检测的试剂盒，其特征在于，探针P1用FAM标记，探针P2用Cy5标记。
7.一种结核分支杆菌的检测方法，其特征在于，条件是排除以疾病诊断或治疗为目的，采用权利要求2~6任一项所述的试剂盒检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311170303.3A CN116904630B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311170303.3A CN116904630B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116904630A true CN116904630A (zh) | 2023-10-20 |
| CN116904630B CN116904630B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=88365397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311170303.3A Active CN116904630B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116904630B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5731150A (en) * | 1995-11-01 | 1998-03-24 | Chiron Diagnostic Corporation | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis |
| CN105510261A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-04-20 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的d3-羟丁酸（d3h）检测试剂及其检测方法 |
| CN112063617A (zh) * | 2020-10-09 | 2020-12-11 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒 |
| CN114292904A (zh) * | 2021-12-25 | 2022-04-08 | 武汉承启医学检验实验室有限公司 | 一种优化ctDNA检测准确率的方法 |
| CN115637267A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-01-24 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种核酸的提取试剂及其试剂盒和提取方法 |
| CN116042777A (zh) * | 2019-03-15 | 2023-05-02 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法 |
| KR20230057778A (ko) * | 2021-10-22 | 2023-05-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311170303.3A patent/CN116904630B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5731150A (en) * | 1995-11-01 | 1998-03-24 | Chiron Diagnostic Corporation | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis |
| CN105510261A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-04-20 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的d3-羟丁酸（d3h）检测试剂及其检测方法 |
| CN116042777A (zh) * | 2019-03-15 | 2023-05-02 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法 |
| CN112063617A (zh) * | 2020-10-09 | 2020-12-11 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒 |
| KR20230057778A (ko) * | 2021-10-22 | 2023-05-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트 |
| CN114292904A (zh) * | 2021-12-25 | 2022-04-08 | 武汉承启医学检验实验室有限公司 | 一种优化ctDNA检测准确率的方法 |
| CN115637267A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-01-24 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种核酸的提取试剂及其试剂盒和提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116904630B (zh) | 2023-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021196498A1 (zh) | 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| US11649511B2 (en) | Multiplex PCR method for the detection of SARS-CoV-2 | |
| McCoy et al. | qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue of gastrointestinal biopsies | |
| Grainge et al. | Cervical human papillomavirus screening among older women | |
| US11505834B2 (en) | Method for detecting Brucella infection and application thereof | |
| CN107245531B (zh) | 腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用 | |
| WO2021212523A1 (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| CN109355406B (zh) | 一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒 | |
| CN111471800B (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| Zou et al. | Value analysis of next-generation sequencing combined with Xpert in early precise diagnosis of pulmonary tuberculosis | |
| CN116904630B (zh) | 一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒 | |
| CN115873979B (zh) | 一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增raa引物探针组合及其应用 | |
| Kalani et al. | High occurrence of emerged lophomonas infection among patients suspected of having pulmonary tuberculosis: In-house pcr-based evidence | |
| Ghanekar et al. | Role of line probe assay in detection of extra-pulmonary tuberculosis: experience from a tertiary care hospital in western Maharashtra | |
| Li et al. | Diagnostic Value of Metagenomic Next‐Generation Sequencing for Pneumonia in Immunocompromised Patients | |
| Qiao et al. | Clinical significance of quantitative and qualitative detection of BK and JC virus in blood and urine of renal transplantation recipients | |
| Su et al. | Performance of sexually transmitted disease laboratories for Chlamydia trachomatis detection in Guangdong, China | |
| Jiang et al. | Research progress on detection methods of the asymptomatic COVID-19 infected persons. | |
| Mulahuseinovic et al. | Comparative analysis of SARS-CoV-2 detection kits | |
| Zhao et al. | Epidemiological characteristics of 369 tuberculosis patients with multidrug resistance inHainan Island: A cross-sectional study. | |
| Juvet et al. | Saliva sample for testing SARS-CoV-2 infection–a rapid review | |
| Bahceci | Epidemiology of Tuberculosis with comparison of the efficacy of culture, realtime PCR and direct microscopy in the diagnosis of tuberculosis | |
| WO2022266946A1 (zh) | 检测病原体rna、及动物或人类基因rna的试剂盒及其应用 | |
| Jiang et al. | Evaluation of nucleotide MALDI-TOF MS on bronchoalveolar lavage fluid for pulmonary Tuberculosis: experience from a tertiary hospital in southwestern China | |
| Zeng et al. | Nucleic Acid Detection of Severe Acute Respiratory Syndrome Virus 2 (SARS-CoV-2): A Research in the Field of Health Economics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |