CN114934041B - 一种核酸提取的试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种核酸提取的试剂和方法。所述试剂包括：裂解液，其包括0.1~5M的氯化钾、1~5M的异硫氰酸胍、0.003~3M的EDTA、2~8wt%的N‑月桂酰肌氨酸钠、0.01~0.6M Tris和20~80%无水乙醇；洗涤液，其包括0.01~0.6M Tris‑HCl和60~80%无水乙醇；洗脱液，其包括0.01~0.4M Tris‑HCl；其中，所述裂解液和洗涤液中的至少一种中还包括硅基磁珠，所述硅基磁珠在所述裂解液和洗涤液中的浓度各自独立地为0.1~4mg/mL。利用所述试剂进行核酸提取的步骤少，3步完成核酸提取，提取核酸时间为2‑6分钟，得到产物浓度高，纯度也高，且所述试剂中有毒有害致癌物少，减少了对环境和人员的污染和伤害。
Description
技术领域
本申请涉及核酸提取的技术领域，尤其是涉及一种核酸提取的试剂和方法。
背景技术
随着基因检测、个性化用药、产前诊断等的普及，高通量测序、荧光定量PCR、基因芯片等以核酸为检测对象的分子生物学技术的应用越来越广泛。核酸检测的关键环节之一，即从各种生物样品中提取和纯化核酸，核酸提取效率和纯度对下游的核酸检测能否成功起至关重要的作用。
目前市场上常用的核酸提取的方法有酚-氯仿抽提法、浓盐法、阴离子去污剂法、异硫氰酸胍/苯酚法(Trizol法)、离心柱纯化、磁珠法提取等。现有的核酸提取方法，或多或少都有缺陷，为了提高核酸提取效率，常规做法是增加样本裂解液的组分或含量，这样做的结果是，若后续清洗不彻底，容易残留一些蛋白、多糖、脂肪等杂质。目前核酸提取方法里，有的方法步骤多不利于快速操作，有的方法提取到的核酸浓度不高、有的方法提取核酸时间长等。
因此，为了解决核酸提取步骤多、提取核酸浓度不高、纯度低、得率不高、单次提取耗时长，成本大等问题，需要提供一种新的核酸提取试剂和方法，进而能够快速完成高浓度和高纯度核酸提取的目的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足，本申请提供一种核酸提取的试剂，利用所述试剂进行核酸提取的步骤少，3步完成核酸提取，提取核酸时间为2-6分钟，得到产物浓度高，纯度也高，且所述试剂中有毒有害致癌物少，减少了对环境和人员的污染和伤害。
为此，本申请第一方面提供一种核酸提取的试剂，所述试剂包括以下组分：
裂解液，其包括0.1～5M的氯化钾、1～5M的异硫氰酸胍、0.003～3M的EDTA、2～8wt％的N-月桂酰肌氨酸钠、0.01～0.6M Tris和20～80％无水乙醇；
洗涤液，其包括0.01～0.6M Tris-HCl和60～80％无水乙醇；
洗脱液，其包括0.01～0.4M Tris-HCl；
其中，所述裂解液和洗涤液中的至少一种中还包括硅基磁珠，所述硅基磁珠在所述裂解液和洗涤液中的浓度各自独立地为0.1～4mg/mL。
本申请中，所述试剂中的裂解液用于破坏样本中的细胞的结构，进而充分释放出细胞内的核酸物质。裂解液中的异硫氰酸胍一种强力蛋白质变性剂，能溶解蛋白质导致细胞结构破碎；同时细胞内存在的核酸酶可以被其抑制，防止核酸酶对核酸进行降解破坏；细胞内的核酸与核蛋白相互缠绕，异硫氰酸胍可以对核蛋白的二级结构形成破坏，使得核酸与核蛋白分离，充分释放核酸。裂解液中的N-月桂酰肌氨酸钠盐一种阴离子表明活性剂，阴离子洗涤剂，可以协助溶解细胞。裂解液中的氯化钾用于提供一种高盐环境，使细胞内的核酸充分溶解，存在于液相中。裂解液中的EDTA用于鳌合镁离子或锰离子，抑制DNA酶的活性。裂解液中的Tris用于与pH调节剂(如盐酸)配合，提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。因此在一些具体实施方式中，所述裂解液中还包括pH调节剂(如盐酸)，用于调节裂解液的pH值和提供缓冲环境。裂解液中的无水乙醇用于维持核酸不被水溶解。
本申请中，所述洗涤液用于纯化核酸，去除核酸中的杂质(蛋白质等)。本申请所述裂解液和洗涤液中的至少一种中包括硅基磁珠，所述硅基磁珠用于吸附通过裂解所释放的核酸，进而可以更好地去除核酸中的杂质。本申请对所添加的硅基磁珠的粒径没有明确限定，其为本领域中常规采用的粒径。在一些具体实施方式中，所述硅基磁珠的粒径可以为100～500nm。洗涤液中的Tris-HCl用于提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。洗涤液中的无水乙醇用于维持核酸不被水溶解。
本申请中，所述洗脱液用于将所述硅基磁珠与核酸分离，进而将纯化后的核酸释放，进而溶解在液相(如水)中。洗脱液中的Tris-HCl用于提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。
在本申请的一些具体实施方式中，裂解液中的N-月桂酰肌氨酸钠的浓度可以为2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％或8wt％等。本申请通过将裂解液中的N-月桂酰肌氨酸钠的浓度控制在上述浓度范围内，能够更好地裂解样本中的细胞，进而使核酸被尽可能地释放，提高所提取的核酸的纯度。
在本申请的一些具体实施方式中，所述硅基磁珠在所述裂解液和洗涤液中的浓度可以各自独立地为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL或4mg/mL等。在本申请的一些优选的实施方式中，所述硅基磁珠在所述裂解液和洗涤液中的浓度各自独立地为1～4mg/mL。本申请通过将洗涤液中硅基磁珠的浓度控制在上述范围内，能够进一步提高所提取的核酸的纯度。
在一些实施方式中，所述洗涤液中不包括钠盐或钾盐。现有技术中，洗涤液中一般均含有一定量的钠盐或钾盐。而本申请的发明人通过研究发现，当洗涤液中不包括钠盐或钾盐时，能够更好地对核酸进行纯化，进而使所提取的核酸的纯度更高。
本申请中，所述洗脱液中还可以包括无菌水。
在一些实施方式中，所述裂解液、洗涤液和洗脱液的pH值各自独立地为6.0～9.0。本申请通过将所述裂解液、洗涤液和洗脱液的pH值控制在上述范围内，能够更好地发挥上述试剂组分的作用。
本申请中，术语“核酸”是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA主要储存遗传信息，RNA主要传递遗传信息。
本申请第二方面提供了一种利用如本申请第一方面所述的试剂进行核酸提取的方法，所述方法包括以下步骤：
S1，将待提取的生物样本与所述裂解液混合，裂解后获得裂解混合液；
S2，将所述裂解混合液进行固液分离，去除上清液后加入洗涤液进行洗涤，获得洗涤混合液；
S3，将所述洗涤混合液进行固液分离，去除上清液后加入洗脱液进行洗脱，然后对洗脱后的混合液进行固液分离，获取上清液，即为所提取的核酸。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述裂解的条件为：在60～80℃下震荡加热1～5分钟。本申请中，裂解在加热条件下进行，以提高裂解速度。裂解温度控制在60～80℃范围内，温度过低起不到提高裂解速度的效果，温度过高会破坏细胞内核酸的结构。本申请中，裂解还在震荡条件下进行，通过震荡能够更好地混合生物样本与裂解液，同时震荡还能起到物理裂解的效果，进一步提高裂解速度。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述洗涤的条件为：在20～30℃(室温)下震荡20～50秒。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述洗脱的条件为：在60～80℃下震荡20～50秒。本申请中，洗脱在加热条件下进行，以提高洗脱速度。洗脱温度控制在60～80℃范围内，温度过低起不到提高洗脱速度的效果，温度过高会破坏核酸的结构。本申请中，洗脱还在震荡条件下进行，通过震荡能够使待洗脱硅基磁珠与洗脱液更好的混合，同时震荡还能起到物理洗脱的效果，进一步提高洗脱速度。
本申请中，步骤S2和S3中的固液分离可以通过本领域常规的方式进行。在本申请的一些具体实施方式中，所述固液分离可以通过离心或静置实现。
在一些实施方式中，所述待提取的生物样本与所述裂解液的体积比为1:(2～4)。
本申请中的生物样本可以为任何包含细胞的材料。在一些实施方式中，所述生物样本选自血斑、精斑、精液、血液、组织液、脑脊液、尿液、积液、鼻拭子、组织细胞、菌液和病毒培养液中的至少一种。
在一些实施方式中，所述方法仅有上述步骤S1-S3组成。
有益技术效果：本申请所述核酸提取试剂中含有特定组成的裂解液、洗涤液和洗脱液，利用所述试剂进行核酸提取的方法步骤少，提取核酸时间为2-6分钟，最快2分钟就可以完成，远远低于现在市场提取核酸时间25-30分钟。利用所述试剂进行核酸提取的方法3步完成核酸提取，远远少于现在市面上常用的4步，甚至5步提取法，减少多步骤造成的污染，得到产物浓度高，纯度也高，且使用试剂较少，降低了生产成本。另外，所述试剂中有毒有害致癌物少，减少了对环境和人员的污染和伤害。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1
本实施例提供了一种提取核酸的方法，其中所采用的试剂包括：
裂解液：5M氯化钾、3M异硫氰酸胍、50mM EDTA、8wt％N-月桂酰肌氨酸钠、60mMTris、80％无水乙醇、盐酸调整pH9.0，充分混匀；
洗涤液：60mM Tris-HCl、80％无水乙醇、硅基磁珠4mg/mL，调整pH8.0，充分混匀；
洗脱液：40mM Tris-HCl，灭菌水，调整pH7.5，充分混匀。
利用上述试剂进行提取核酸的方法，由以下3步骤组成：
(1)裂解：将200uL猪血液样本和600uL裂解液混合，80℃震荡加热1分钟进行裂解，获得裂解混合液；
(2)洗涤：将上述裂解混合液10000转/分钟离心后吸弃上清液后，加入600uL洗涤液，室温震荡50秒进行洗涤，获得洗涤混合液；
(3)洗脱：将上述洗涤混合液10000转/分钟离心后吸弃上清液后，加入60uL洗脱液，60℃震荡加热50秒进行洗脱，10000转/分钟离心后吸取上清液，即为所提取的核酸。上述提取方法总耗时小于3分钟。测定所提取的核酸中的DNA浓度，结果为OD260/OD280＝1.86，纯度达99.99％
实施例2
本实施例提供了一种提取核酸的方法，其中所采用的试剂包括：
裂解液：0.2M氯化钾、4M异硫氰酸胍、3M EDTA、3wt％N-月桂酰肌氨酸钠、0.2MTris、30％无水乙醇、盐酸调整pH8.5，充分混匀；
洗涤液：30mM Tris-HCl，60％无水乙醇、硅基磁珠1mg/mL，调整pH7.0，充分混匀；
洗脱液：20mM Tris-HCl，灭菌水，调整pH7.5，充分混匀。
利用上述试剂进行提取核酸的方法，由以下3步骤组成：
(1)裂解：将300uL人鼻拭子样本800uL和裂解液混合，60℃震荡加热1分钟进行裂解，获得裂解混合液；
(2)洗涤：将上述裂解混合液10000转/分钟离心后吸弃上清液后，加入800uL洗涤液，室温震荡30秒进行洗涤，获得洗涤混合液；
(3)洗脱：将上述洗涤混合液10000转/分钟离心后吸弃上清液后，加入80uL洗脱液，70℃震荡加热30秒进行洗脱，高速离心后吸取上清液，即为所提取的核酸。
上述提取方法总耗时2分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝2.00，纯度达99.99％。
实施例3
基本同实施例2，不同之处在于，裂解液中3wt％的N-月桂酰肌氨酸钠替换为5wt％的十二烷基硫酸钠(SDS)。
上述提取方法总耗时2分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝1.88，纯度达95.83％，核酸收率只有实施例2的93％。
实施例4
基本同实施例2，不同之处在于，裂解液中N-月桂酰肌氨酸钠的质量浓度为0.5wt％。
上述提取方法总耗时2分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝1.88，纯度达94.27％，核酸收率只有实施例2的91％。
实施例5
基本同实施例2，不同之处在于，洗涤液中添加了20mM的氯化钾。
上述提取方法总耗时2分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝1.85，纯度达99.21％，核酸收率只有实施例2的92％。
实施例6
基本同实施例2，不同之处在于，洗涤液中硅基磁珠的浓度为0.3mg/mL。
上述提取方法总耗时3分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝1.69，纯度达98.27％，核酸收率只有实施例2的85％。
实施例7
基本同实施例2，不同之处在于，洗涤液中不含有硅基磁珠，而裂解液中含有硅基磁珠，且硅基磁珠的浓度为1mg/mL。
上述提取方法总耗时2分钟。测定所提取的核酸中的RNA浓度，结果为OD260/OD280＝2，纯度达100％，核酸收率为实施例2的100％。
测试例1
对实施例2和实施例4所提取的核酸进行性能测试。具体地，实施例2和实施例4所提取的核酸，用市售的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行PCR扩增，采用同一个荧光定量PCR仪(和利时96核酸提取仪)测定Ct值三次，求取平均值，结果如表1所示。Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设置的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
表1
从表1可知，实施例2所提取的核酸的Ct值均小于实施例4所提取的核酸的Ct值，说明实施例2的核酸提取效果优于实施例4。
测试例2：稳定性试验
将实施例2所提取的核酸存放于25±5℃的条件下，8小时后用市售的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行提取，用和利时96核酸提取仪测定Ct值三次，求取平均值，结果如表2所示。
表2
| FAM | HEX | ROX | |
| 平均值 | 34.1 | 33.0 | 27.6 |
从表2可知，将实施例2提取的核酸在25±5℃的条件下放置8小时后，其Ct值变化不大。表明实施例2所提取的核酸的稳定性良好。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (8)
1.一种核酸提取的试剂，其特征在于，所述试剂包括以下组分：
裂解液，其由如下成分组成：0.1~5M的氯化钾、1~5M的异硫氰酸胍、0.003~3M的EDTA、2~8wt%的N-月桂酰肌氨酸钠、0.01~0.6M Tris和20~80%无水乙醇；
洗涤液，其由如下成分组成：0.01~0.6M Tris-HCl和60~80%无水乙醇；
洗脱液，其由如下成分组成：0.01~0.4M Tris-HCl；
其中，所述裂解液和洗涤液中的至少一种中还添加有硅基磁珠，所述硅基磁珠在所述裂解液和洗涤液中的浓度各自独立地为1~4mg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述裂解液、洗涤液和洗脱液的pH值各自独立地为6.0~9.0。
3.一种利用如权利要求1或2所述的试剂进行核酸提取的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，将待提取的生物样本与所述裂解液混合，裂解后获得裂解混合液；
S2，将所述裂解混合液进行固液分离，去除上清液后加入洗涤液进行洗涤，获得洗涤混合液；
S3，将所述洗涤混合液进行固液分离，去除上清液后加入洗脱液进行洗脱，然后对洗脱后的混合液进行固液分离，获取上清液，即为所提取的核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述裂解的条件为：在60~80℃下震荡加热1~5分钟。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述洗涤的条件为：在20~30℃下震荡20~50秒。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述洗脱的条件为：在60~80℃下震荡20~50秒。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述待提取的生物样本与所述裂解液的体积比为1:（2~4）。
8.根据权利要求3或4所述的，其特征在于，所述生物样本选自血斑、精斑、精液、血液、组织液、脑脊液、尿液、积液、鼻拭子、组织细胞、菌液和病毒培养液中的至少一种。
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