CN112063617A - 一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒 - Google Patents

一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学临床诊断试剂领域，特别涉及一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，包括裂解液，磁珠悬液，清洗液和洗脱液；所述裂解液包括3‑5mol/L氯化钾、3‑5mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液；所述磁珠悬液为聚乙烯亚胺修饰的磁珠组成的核酸吸附载体；所述清洗液为盐酸溶液；所述洗脱液为氢氧化钠溶液；进一步提出一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，以最终实现痰液中结核杆菌核酸的高质量快速提取与检测，降低提取成本，简化操作流程，避免挥发性有机溶剂及高浓度盐溶液的使用，减轻试剂盒试剂对操作人员人身健康造成危害，同时试剂盒具有与现有自动化检测技术结合，实现高通量、大规模核酸提取与检测的潜力。

Description

一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学临床诊断试剂领域，特别涉及一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，简称结核杆菌)是引起结核病的病原体，该菌可以感染人体以肺部为主的全身组织器官，对人类生命健康造成重大威胁。随着抗结核药物和卡介苗的出现以及医疗水平的提高，结核杆菌的感染曾经一度大幅下降。但由于抗生素滥用，耐药菌株的出现以及艾滋病的流行等原因，全球范围内的结核病的流行又趋于恶化。据世界卫生组织估计，在2018年全球有约1000万新感染结核杆菌的病例发生，超过120万人死于结核杆菌感染。因此，目前对于结核病的防控依赖于快速准确的诊断方案。
痰液中致病微生物的检测对于结核病的诊断与治疗具有非常重要的意义。首先在诊断过程中可以直接通过痰液中致病微生物的检测确定是否感染结核杆菌，目前也是结核病诊断的金标准。此外在结核病的治疗过程中，痰液中结核杆菌的转阴情况被视为重要的指标去判断感染菌株的耐药性以及是否进入巩固治疗阶段。
对于痰液中的结核杆菌的检测，常用的技术手段包含直接涂片镜检法、分离培养法和动物实验法。其中直接涂片镜检操作简单快速，但是敏感性较低，而且特异性较差，无法区分细菌的死活以及具体的菌种。分离培养法和动物实验法均需要对痰液中的细菌进行培养繁殖，虽然能够检测鉴定菌株以及药物敏感性，但是检测周期较长，通常需要数周时间，会延误诊断及治疗。随着分子生物学的发展，其具有的敏感快速的优势被应用到检测痰液中结核杆菌的菌种以及耐药性中。但是如何从痰液中高效快速地提取分枝杆菌的核酸进行后续检测成为目前的瓶颈。
痰液是呼吸道受刺激而分泌的液体，其包含了粘液、脱落的上皮细胞、免疫细胞以及微生物。其表现为粘稠状液体，粘稠度的增加主要是因为其中含有的酸性蛋白质通过二硫键交联在一起形成网状凝胶，而在呼吸道感染时，大量免疫细胞的凋亡释放DNA又使痰液的粘稠度进一步提高。由于这些粘液的存在，使其中的细胞成分分离的效率低下，造成DNA提取困难。常见的痰液中核酸提取方法首先会对痰液进行液化处理，通过NaOH、蛋白酶K、二硫苏糖醇(DTT)中的一种或几种组合将痰液处理成为透明液体，而后进行核酸的释放以及纯化。这些方法或步骤繁琐，在结核杆菌失活前多次开盖处理增加污染的风险；或使用大量挥发性有机溶剂，对操作人员存在较大危害，或最终提取的核酸总量有限，效果不理想。
对比现有已公开的痰液中结核分枝杆菌核酸提取的专利技术方案，《一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用》(专利号：CN200810105172.X)、《检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒》(专利号：CN200610037592.X)、《结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法》(专利号：CN201410185161.2)、《一种结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒》(专利号：CN201410403854.4)等传统方法均依赖于痰液的液化处理，增加了操作步骤，同时也带来了生物污染的风险，缩短操作流程是技术发展优化的一个方向。《一种从痰液中快速提取核酸的方法》(专利号：CN201711475154.6)利用前处理液实现对痰液的液化和核酸酶失活，简化了操作流程，但其过程中使用氯仿和β-巯基乙醇等挥发性有机溶剂，对操作人员存在较大危害风险。《核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒》(专利号：CN202010347016.5)使用传统硅基吸附柱、磁珠或玻璃珠等作为核酸载体进行纯化，在清洗液、加强液中引入的不同浓度盐离子，存在污染后续核酸纯化的风险。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种实现一步灭活结核杆菌及其核酸释放，避免使用高浓度盐溶液及挥发性有机溶剂的快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法和试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，包括裂解液，磁珠悬液，清洗液和洗脱液，所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾。
进一步提出一种快速提取痰液中结合杆菌核酸的方法，包括如下步骤：
步骤1，将裂解液与痰液样品混合均匀后，100℃处理15min，离心取上清液并将磁珠悬液与上清液混合；所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾；
步骤2，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，使用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，使用洗脱液将吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱。
本发明的有益效果在于：
1、本发明实现对痰液内结核杆菌的灭活及其核酸释放的一步操作，简化操作流程，并将结核杆菌灭活处理以保障操作人员人身健康，有效避免可能的生物污染的发生；
2、本发明在裂解液中添加高浓度氯化钾以实现对高温溶液中释放的游离核酸进行保护，提高核酸提取质量。
附图说明
图1所示为本发明中结核分枝杆菌菌种鉴定结果；
图2所示为本发明中结核杆菌对利福平耐药基因的检测结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：通过将结核杆菌灭活及其核酸释放步骤相结合以避免生物污染，同时在裂解液中加入高浓度钾离子以保护高温溶液中释放的游离核酸，提升核酸的提取质量。
本发明为一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，包括裂解液，磁珠悬液，清洗液和洗脱液；所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾。
具体的，本发明的实验过程为：
1、痰液样本收集；
2、痰液样本与裂解液等量混合，并对结核杆菌高温灭活处理；
3、向混合溶液中加入磁珠悬液以使核酸吸附于磁珠悬液内的核酸吸附载体上；
4、加入清洗液对核酸吸附载体上杂质进行清洗；
5、加入洗脱液对核酸吸附载体上核酸进行洗脱。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：裂解液与痰液样本在高温下对结核杆菌进行灭活处理，此时高浓度氯化钾中钾离子能够有效保护释放在溶液中游离的核酸，以提高核酸提取质量。
进一步的，所述裂解液还包括3-5mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液，所述裂解液溶液pH＝6.0。
从上述描述可知，裂解液中盐酸胍能够有效使蛋白质变性以及抑制RNase，同时对核酸起增溶作用，促进核酸溶于混合液内；乙基黄原酸钾能够有效破坏细胞壁，促进核酸的释放，同时可以与混合液内金属离子结合，抑制DNase活性。
优选的，所述氯化钾的物质的量浓度为4mol/L，所述盐酸胍的物质的量浓度为4mol/L。
可选的，所述氯化钾可由氯化镁所替代。
进一步的，所述磁珠悬液包括核酸吸附载体，所述核酸吸附载体为聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0。
从上述描述可知，由于聚乙烯亚胺对游离核酸有较好的吸附作用，同时聚乙烯亚胺修饰的磁珠对溶液pH敏感的特性，即可以通过调节溶液pH值改变磁珠表面的带电属性，从而实现磁珠对核酸的吸附与释放。同时也基于此，即在本实验过程中可以避免使用挥发性有机溶剂或高浓度盐溶液使核酸与核酸吸附载体分离，有效保障操作人员的人身安全以及降低纯化操作复杂度，提高提取质量和纯化效率。
进一步的，所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0。
从上述描述可知，通过盐酸清洗核酸吸附载体表面杂质的同时，通过盐酸调节聚乙烯亚胺的带电属性从而进一步使核酸牢牢吸附于核酸吸附载体上，提高核酸提取质量。
进一步的，所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
从上述描述可知，通过氢氧化钠溶液的加入调节聚乙烯亚胺的带电属性从而使核酸从核酸吸附载体上释放，同时也避免使用在常规操作中通过有机挥发溶剂或高浓度盐溶液对核酸进行洗脱，降低试剂对操作人员的损害，同时也降低洗脱及提取成本。
进一步的，所述裂解液包括4mol/L氯化钾、4mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液；
所述磁珠悬液包括核酸吸附载体，所述核酸吸附载体为聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0；
所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0；
所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
进一步的，提出了一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，包括如下步骤：
步骤1，将裂解液与痰液样品混合均匀后，100℃处理15min，离心取上清液并将磁珠悬液与上清液混合；所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾；
步骤2，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清，使用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，使用洗脱液将吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱。
进一步的，所述裂解液包括4mol/L氯化钾、4mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液；
所述磁珠悬液包括核酸吸附载体，所述核酸吸附载体为聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0；
所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0；
所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
进一步的，上述方法还可以为如下步骤：
步骤1，取痰液样品与裂解液等体积混合，混合液100℃处理15min；
步骤2，离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置；
步骤3，将离心管静置于磁力架上，静置后除去离心管内液体；
步骤4，向离心管内加入清洗液，震荡混匀，并重复步骤三；
步骤5，向离心管内加入洗脱液，吹打混匀，离心管于磁力架上静置；
步骤6，转移离心管内的上清液，分离得到结核杆菌核酸。
更进一步的，上述方法还可以为如下步骤：
步骤1，向痰液样品中加入等体积裂解液，100℃处理15分钟；
步骤2，12000rpm离心5min，吸取上清液500μL至离心管，向离心管加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠的磁珠悬液300μL，混匀，静置5min；
步骤3，将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；
步骤4，将离心管取下，加入500μL清洗液，震荡混匀30s；
步骤5，将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；
步骤6，将离心管取下，加入20-100μL洗脱液，吹打混匀，静置3min；
步骤7，转移离心管内的上清液，获得结核杆菌核酸。
综上所述，本发明提供的一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，实现对痰液内结核杆菌的灭活及其核酸释放的一步操作，简化操作流程，并将结核杆菌灭活处理以保障操作人员人身健康，有效避免可能的生物污染的发生；同时在裂解液中添加高浓度氯化钾以实现对高温溶液中释放的游离核酸进行保护，提高核酸提取质量；通过对磁珠进行聚乙烯亚胺的修饰处理，以提高核酸纯化回收效率，同时避免挥发性有机溶液及高浓度盐溶液的使用以分离核酸，节省纯化成本，降低实验污染，进一步保障操作人员人身健康。
实施例一：
步骤1：向痰液样品中加入等体积裂解液，100℃处理15min，使痰液中的结核杆菌灭活并释放核酸；
步骤2：12000rpm离心5min，吸取上清液500μL至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠溶液300μL，混匀，静置5min；
步骤3：将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；
步骤4：将离心管取下，加入500μL清洗液，震荡混匀30s；
步骤5：将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；
步骤6：将离心管取下，加入20-100μL洗脱液，吹打混匀，静置3min；
步骤7：将离心管置于磁力架上静置；
步骤8：将上清液转移到新的离心管中，若不立即使用，-20℃保存。
验证例一：
使用分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)(亚能生物技术(深圳)有限公司，国械注准20153400229)对痰液样本中分枝杆菌的菌种进行鉴定，具体操作方式，如PCR扩增、杂交、洗膜和显色均依照上述试剂盒说明书进行。
如图1所示，实验结果显示，在五个痰液样本中，P8中检测出不产色分枝杆菌，P9中检测出结核分枝杆菌，样品N10-N12均未检测出分枝杆菌。
验证例二：
对结核分枝杆菌鉴定阳性的样品使用利福平耐药突变基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)(亚能生物技术(深圳)有限公司，国械注准20153400356)检测阳性样品P9中是否存在与利福平耐药相关的基因突变，具体操作方式，如PCR扩增、杂交、洗膜和显色均依照上述试剂盒说明书进行。
如图2所示，实验结果显示，阳性样品P9含有利福平耐药基因突变S531L。
综上可以看出，本试剂盒所提取出的结核杆菌核酸与传统结核杆菌核酸提取方法结果显示为一致，即本试剂盒适用对结核杆菌核酸常规检测，同时由于本试剂盒所涉及使用方法步骤简单，操作便捷，具有与现有自动化检测技术结合，实现高通量、大规模核酸提取与检测的潜力。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，包括裂解液，磁珠悬液，清洗液和洗脱液；其特征在于，所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾。
2.根据权利要求1所述一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括3-5mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液，所述裂解液溶液pH＝6.0。
3.根据权利要求2所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述氯化钾的物质的量浓度为4mol/L，所述盐酸胍的物质的量浓度为4mol/L。
4.根据权利要求1所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0。
5.根据权利要求1所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0；
所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
6.根据权利要求1所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括4mol/L氯化钾、4mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液，所述裂解液溶液pH＝6.0；
所述磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0；
所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0；
所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
7.一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将裂解液与痰液样品混合均匀后，100℃处理15min，离心取上清液并将磁珠悬液与上清液混合；所述裂解液包括3-5mol/L氯化钾；
步骤2，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清，使用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，使用洗脱液将吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱。
8.根据权利要求7所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，其特征在于，所述裂解液包括4mol/L氯化钾、4mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液，所述裂解液pH＝6.0；
所述磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液的溶液pH＝6.0；
所述清洗液为盐酸溶液，所述清洗液的溶液pH＝4.0；
所述洗脱液为氢氧化钠溶液，所述洗脱液的溶液pH＝10.0。
9.根据权利要求8所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，取痰液样品与裂解液等体积混合，混合液100℃处理15min；
步骤2，离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置；
步骤3，将离心管静置于磁力架上，静置后除去离心管内液体；
步骤4，向离心管内加入清洗液，震荡混匀，并重复步骤三；
步骤5，向离心管内加入洗脱液，吹打混匀，离心管于磁力架上静置；
步骤6，转移离心管内的上清液，分离得到结核杆菌核酸。
10.根据权利要求9所述快速提取痰液中结核杆菌核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，向痰液样品中加入等体积裂解液，100℃处理15分钟；
步骤2，12000rpm离心5min，吸取上清液500μL至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠的磁珠悬液300μL，混匀，静置5min；
步骤3，将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；
步骤4，将离心管取下，加入500μL清洗液，震荡混匀30s；
步骤5，将离心管置于磁力架上静置1分钟，除去离心管内液体；
步骤6，将离心管取下，加入20-100μL洗脱液，吹打混匀，静置3min；
步骤7，转移离心管内的上清液，获得结核杆菌核酸。
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