CN110607297A - 一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁珠法提取核酸的裂解液，所述裂解液包含终浓度为0.3～0.5N的氢氧化钾、终浓度为0.2～0.4M的乙酸钠、质量分数为0.03～0.07％的N‑月桂酰肌氨酸钠、终浓度为3～7mM的EDTA、体积分数为0.5～1.5％的吐温20、终浓度为0.1～0.3M的海藻糖。利用本发明中的裂解液或试剂盒进行实验时，能够实现样本加样无需混匀、无需加热，核酸裂解无需震荡，漂洗时无需吹散磁珠，只需静态浸泡一次，从而减少了实验室污染和核酸的丢失，反应液和磁珠无需混匀，核酸扩增无需洗脱，所得磁珠核酸全部参与PCR扩增反应，避免了移管所带来污染的可能性，大大缩短了检测时间，且低值样本重复性良好。

Description

一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的方法。

背景技术

核酸提取技术是分子生物学研究的基础，也是进行病原微生物检测、物种鉴定、亲子鉴定、法医取证等常用的研究手段。然而，一个具备操作简单、操作步骤少、核酸得率高、而又不引起实验室气溶胶污染的方法，是目前临床分子生物学实验室质量建设的重点和难点。

目前，磁珠法已成为新兴的核酸提取技术，其主要原理是基于磁性纳米材料对核酸进行吸附，经过磁性分离和杂质漂洗后，将核酸从磁珠上洗脱下来，从而达到对核酸提取纯化的目的。传统的磁珠核酸提取方法使用的核酸裂解液大多是胍盐，其溶解度容易受到季节温度的影响而结晶析出，影响核酸裂解效能，降低了检测的重复性。同时由于传统的核酸磁珠提取方法操作步骤多，移管频繁，磁珠核酸需洗脱，有的方法为了增加核酸洗脱效率，甚至采用加入洗脱的方法，这些步骤都将增加核酸丢失和实验室污染的几率。总结传统方法的操作步骤，实验室污染和核酸丢失都与动态磁珠核酸提取有关。

因此需要寻找一种无需操作过程中的移管、震荡混匀、动态漂洗和加热洗脱等步骤的方法，这样不但可以大大简化操作步骤，同时实验室污染也可以得到有效控制。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中的动态核酸制备方法中存在动力混匀导致核酸外泄污染、磁珠漂洗和PCR反应液与核酸磁珠需要吹散混匀、Tip头粘连大量核酸导致核酸丢失，同时提取效率低的问题，提供了一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种磁珠法提取核酸的裂解液，所述裂解液包含终浓度为0.3～0.5N的氢氧化钾、终浓度为0.2～0.4M的乙酸钠、质量分数为0.03～0.07％的N-月桂酰肌氨酸钠、终浓度为3～7mM的EDTA、体积分数为0.5～1.5％的吐温-20和终浓度为0.1～0.3M的海藻糖。

本发明的技术方案公开了一种样本加到裂解液中无需震荡、核酸磁珠漂洗无需吹散、PCR反应液无需与核酸磁珠混匀的静态核酸制备方法，几乎避免了整个核酸制备过程中的核酸丢失环节，由于本发明使用的核酸裂解液不是胍盐，也无蛋白酶K，结合简洁的操作步骤，大大提升了实验的可操作性和检测结果的重复性。

在本发明裂解液中包含了0.1～0.3M的海藻糖。作为优选，上述海藻糖的终浓度为0.2M。海藻糖参与核酸提取，可以起到增加液体粘稠度的作用，从而使磁珠一直处于悬浮状态，故整个核酸制备过程无需动力吹打混匀即可得到高纯度的核酸，除此之外，海藻糖还具有保护核酸的功能，使核酸保持完整，提高检测的敏感性。

通过以上方法配制的裂解液，无需混匀裂解液与样本即可充分裂解细胞，使核酸完全释放，并配合磁珠进行核酸吸附，使核酸提取效果达到最优；同时可以加快裂解速度，彻底去除蛋白质，无需震荡裂解，并且不受季节温度、盐离子浓度等影响，不需要苛刻的实验条件。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述裂解液还包含体积分数为1～2％的超顺磁微球，所述超顺磁微球的粒径介于10～50nm。

超顺磁微球(superparamagnetics nano spheres/particles/beads)简称磁珠，是由Senyei A E在1978年首先研制出来的一种新型的功能性材料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；外部是一层包覆层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联，进而在磁场的作用下实现分离。

在本发明中，任意合适的商品化磁珠都能够实现本发明的目的。但作为优选，本发明所述超顺磁微球的粒径介于10～50nm，粒径小且颗粒均一，磁微球单个重量为5～25ng，比表面积为500～15000平方纳米(按不规则球体计算)；该磁微球磁力强，在裂解液中，全部吸附分离时间为10秒，在裂解液与血清样本混匀液中的吸附时间30秒～50秒，缩短实验时间和有效避免废液磁微球的残留导致的实验室污染；以上特点使磁珠在裂解液中处于均匀不沉淀的状态，确保与释放核酸均匀接触；加入漂洗液时，漂洗液为弱酸性，与磁珠空隙残存的碱性裂解液通过pH值互渗中和，实现不需要混匀磁珠可以最大限度清除裂解液成分；加入偏碱性(pH值8.0～8.5)的PCR反应液时，反应液很容易进入偏酸性的磁珠空隙，实现PCR反应液与磁珠无需混匀即可进行PCR扩增的目的。以上特征，避免了磁珠混匀导致的实验室污染和核酸丢失，大大提高检测的灵敏度和重复性，并且操作步骤大大简化，方便临床操作人员的使用。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述裂解液由以下组分组成：终浓度为0.4N的氢氧化钾、终浓度为0.3M的乙酸钠、质量分数为0.05％的N-月桂酰肌氨酸钠、终浓度为5mM EDTA、体积分数为1％的吐温20、体积分数为1.5％的超顺磁微球和终浓度为0.2M的海藻糖。

本发明的另一个方面，是提供了一种磁珠法静态制备核酸的方法，利用上述裂解液裂解细胞后进行核酸提取。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述包括以下步骤：

步骤1)将所述超顺磁微球按比例加入到裂解液中，得到磁珠裂解液；

步骤2)将样本加入到含有步骤1)得到的磁珠裂解液的扩增管中，无需混匀，室温静置5～10分钟；

步骤3)将上述扩增管放置于磁力架上，静置2～3分钟，待磁珠全部吸附至一侧后，将废液吸走；

步骤4)将漂洗液加入步骤3)得到的扩增管中，无需吹散磁珠，静置1～2分钟，将废液吸走；

步骤5)将扩增管从磁力架上取下，将配制好的PCR反应液加入到该扩增管中，PCR反应液无需与核酸磁珠混匀，直接进行PCR扩增。

本发明方法制备核酸的全过程可以直接在PCR扩增管中进行，样本直接加入核酸裂解液中无需混匀，无需吹散磁珠、完全静态漂洗，漂洗后的核酸磁珠直接参与PCR反应。本发明制备核酸仅需5步操作、方便快捷、无核酸丢失和实验室污染且低值样本重复性较好。

上述步骤1)中的超顺磁微球和裂解液可以按照任意比例混合，作为优选，所述超顺磁微球按照1～2％的体积分数添加到裂解液中，更优选地，所述超顺磁微球的体积分数为1.5％。

在上述步骤2)中，所述待检测样本可以为任意含有核酸的物质。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述待检测样本为细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水。更优选地，所述待检测样本为血清或血浆。所述核酸包括但不限于DNA或RNA。

本发明方法对于待检测样本的加入量并没有特别的限制。但为了使检测效果达到最优，所述待检测样本的加入量为50μl～150μl，优选为100μl。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述待检测样本与所述磁珠裂解液的体积比为1:1，这样更易于待检测样本和磁珠裂解液充分接触。

其中，所述无需混匀为非常规混匀方法，如移液器吹打、超声震动等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，将装有待检测样本的Tip头插入裂解液液面以下，边打样本边提Tip头，利用加样的力度使液体形成一个涡旋，以促进裂解液和待检测样本的混合，如此，Tip头不会粘连太多核酸造成核酸外泄，从而减少了实验室污染的机会和核酸丢失的可能。

在上述步骤2)中，核酸裂解全过程只需静置，无需震荡。本发明的方法有效降低了裂解过程核酸外泄导致的实验室污染。

上述步骤3)中所述磁力架可以为市售吸附磁珠用常规磁力架。所述将废液吸走可以使用任何市售的吸取工具。作为优选，使用八连排枪负压泵在磁珠的对侧将管内的废液吸走。所述废液包括上述步骤中的裂解液、待检测样本溶液等磁珠吸附核酸后的残留液体。

上述步骤4)中所述漂洗液可以为任意市售核酸提取所用漂洗液。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述漂洗液为终浓度为0.2～0.4M的乙酸钠溶液、体积分数为0.5～1.5％的曲通X-100，所述漂洗液的pH值为4～6。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，用乙酸将所述漂洗液的pH值调整为4～6。

在本发明中，使用0.2～0.4M的乙酸钠溶液、0.5～1.5％的曲通X-100作为漂洗液的主要成分，其不含有乙醇。使用本发明漂洗液仅需洗涤一次，且少量残余液不会影响PCR扩增的实验结果，乙酸钠具有缓冲功能，具有一定的保护核酸作用，保证实验结果的准确有效。同时无需吹散磁珠，从而简化了操作步骤。

由于本发明方法使用特殊的裂解液和漂洗液，因此裂解过程无需混匀样本与裂解液，漂洗过程无需吹散磁珠、只需浸泡，并且只需漂洗一次，不仅降低了操作过程中发生实验室污染的可能性，而且极大缩短了检测时间。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述磁珠裂解液、样本和漂洗液的体积比为1:1:2.5。

上述步骤5)中所述PCR扩增为实时荧光定量PCR反应。

在上述步骤5)中，核酸磁珠无需洗脱，加入PCR反应液后，磁珠与核酸一起参与PCR扩增。

所述配制好的PCR反应液可以为针对待检测样品中的靶核酸所设计的任意常规PCR反应液。例如，可包含PCR扩增缓冲液、四种dNTP的混合物dATP、dCTP、dGTP和dUTP、TaqDNA聚合酶、镁离子以及针对所述目标核酸设计的上下游引物和探针。

所述PCR扩增的程序可根据待检测样本中的靶核酸设计。例如,所提取核酸类型为DNA，PCR扩增程序优选为50℃,2min；95℃,5min；然后进行50循环的95℃,15s和62℃,45s；在62℃检测荧光信号。所提取核酸类型为RNA，PCR扩增程序优选为45℃,15min；95℃,5min；然后进行50循环的94℃,15s和58℃,45s，在58℃检测荧光信号。

所述PCR扩增程序主要依赖于Taq DNA聚合酶和引物的退火温度，扩增程序包括但不限于上述扩增程序。

作为优选，所述离心为以2000～3000rpm水平离心30～60s。

更优选地，所述离心为以3000rpm水平离心45s。

本发明的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述裂解液。除此之外，所述试剂盒还包含了作为检测试剂盒的任意合适的组成部分，包括但不限于，漂洗液、各种反应buffer、PCR引物或探针、酶、dNTP，以及产品说明书。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒还包含上述漂洗液。

本发明的另一个方面，是提供了上述裂解液或试剂盒在核酸制备中的用途，作为优选，所述用途为在检测用PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交过程中的核酸制备中的用途。

本发明所述的裂解液、方法、试剂盒适用的检测项目包括但不限于乙肝病毒、丙肝病毒、CMV、EBV、HIV等各种病毒定量检测，还适合全血基因组DNA的纯化等。

本发明的有益效果为：

利用本发明中的裂解液或试剂盒进行实验时，能够实现样本加样无需混匀、无需加热，只需室温静置5～10分钟即可，核酸裂解无需震荡，漂洗时无需吹散磁珠，只需静态浸泡一次，从而减少了实验室污染和核酸的丢失，反应液和磁珠无需混匀，核酸扩增无需洗脱，所得磁珠核酸全部参与PCR扩增反应，避免了移管所带来污染的可能性，大大缩短了检测时间，且低值样本重复性良好。

附图说明

图1为裂解液与样本是否混匀检测HBV DNA对比结果图；

图2为裂解液与样本不混匀检测80IU/mL HBV DNA重复性结果图；

图3为裂解液与样本混匀检测80IU/mL HBV DNA重复性结果图；

图4为漂洗时磁珠是否吹散检测HBV DNA对比结果图；

图5为PCR反应液与磁珠是否混匀检测HBV DNA对比结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中使用的术语“磁珠”，是指磁性微球(简称磁珠)，现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。

本发明中使用的术语“裂解液”，即“lysis buffer”，是指为了使样品中的核酸游离在裂解体系中所需加入的一种配制液体。

本发明中使用的术语“漂洗液”，即“wash buffer”，是指可以去除核酸以外杂质所需加入的一种配制液体。

本发明中使用的例如“0.03～0.07％N-月桂酰肌氨酸钠”“0.5～1.5％曲通X-100”中的百分比是指物质的纯度。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本实施方式所用实验材料与仪器

以下实施例中所用的PCR扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时荧光定量PCR仪。

样本采用临床化验室HBV DNA定量检测后的血清。

为了详细说明本发明方法的具体实施方式中实施例1、2、3、4，按照以下组分比例配制混合有磁珠的裂解液和漂洗液以便后续操作使用。A)裂解液：0.4N氢氧化钾、0.3M乙酸钠、0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mM EDTA、1％TW-20、和0.2M海藻糖。B)按照磁珠和裂解液的体积比为1：100加入自然沉淀24小时的磁珠，混匀。C)漂洗液：0.3M乙酸钠、1％曲通X-100、用乙酸将pH值调至5。

实施例1：样本与裂解液是否混匀检测HBV DNA的比较

使用以上裂解液和漂洗液对临床诊断明确且经过检测HBV DNA定量值为1.5×10⁶IU/mL和30IU/mL的乙肝患者血清进行如下步骤的操作：

(1)PCR裂解液的分装：将配制好的含有磁珠的裂解液按照每管100μL分装到专用PCR管中。

(2)加样：取100μL的血清加到上述分装有含有磁珠的裂解液的PCR管中，样本与裂解液不混匀，室温静置5分钟。

(3)吸弃液体：将上述PCR管放置到八联排磁力架上，静置2分钟，用负压泵在磁珠对侧将液体吸掉，注意勿吸掉磁珠。

(4)漂洗：将已配制好的漂洗液每管加入200μL，静置1分钟，用负压泵吸弃漂洗液，注意吸净残液。

(5)将2.0μL(1U/μL)单位的Taq DNA聚合酶与43.0μL PCR反应液混匀，加入到步骤(4)得到的PCR扩增管中，封盖。

其中，正向引物序列为HBVF5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAA

TTGG-3’，反向引物序列为HBVR 5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-

3’，探针序列为HBVP 5’-FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB-3’。

(6)离心：水平离心机3000RPM离心45秒。

(7)将上述得到的PCR管放置于PCR仪内进行扩增。

扩增程序：50℃，2min；95℃，5min；进行50循环的95℃，15s和62℃，45s，在62℃检测荧光信号。

对比试验：

采用与上述相同的方法进行，除了(2)步骤中样本与裂解液混匀。

实验结果如图1所示，结果表明，按照本实施例样本与裂解液不混匀的方法，对1.5×10⁶IU/mL和30IU/mL的乙肝患者血清标本进行检测时，无论是高浓度1.5×10⁶IU/mL或是低浓度的30IU/mL，Ct值和提取效率均要高于与裂解液混匀的方法。

实施例2：样本与裂解液是否混匀检测80IU/mL HBV DNA重复性的比较

为了验证样本与裂解液是否混匀对低值样本重复性的影响，使用本发明不混匀的方法与混匀方法进行比较。

利用与实施例1相同的方法对临床诊断明确且经过检测HBV DNA定量值为80IU/mL的乙肝患者血清进行10复孔的重复性检测。

结果如图2、图3所示，实验结果表明，将待检测样本加入到裂解液中，通过不混匀方法扩增的80IU/mL重复性明显高于混匀方法扩增的80IU/mL重复性。

实施例3：漂洗时是否吹散磁珠检测HBV DNA的比较

为了验证漂洗时是否吹散磁珠对核酸提取效率的影响，使用以上裂解液和漂洗液对临床诊断明确且经过检测HBV DNA定量值为1.5×10⁸IU/mL和1.5×10⁴IU/mL的乙肝患者血清进行检测。方案1)漂洗时吹散磁珠，方案2)漂洗时不吹散磁珠，其他步骤均与实施例1相同。

实验结果如图4所示，结果表明，按照本实例方案2)漂洗时不吹散磁珠的发明方法，对1.5×10⁸IU/mL和1.5×10⁴IU/mL的乙肝患者血清标本进行检测时，不仅可以有效对其定量，并且其PCR的效率高于方案1)漂洗时吹散磁珠的PCR效率。

实施例4：PCR反应液与磁珠是否混匀检测HBV DNA的比较

为了验证PCR反应液与磁珠是否混匀对核酸提取效率的影响，使用以上裂解液和漂洗液对临床诊断明确且经过检测HBV DNA定量值为1.5×10⁴IU/mL和1.5×10²IU/mL的乙肝患者血清进行检测。方案1)PCR反应液与磁珠混匀，方案2)PCR反应液与磁珠不混匀，其他步骤均与实施例1相同。

实验结果如图5所示，结果表明，按照本实例方案2)PCR反应液与磁珠不混匀的发明方法，对乙肝患者血清标本进行检测时，无论是在HBV DNA浓度为1.5×10⁴IU/mL，还是在HBV DNA浓度为1.5×10²IU/mL时，本发明扩增曲线的Ct值要比方案1)PCR反应液与磁珠混匀扩增曲线的Ct值提前1个Ct值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种磁珠法提取核酸的裂解液，其特征在于，所述裂解液包含终浓度为0.3～0.5N的氢氧化钾、终浓度为0.2～0.4M的乙酸钠、质量分数为0.03～0.07％的N-月桂酰肌氨酸钠、终浓度为3～7mM的EDTA、体积分数为0.5～1.5％的吐温20、终浓度为0.1～0.3M的海藻糖。

2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包含体积分数为1～2％的超顺磁微球，所述超顺磁微球的粒径介于10～50nm。

3.根据权利要求1或2所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液由以下组分组成：终浓度为0.4N的氢氧化钾、终浓度为0.3M的乙酸钠、质量分数为0.05％的N-月桂酰肌氨酸钠、终浓度为5mM EDTA、体积分数为1.0％的吐温20、体积分数为1.5％的超顺磁微球和终浓度为0.2M的海藻糖。

4.一种磁珠法静态制备核酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～3中任意一项所述的裂解液裂解细胞或病原体后进行核酸提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)将所述超顺磁微球按比例加入到裂解液中，得到磁珠裂解液；

步骤2)将样本加入到含有步骤1)得到的磁珠裂解液的扩增管中，无需混匀，室温静置5～10分钟；

步骤3)将上述扩增管放置于磁力架上，静置2～3分钟，待磁珠全部吸附至一侧后，将废液吸走；

步骤4)将漂洗液加入步骤3)得到的扩增管中，无需吹散磁珠，静置1～2分钟，将废液吸走；

步骤5)将扩增管从磁力架上取下，将配制好的PCR反应液加入到该扩增管中，PCR反应液无需与核酸磁珠混匀，直接进行PCR扩增，所述PCR反应液的pH值优选为8.0～8.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述样本为细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水，优选为血清或血浆。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述样本的加入量为50μl～150μl，优选为100μl。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)所述所述漂洗液为终浓度为0.2～0.4M的乙酸钠溶液、体积分数为0.5～1.5％的曲通X-100，所述漂洗液的pH值为4～6。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磁珠裂解液、样本和漂洗液的体积比为1:1:2.5。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3任意一项所述的裂解液。

11.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含如权利要求5或8所述的漂洗液。

12.如权利要求1-3任意一项所述的裂解液，或如权利要求10或11所述的试剂盒在核酸制备中的用途，优选为在检测用PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交过程中的核酸制备中的用途。