JP2004329176A - Ｒｎａの単離方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】迅速かつ簡便にＲＮＡを単離する方法を提供する。
【解決手段】試料を塩と緩衝剤とを含む水溶液に懸濁し酸性条件下でフェノール・クロロホルム等の有機溶媒で抽出する工程、およびアルコール沈殿により水溶液中に含まれるＲＮＡを回収する工程、を含むＲＮＡの単離方法を提供する。該方法は少ないステップで高純度のＲＮＡを簡便かつ迅速に得ることが可能であるので、多検体の同時処理および機械化に適している。また、試料をＳＤＳまたはグアニジンチオシアネート等で処理しないため、澱粉の多い生物試料からでもＲＮＡを高い精製度で単離することが可能である。よって、種子などの澱粉を多く含む植物組織からのＲＮＡの抽出に特に好適に用いられる。
【選択図】 なし
【解決手段】試料を塩と緩衝剤とを含む水溶液に懸濁し酸性条件下でフェノール・クロロホルム等の有機溶媒で抽出する工程、およびアルコール沈殿により水溶液中に含まれるＲＮＡを回収する工程、を含むＲＮＡの単離方法を提供する。該方法は少ないステップで高純度のＲＮＡを簡便かつ迅速に得ることが可能であるので、多検体の同時処理および機械化に適している。また、試料をＳＤＳまたはグアニジンチオシアネート等で処理しないため、澱粉の多い生物試料からでもＲＮＡを高い精製度で単離することが可能である。よって、種子などの澱粉を多く含む植物組織からのＲＮＡの抽出に特に好適に用いられる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は迅速かつ簡便にＲＮＡを抽出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物・動物等の生体組織からＲＮＡを抽出するための方法としてこれまで知られているものとして代表的なものは以下の方法である。
（１） グアニジウム法
強力なタンパク質変性剤であるグアニジンチオシアネートをＲＮａｓｅ阻害剤として利用する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９ （１９８７））。通常、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（サルコシル）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を添加する。これらは細胞膜を破壊すると同時に、弱いＲＮａｓｅ阻害剤として作用する。また、β−メルカプトエタノールはＲＮａｓｅ内のＳ−Ｓ結合を還元することによりＲＮａｓｅを不活性化する。これらを主な成分として含むバッファー中に核酸を溶出させる。その後の処理としては、酸性条件下でフェノール抽出を行い、ＲＮＡのみを水層に分離する方法（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ： ＡＧＰＣ法）が一般的であるが、塩化セシウム勾配を利用した超遠心によりＲＮＡを分離する方法もある。
【０００３】
（２） ＳＤＳ−フェノール法
１％程度のＳＤＳを主な成分として有するバッファーにより組織から核酸を溶出し、その後、酸性条件下でフェノール抽出することによりＲＮＡを水層に分離する方法である。根などの多糖類の多く含まれる組織からのＲＮＡ抽出において多糖類の混入が少ないといわれているが、多糖類を十分に取り除くためには、２〜３Ｍの塩化リチウム水溶液を用いた沈殿を繰り返す必要がある。
【０００４】
（３）ＡＴＡ法
ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＡ）を核酸溶出バッファー中のＲＮａｓｅ阻害剤として使用する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９， ４２９９−４３０３ （１９８０））。以降の操作はＡＧＰＣ法、ＳＤＳ−フェノール法と同様である。ＡＴＡはＲＮＡと挙動をともにしやすいため、グアニジウム法に比べてＲＮＡの分解が少なく、より高品質のＲＮＡが得られる。しかし、ＡＴＡは逆転写反応を阻害するため、ノーザン解析には問題ないが、ＲＴ−ＰＣＲまたはｃＤＮＡライブラリ作成には用いることができないという欠点がある。多糖類の少ない草本植物の葉などに適した方法である。
【０００５】
（４）ＣＴＡＢ法
１．５％程度のＣＴＡＢと０．７Ｍ程度の塩化ナトリウムを含む溶液中では、核酸は溶解できるが多糖類は溶解できない性質を利用するものであり、木本植物の葉などからのＲＮＡ抽出等に用いられた例がある（Ｃｈａｎｇ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔ １１， １１３−１１６ （１９９３）；「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」島本功、佐々木卓治 監修（秀潤社）（１９９７年））。核酸溶出後はクロロホルム抽出、リチウム沈殿、フェノール・クロロホルム抽出を繰り返して多糖類を除去する。しかし、米などのように極度に澱粉含量が高い試料の場合には限界があり、十分な量のＲＮＡを確保するためには多量の出発材料を確保する必要がある。
【０００６】
上記のような抽出法には以下のような問題点がある。
１）強力なタンパク質変性剤、タンパク質・核酸結合阻害剤等、人体に有害である可能性が高く、また高価な試薬が必要である。
２）タンパク質・多糖類等を取り除くために、ステップ数が多い。
とくにポリフェノールまたは澱粉の多い組織から抽出するためには煩雑な方法が必要である。
３）上記の結果、多検体処理または機械化が困難である。
【０００７】
実際に、澱粉含量が非常に高いイネ種子（精米）を出発材料としたＲＮＡ抽出を、グアニジウム法で行った。グアニジウム法は、発明者らがイネ植物体組織（葉など）通常用いている方法である。その結果、粉砕した精米をグアニジウム塩を含むバッファーに溶解した段階で澱粉が大量に溶出し、溶液が糊状になった。遠心分離後の上清を移転し、アルコール塩析したところ、ＲＮＡと澱粉の混合物と見られる団子状の沈殿が析出した。澱粉とＲＮＡを分離するために、滅菌水への溶解と塩析を繰り返したが、澱粉の減少とともにＲＮＡも失われるため、純度の高いＲＮＡの抽出には至らなかった。上記のいずれの方法においても、核酸溶出バッファー中に澱粉が混入するため、澱粉除去のためのステップが不可避になること、出発材料が多量に必要なことから多検体処理または機械化は困難である。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９ （１９８７）
【非特許文献２】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９， ４２９９−４３０３ （１９８０）
【非特許文献３】
Ｃｈａｎｇ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔ １１， １１３−１１６ （１９９３）
【非特許文献４】
「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」島本功、佐々木卓治 監修（秀潤社）（１９９７年）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＲＮＡを単離する方法を提供する。特に本発明は、澱粉を多量に含む生体組織から迅速かつ簡便にＲＮＡを単離する方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来のＲＮＡ単離法の欠点を克服する新たなＲＮＡ単離方法を確立するため鋭意研究を行った。その結果、（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、または（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、のいずれにも試料を接触させずに、試料を塩類および緩衝剤を含む水溶液ならびに有機溶媒と酸性条件下で混合して水溶液から蛋白質を除去し、得られたＲＮＡを含む水溶液をアルコール類と混合してＲＮＡを不溶化し、このＲＮＡを回収することによって、極めて効率的にＲＮＡを単離することができることを見いだした。
【００１１】
本発明の方法を利用することにより、動物および植物のさまざまな組織等から簡便かつ迅速にＲＮＡを抽出することが可能となった。この方法では、通常遺伝子操作を行う実験室等に常備されている一般試薬以外の特殊または高価な試薬、あるいは特殊な設備または器具は不要である。また、少量の検体から効率よく抽出できること、操作が単純で段階数が少ないことから、多検体処理および機械化が可能である。また、従来の方法では、ポリフェノールまたは澱粉等を多く含む試料では、これらがＲＮＡと共に回収されてしまい、これを取り除くために付加的なステップを必要としていた。しかし本発明の方法では、ポリフェノールまたは澱粉等を多く含む試料からでもＲＮＡを特異的に単離することができる。従って本発明の方法は、澱粉等を多く含む試料、例えば植物の種子等からのＲＮＡ調製に特に好適に用いられる。
【００１２】
すなわち本発明は、所望の試料からＲＮＡを単離するための方法およびキット等に関し、より具体的には、
（１）ＲＮＡの単離方法であって、
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の混合物から得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収する工程、を含み、
工程（ａ）または工程（ａ）から工程（ｂ）の間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させない方法、
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、
（２）酸性条件が、ｐＨ３から６である、（１）に記載の方法、
（３）緩衝剤が、Ｔｒｉｓ−Ｃｌである、（１）に記載の方法、
（４）塩類が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種類またはそれ以上の無機塩類である、（１）に記載の方法、
（５）有機溶媒が、フェノール、クロロホルム、またはそれらの両方である、（１）に記載の方法、
（６）アルコール類が、イソプロパノール、エタノール、またはそれらの両方である、（１）に記載の方法、
（７）塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類を含む、（１）に記載の方法によりＲＮＡを単離するためのキット、
（８）（１）に記載のＲＮＡの単離方法を実行するＲＮＡ単離装置、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲＮＡの単離方法であって、（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する工程、（ｂ）工程（ａ）において得られた水溶解液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収する工程、を含み、工程（ａ）または工程（ａ）から工程（ｂ）の間において、該試料を（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、または（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、のいずれとも接触させない方法に関する。
【００１４】
試料としてはＲＮＡを含む所望の材料であってよく、例えばＲＮＡを含む食品または任意の試薬等が含まれる。試料として想定される主要な対象は生物材料である。具体的には、血液、血清、尿、糞便、精液、唾液、リンパ液またはその他の体液、組織、細胞、および水もしくは土壌サンプルなどが含まれる。本発明は、澱粉等の多糖類を比較的多く含む生体材料からのＲＮＡの抽出に特に優れた効果を発揮する。多糖とは、グルコースなどの単糖が直線状または分枝状につながった結合物を言い、グリコーゲン、澱粉、セルロースが含まれる。また澱粉には、アミロースおよびアミロペクチンが含まれる。多糖１分子には、通常グルコースは５個以上、例えば１０個以上つながって構成されており、例えば数十個以上、数百個以上、あるいは数千個以上つながっている。本発明において好適なＲＮＡ含有試料としては、具体的には、澱粉、および／またはグリコーゲン（これらの複数を含む場合はそれらの合計）を１％（乾燥重量比）またはそれ以上、より好ましくは２％以上、より好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上で含むような試料である。このような材料としては、特に植物の種子、子房、根、根茎、および葉鞘が挙げられる。特に、本発明は植物の種子からＲＮＡを調製するために好適に用いられる。
【００１５】
本発明の方法においては、ＲＮＡ含有試料、塩類および緩衝剤を含む水溶液、ならびに有機溶媒を混合して酸性になるようにする。これらを混合する順序は任意であってよい。また、段階的に混合しても、一度に混合してもよい。例えばまず試料と塩類および緩衝剤を含む水溶液とを混合し、これを有機溶媒と混合することは好ましい。この場合、緩衝剤を含む水溶液は、有機溶媒との混合前は酸性でなくてもよい。例えば水溶液を最初は中性〜弱アルカリ（ｐＨ６．８〜８．５程度）のｐＨにしておき、これを有機溶媒を混合した時またはその後に酸性にすることができる（実施例１参照）。また、全てを同時に混合してもよい（実施例６参照）。同時に混合することによって、ＲＮＡ抽出のためのステップを減らすことができる。これは、多くの試料を処理する場合、およびＲＮＡ調製の自動化などにおいて有利である。
【００１６】
試料は、ＲＮＡが抽出されやすいようにするため、有機溶媒と混合する前などに、適宜破砕または溶解することができる。例えばミキサー、ミンサー、ホモジェナイザー、ソニケーターなどを用いて試料を破砕し、これを塩類および緩衝剤を含む水溶液に混合することができる。試料は、該水溶液に混合してから破砕してもよいし、あるいはさらに有機溶媒と混合した後で破砕することもできる（実施例６参照）。塩類および緩衝剤を含む水溶液には、好ましくはキレート剤を添加しておく。キレート剤とは、陽イオン金属原子（好ましくは２価の陽イオン金属原子）と配位結合を形成する化合物であり、好ましくはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）が用いられる。水溶液中のＥＤＴＡ濃度は、例えば １ ｍＭ〜０．５ Ｍ、好ましくは３ ｍＭ〜３００ ｍＭ、より好ましくは５ ｍＭ〜１００ ｍＭ、例えば約１０ ｍＭにする。キレート剤により、例えばＭｇ２＋依存性の酵素活性を阻害し試料の分解を抑制することができる。またキレート剤として、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）を添加してもよい。また該水溶液には、還元剤が含まれることが好ましい。これにより、溶液中に共存し得るＲＮａｓｅ活性を低下させることができる。還元剤としては、β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などが用いられる。還元剤濃度は適宜調整してよいが、β−メルカプトエタノールであれば例えば ０．１％〜５％（容量／容量； ｖ／ｖ）、ＤＴＴであれば ０．１ ｍＭ〜３０ ｍＭ程度である。しかし、還元剤非存在下でも、十分高い効率でＲＮＡを単離することができる（実施例１）。また、水溶液にはａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＴＡ）を添加してもよい（実施例８参照）。
【００１７】
工程（ａ）の温度は通常、０℃〜８０℃の間で行うが、好ましくは０℃〜３０℃の間、より好ましくは０℃〜１０℃の間、より好ましくは０℃〜５℃の間で行う。工程（ａ）で水溶液と有機溶媒が混合されてから工程（ｂ）を行うまでの時間（すなわち有機溶媒による抽出時間）は、試料中の蛋白質等を変性させ、不溶化または有機溶媒側に抽出するのに十分な時間であれば特に制限はないが、下限は通常１分以上、好ましくは５分以上であり、上限に特に制限はないが通常数日以内、好ましくは２４時間以内である。水溶液と有機溶媒の混合液は、振とう器またはボルテックスミキサーなどでよく混合し、効率的に蛋白質を変性・除去することが好ましい。
【００１８】
本発明の方法で用いる塩類としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、および酢酸ナトリウムなどの所望の塩を単独または複数組み合わせてよい。好ましくは無機塩類、特に一価の金属塩が挙げられ、例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、および酢酸ナトリウムなどが含まれる。水溶液中の塩（複数の塩を含む場合はその合計）の濃度は、通常 １０ ｍＭ〜５ Ｍの間であり、好ましくは ５０ ｍＭ〜３ Ｍの間であり、より好ましくは ８０ ｍＭ〜２ Ｍの間であり、より好ましくは １００ ｍＭ〜１．５ Ｍの間である。例えば約１ Ｍの濃度が用いられる。
【００１９】
緩衝剤としては、ｐＨ緩衝作用のある所望の化合物が含まれ、例えばリン酸、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ （２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ （２，２−Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−２，２’，２”−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｅｔｈａｎｏｌ）、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ ｛１，３−Ｂｉｓ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅ｝、ＡＤＡ （Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ （Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ （Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳＯ （３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＥＳ （Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＴＥＳ （Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ ｛２−（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ｝、Ｔｒｉｓ （Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）、およびそれらの塩の組み合わせが含まれる。好ましい一例はＴｒｉｓである。濃度は例えば ５〜５００ ｍＭ、より好ましくは１０〜３００ ｍＭである。水溶液としてＴｒｉｓ−Ｃｌを含む水溶液を用いることができる。ＲＮＡ試料を含む水溶液と有機溶媒とは、混合する時またはその後で酸性になるようにしてよい。塩および緩衝材と含む水溶液と有機溶媒との混合液のｐＨは、具体的には、ｐＨ２．７〜６．９の間、より好ましくはｐＨ２．８〜６．７の間、より好ましくはｐＨ２．９〜６．５の間、より好ましくはｐＨ３．０〜６．０の間にすることが好ましい。有機溶媒と混合する前の塩および緩衝材と含む水溶液のｐＨは、中性〜弱アルカリ（ｐＨ６．８〜８．５程度）であってよい。溶液を酸性にするには、例えばＲＮＡ試料を含む水溶液と有機溶媒とを混合する時またはその後に、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムなどの酸性酢酸塩溶液を加える。具体的には、例えば １００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌを含む水溶液と、水飽和フェノールおよび／またはクロロホルムとを混合し、水溶液に終濃度１００〜１５０ ｍＭ程度となるよう酢酸ナトリウム液（ｐＨ ５．４）を加えて全体を酸性にする（実施例１）。
【００２０】
有機溶媒としては、水溶液に含まれる蛋白質を抽出または水溶液から不溶化させる性質を持ち、水溶液と完全には溶解しない（すなわち水層と有機層とに分離する）溶媒が用いられ、具体的にはフェノール、クロロホルム、またはそれらの混合物を好適に用いることができる。フェノールは、予め滅菌水と混合して飽和させておくことが好ましい。有機溶媒と、塩および緩衝材と含む水溶液との混合比（容量比）は約１：１が好ましいが、これに制限されない。
【００２１】
本発明の方法は、ＲＮＡを含む試料、塩類および緩衝剤を含む水溶液、ならびに有機溶媒を酸性条件となるように混合する工程（工程（ａ））、あるいは、この工程（ａ）から、この工程（ａ）で得られた水溶解液とアルコール類とを混合してＲＮＡを不溶化する工程（工程（ｂ））までの間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないことが特徴である。
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００２２】
これにより、澱粉などを多く含む試料においても、ＲＮＡ試料に多量の多糖が混入するのを防ぐことができる。また、試料溶液が糊状にならず、高い効率でＲＮＡを単離することが可能である。本発明の方法は、好ましくは、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０３％ （ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度のＳＤＳ、ＣＴＡＢ、またはサルコシルを試料に接触させない。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明の方法において、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度のイオン界面活性剤を試料に接触させない。界面活性剤とは、分子内に親水性部分と疎水性部分が分かれて存在し、液体に溶けて表面張力を有意に低下させる物質である。
【００２４】
イオン界面活性剤とは、水溶液中でイオンに乖離する界面活性剤であり、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および両性界面活性剤の任意のいずれかのことである。陰イオン界面活性剤には、Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ （ＳＤＳ）、Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ （ＬＤＳ）、Ｌｉｔｈｉｕｍ ３，５−Ｄｉｉｏｄｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ （Ｔｒｉｓ ＤＳ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｏｌａｔｅ、Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓａｌｃｏｓｉｎａｔｅが含まれる。陽イオン界面活性剤には、Ｃｅｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅが含まれる。両性界面活性剤には、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ （ＣＨＡＰＳＯ）および ３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ （ＣＨＡＰＳ） の任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。これらのいずれのイオン界面活性剤も、上記濃度で試料に接触させないことが好ましい。
【００２５】
さらに好ましくは、本発明の方法においては、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度の任意の界面活性剤（イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を含む）を試料に接触させない。
【００２６】
非イオン界面活性剤としては、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ） ｃｈｏｌａｍｉｄｅ （ＢＩＧＣＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ） ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ （Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ （Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （９） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ）、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−８）、Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−９）、Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−１０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （８） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （９） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （ＮＰ−４０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （１０） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ２０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ４０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ６０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ８０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２３） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｂｒｉｊ３５）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｃｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｂｒｉｊ５８）、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｎｏｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｓａｐｏｎｉｎ の任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。これらのいずれの非イオン界面活性剤も、上記濃度で試料に接触させないことが好ましい。
【００２７】
また本発明の方法は、好ましくは、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、１ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンチオシアネートまたはグアニジンイソチオシアネート、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素のいずれとも試料に接触させない。溶液中でチオシアンイオンを解離させる化合物には、例えばチオシアン酸アンモニウム／イソチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。またグアニジンイオンを生じる化合物には、塩酸グアニジンが含まれる。またヨウ素イオンを生じる化合物には、過ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、およびヨウ化カリウムが挙げられる。
【００２８】
より好ましくは、本発明の方法においては、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、８０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは７０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは６０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは４０ ｍＭまたはそれ以上の濃度のグアニジンチオシアネートを試料に接触させない。また、好ましくは、４００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは３００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは２００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは１００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、チオシアンイオン、またはヨウ素イオンのいずれとも試料に接触させない。また、好ましくは、９００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは８００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは７００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは６００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５００ ｍＭまたはそれ以上の濃度の尿素を試料に接触させない。
【００２９】
さらに本発明は、５００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは４００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは３００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは２００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは１００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度の塩酸グアニジンと同等またはそれ以上の蛋白質変性作用を示す濃度のカオトロピック化合物のいずれをも試料に接触させないことが好ましい。カオトロピック化合物とは、蛋白質の高次構造（２次構造、３次構造、４次構造）を破壊するが、ＲＮＡの１次構造を分解しない化合物である。蛋白質変性作用は、例えば蛋白質変性マーカーとしてウレアーゼを利用し、その残存活性を測定することにより定量することができる。代表的なカオトロピックイオンとしては、ＳＣＮ−、ＣｌＯ４ −、Ｉ−、ＮＯ３−、Ｂｒ−、ＮＨ２Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ２ ＋ などが挙げられる（Ｆ． Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ， Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｐｈａｒｍａｋｏｌ． （Ｌｅｉｐｚｉｇ） ２４ （１８８８） ２４７−２６０）。具体的なカオトロピック試薬としては、上記のグアニジンチオシアネート／グアニジンイソチオシアネート、チオシアン酸アンモニウム／イソチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、過ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、および尿素などの他、例えば過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸、などの任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。
【００３０】
試料、塩および緩衝材を含む水溶液、および有機溶媒を含む混合液から、水層を回収（または有機層を除去）すれば、試料から蛋白質、脂肪などが除かれ、高い純度でＲＮＡを含む溶液が得られる。この溶液からＲＮＡを回収することによって、ＲＮＡを単離することができる。そのためには、この溶液にアルコール類を混合し、ＲＮＡを不溶化すればよい。
【００３１】
アルコール類としては、炭素数１〜８の低級脂肪属アルコールが好ましく、具体的にはメタノール（メチルアルコール）、エタノール（エチルアルコール）、プロパノール（プロピルアルコール）、イソプロパノール（イソプロピルアルコール）、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｓｅｃ−ペンタノール、ｔｅｒｔ−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール等を挙げることができる。これらは単独であるいは所望の比率で混合して用いることができる。特に好ましいアルコール類はエタノール、イソプロパノール、およびそれらの混合物である。エタノールであれば、ＲＮＡを含む水溶液に対して例えば１．５〜２．５倍（ｖ／ｖ）量、イソプロパノールであれば例えば０．５〜１．５倍（ｖ／ｖ）量を加えてＲＮＡを不溶化する。不溶化させたＲＮＡは静置または遠心等によりＲＮＡを沈殿させ、上清を取り除くことによって単離することができる。あるいは、濾過等によって回収してもよい。不溶化させたＲＮＡは、例えば７０％エタノール等によって１回または複数回洗浄してよい。これにより残留し得る塩などを除去することができる。単離したＲＮＡは、例えば水（例えばＤＥＰＣ処理した滅菌水）またはＴＥ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， １ ｍＭ ＥＤＴＡ）などの緩衝液中に溶解することができる。あるいはＲＮＡの沈殿を乾燥させてそのまま保存してもよい。
【００３２】
本発明の方法には、当業者であれば様々なバリエーションを考え得る。例えば、適宜付加的な工程を実施することができる。例えば、有機溶媒による抽出は２回以上行なってもよい。この時、有機溶媒の種類を変えて抽出を行うことができる。例えば最初はフェノール／クロロホルム混合液で抽出を行い、次にクロロホルムで抽出してもよい。また、工程（ａ）において、水溶液に不溶物が析出した場合には、工程（ｂ）の前に遠心または濾過などを行い、不溶物を取り除くことができる（実施例４参照）。また、アルコール類の添加によりＲＮＡを回収する前に、ＲＮＡ吸着性の支持体、例えばシリカゲル等を添加し、ＲＮＡを吸着させてもよい。また、アルコール類で不溶化させたＲＮＡは、アルコール類を含む溶液中に懸濁させたままで保存することもできる。工程（ｃ）の「不溶化したＲＮＡを回収する工程」とは、このように不溶化したＲＮＡをそのままの状態にしておくことであってもよい。これらのバリエーションも本発明の範疇に含まれる。本発明の方法として最も好ましい態様は、実質的に上記工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）からなる方法である。
【００３３】
また本発明は、本発明の方法によりＲＮＡを単離するためのキットであって、塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類を含むキットに関する。キットに含まれる塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類としては、上記に記載した通りのものが好ましい。
キットには、本発明のＲＮＡの単離方法の実施手順を示す記載または該記載へのリンクを含む記録媒体を含むことが好ましい。このような記載は、
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合すること、および
（ｂ）（ａ）の混合物から得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化すること、に関する記載を含み、
上記（ａ）または（ａ）から（ｂ）の間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないように指示する記載を含んでいる。
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００３４】
さらに、（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収することに関する記載を含んでもよい。回収は、例えば不溶化したＲＮＡをアルコール類の混合液から分離することであってよい。また、回収したＲＮＡを水または緩衝液に再溶解することに関する記載を含んでもよい。
【００３５】
記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク （ＦＤ）、コンパクトディスク （ＣＤ）、デジタルビデオディスク （ＤＶＤ）、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられる。リンクとは、該記載がキット中に直接的には記載されていないが、キットに含まれる印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙またはＵＲＬなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙またはＵＲＬに該記載がある場合などが含まれる。
【００３６】
また本発明は、本発明のＲＮＡの単離方法を実行するＲＮＡ単離装置に関する。この装置は、具体的には
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する手段、および
（ｂ）該混合により得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する手段、
上記の（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒の、酸性条件下で混合、あるいは該混合から、該混合により得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化するところまでの間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないような装置である：
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００３７】
本装置はさらに、（ｂ）で不溶化したＲＮＡを分離する手段を含んでもよい。不溶化したＲＮＡの分離は、例えば遠心、濾過、または重力（静置）により行なわれる。さらに分離されたＲＮＡを、水または緩衝液に再溶解する手段を含んでもよい。
【００３８】
（ａ）および（ｂ）は、ポンプ等を用いて試料を含む容器（例えばサンプルチューブなど）に塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、またはアルコール類を注入するものであってよい。混合液は、ミキサー等により混合し、試料を破砕してもよい。また（ｃ）の不溶化したＲＮＡの分離は、水溶液とＲＮＡを互いに接触しないように分離してもよいが、単に水溶液中にＲＮＡを沈殿（または自然の重力により沈降）させるだけでもよい。あるいは遠心分離によってＲＮＡを沈殿させてもよい。また、ＲＡＮを沈殿させた後で、上清を取り除く工程があってもよい。
【００３９】
本発明の装置は、例えばＲＮＡを含む試料を含む容器を固定するキャリアー、およびこの容器中の各試料に水溶液および有機溶媒を注入するためのピペットを持っていてよい。容器としては、遠心管、スピン管、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、マルチウェルプレート、試験管などであってよい。容器の各サンプルに溶液を注入できるよう、ピペットまたは容器のキャリアーは可動できるようになっており、ＲＮＡの単離工程に従って塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、またはアルコール類を各試料を含む容器内に注入することができるようになっている。本発明の装置は、好ましくはマイクロプロセッサーにより処理される適当なソフトウェアの制御下にある。これにより処理した試料の監視、記録、および操作の容易性が向上する。本発明の装置は、処理工程を行うために種々の機械デバイスを使用することができる。好適なデバイスには、モーター、圧力ポンプ、真空ポンプおよび遠心／微遠心デバイスが含まれ得る。本発明の装置のハードウェアは、既存の機械モジュールを組み合わせて作り上げることが可能である。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
【００４１】
［実施例１］
＜精米からのＲＮＡ抽出＞
澱粉含量が非常に高いイネ種子（精米）を出発材料としてＲＮＡ抽出を行った。精米から核酸を溶出するためのバッファーとして、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ Ｍ ＫＣｌを含むｐＨ ８．０の緩衝液（オートクレーブしたもの）を用いた。このバッファーは、イネ葉からＰＣＲなどに用いるための純度の低いＤＮＡを簡易抽出するためのバッファーとして使用しているものであるが、ＲＮＡ抽出に利用された例はない。これに、ＲＮＡ分解酵素の働きを抑制するため、１％β−メルカプトエタノールを加えて用いた。
用意したバッファー０．５ ｍｌ（２ ｍｌチューブ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に精米８粒と５ ｍｍ径のジルコニアボール（井内盛栄堂）１粒を加え、しばらく吸水させたのち、粉砕装置ミキサーミルＭＭ３００（Ｒｅｔｃｈｅ社製）に４０秒間かけて粉砕したところ、精米は粉状に粉砕され、バッファーはミルク状に白濁した。糊状になるようなことはなく、また界面活性剤を添加していないため、泡の発生も見られなかった。これに０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加えて混合した。これを微量高速冷却遠心機にかけ（１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解した。２６０ ｎｍと２８０ ｎｍの吸光度を測定したところ、約３２０μｇの高純度のトータルＲＮＡが抽出されていた （２６０／２８０＝１．９０〜２．００）。得られたＲＮＡは、ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ｃＤＮＡライブラリ作成に問題なく使うことができた（後述）。
次に、１％β−メルカプトエタノールが必須かどうかを確認するため、１％β−メルカプトエタノールを含まない同じバッファーを用いて同様の実験を行ったところ、収率にはあまり変わりがなかった。よって、ＲＮＡ分解酵素の混入に十分配慮した環境で抽出を行う限りにおいては、β−メルカプトエタノールは必須ではないことがわかった。
【００４２】
［実施例２］
＜塩の種類についての検討＞
次に、核酸溶出用バッファーに用いる無機塩類の種類によるＲＮＡ抽出効率の違いを調べた。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＭｇＣｌ２（濃度はそれぞれ １ Ｍ）、なし（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭＥＤＴＡのみ）、および滅菌水のみ、の６種類のバッファーを作成し、同様に精米からのＲＮＡ抽出を行った。その結果、精米８粒から得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡの量は、以下の表のとおりになった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。最も多量のＲＮＡが得られたのはＫＣｌであり、滅菌水、ＴＥのみの場合の１０倍以上のＲＮＡ抽出効率があることがわかった。また、ＭｇＣｌ２は最も効率が悪かった。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌはＫＣｌよりは低いものの、ＲＮＡ抽出効率を上げる効果が確認できた。
以上の結果より、核酸溶出に用いるバッファーに用いる無機塩として、ＫＣｌの他、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌも有効であることが確認された。
【００４５】
［実施例３］
＜イネの他の組織からのＲＮＡ抽出＞
イネは成長・出穂・登熟の過程で、葉で合成した澱粉を貯蔵する場所を変えていくことが知られており、栄養成長過程、出穂時期には葉鞘に大量の澱粉を蓄積し、受精・登熟期には蓄積した澱粉を糖に変えて子房に転流しふたたび澱粉として蓄積する。従って、出穂期の葉鞘および受精後の子房は澱粉含量が高く、従来のＲＮＡ抽出法では十分な量・純度のＲＮＡを得ることが難しかった。そこで、本発明の方法を用いて抽出を行った。
【００４６】
子房：受精後１日〜５日の子房の混合物４０ ｍｇを出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、３ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて粉砕・混合し、以下実施例１と同様に抽出作業を行った。その結果、約３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
葉鞘：出穂期のイネ植物体のとめ葉、およびとめ葉から２番目の葉の葉鞘４００ ｍｇを出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、３ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、約３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
以上の結果より、澱粉が多量に蓄積されているイネの精米以外の組織からのＲＮＡ抽出にも、本発明の方法が有効に用いられることが確認された。
【００４７】
［実施例４］
＜他の植物種の種子からのＲＮＡ抽出＞
他の植物種の澱粉の多い組織からも本発明の方法によりＲＮＡが抽出できるかどうかを調べた。材料として、ダイズ種子、エンドウ種子、ヒマワリ種子を用いた。
【００４８】
ダイズ種子：乾燥種子１粒をアルミホイルに包み、ペンチで軽くつぶした後の半粒分を１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、種子１粒あたり約５００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
エンドウ種子：乾燥種子１粒をアルミホイルに包み、ペンチで軽くつぶしたものを１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、１粒あたり２３０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
ヒマワリ種子：乾燥種子２粒を１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。ヒマワリの場合には、水に不溶の白濁物の混入が見られたため、最後に遠心分離を追加し、上澄みをＲＮＡ溶液として回収した。その結果、１粒あたり５０〜６０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
【００４９】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。
この結果を以下の表にまとめる。
【表２】
以上の結果より、澱粉が多量に蓄積されているイネ以外の植物種の組織からのＲＮＡ抽出にも、本発明の方法が有効に用いられることが確認された。
【００５０】
［実施例５］
＜フェノール、クロロホルムが必要かどうかの検討＞
本発明の方法によるＲＮＡ抽出において用いられる有機溶媒として、フェノールとクロロホルムの両者が必要かどうかを調べた。精米８粒を出発材料とし、１ Ｍ ＫＣｌ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む核酸溶出バッファー０．５ ｍｌ、５ ｍｍ径ジルコニアボール、を含む２ ｍｌチューブ内でＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４０秒間粉砕した。その後、実施例１と同様に０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加えて混合した。これを微量高速冷却遠心機にかけ （１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。また、０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加える代わりに、
（ア） ３００μｌ酸性フェノール、４０μｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて混合し、以下同様にＲＮＡを回収した。
（イ） ３００μｌクロロホルム、４０μｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて混合し、以下同様にＲＮＡを回収した。
の２通りの方法を試みた。
【００５１】
その結果、フェノールのみ、クロロホルムのみ、のいずれの場合にも、若干効率は落ちるもののある程度のＲＮＡが得られることがわかった。結果を以下の表にまとめる。
【００５２】
【表３】
【００５３】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。
これにより、本発明の方法で用いる、タンパク質、ＤＮＡ等夾雑物質を取り除くための有機溶媒としては、フェノール、クロロホルムの両方用いた場合が最も効率がよいが、どちらか一方のみでもかなりの程度ＲＮＡを抽出できることが確認された。
【００５４】
［実施例６］
＜試料と水溶液との混合（工程（ａ１））、および水溶液と有機溶媒との混合と（工程（ａ２））を同時に行えるかどうかの検討＞
多検体処理、機械化を考えた場合、工程の数はできるだけ少ない方が好ましい。このため試料の粉砕および核酸溶出バッファーへの混合（工程（ａ１））と、有機溶媒による夾雑物質の除去（工程（ａ２））とを、同時に行う方法を検討した。精米８粒を出発材料とし、１ Ｍ ＫＣｌ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む核酸溶出バッファー０．５ ｍｌ、５ ｍｍ径ジルコニアボール、３００μｌ 酸性フェノール、１４０μｌ クロロホルム、４０μｌ ３Ｍ酢酸ナトリウムを含む２ ｍｌチューブ内でＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４０秒間粉砕した。これを微量高速冷却遠心機にかけ（１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【００５５】
その結果、工程（ａ１）、工程（ａ２）を順に行う場合に比べて遜色ない程度のＲＮＡを得ることができ、工程（ａ１）と工程（ａ２）を同時に行っても、十分な量と純度のＲＮＡを得られることが確認できた（データ省略）。工程（ａ１）と工程（ａ２）を同時に行うことにより、別々に行なった場合、工程（ａ２）において必要な、「チューブのふたを開け、試薬を加え、ふたを閉め、混合する」というような手間を省くことができる。このことは、特に多検体処理または機械化を考える際に重要である。
【００５６】
［実施例７］
＜精米から抽出したＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリの作成＞
本発明の方法で抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリの作成を行った。
材料として、精米「魚沼産コシヒカリ」（Ａ， Ｂ， Ｃ）「茨城産コシヒカリ」（Ｄ， Ｅ， Ｆ）の６種類を用い、本発明の方法により、１ ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをそれぞれの材料より得た。
得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて精製を行い、それぞれの材料由来のｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡから、以下の配列を持つプライマーの混合物の存在下で逆転写反応を行い、３’末端側のｐｏｌｙＡが約１１ ｂｐに短縮されたｃＤＮＡを得た。使用したプライマーの配列は、５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ａ−３’ （配列番号：１）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｇ−３’ （配列番号：２）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＡ−３’ （配列番号：３）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＧ−３’ （配列番号：４）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＣ−３’ （配列番号：５） 及び ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴ−３’ （配列番号：６） である。
【００５７】
作成したｃＤＮＡは、制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造）で消化した後、ＮｏｔＩ（宝酒造）及びＢａｍＨＩ（宝酒造）で二重消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ） を用いてライゲーションした。これを、制限酵素ＭｂｏＩ （宝酒造） で消化し、再度Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ） を用いてセルフライゲーションした。これをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ （ＴＯＹＯＢＯ） に形質転換し、青白セレクションを行い、得られた白コロニーをｃＤＮＡライブラリのクローンとした。作成した６種のｃＤＮＡライブラリより各１１００クローンのｃＤＮＡのインサートをもつ白コロニークローンを収集し、アンピシリン（Ａｍｐ）入りＬＢ培地 １００μｌ を入れた９６穴 ｍｉｃｒｏ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ で培養及び保管した。以上の操作により、３’末端のｐｏｌｙＡが１１塩基に短縮され、３’末端側の特異的配列を持つｃＤＮＡライブラリを作成した。
【００５８】
続いて収集した全てのクローンの塩基配列を、ＭａｇａＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍｎａｍｉｃｓ） を用いて塩基配列決定を行った。
シーケンス反応は、まず、９６穴ｍｉｃｒｏ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅで培養した培養液１μｌを鋳型とし、２０μｌスケールでＭ４ （５’−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣ−３’） （配列番号：７）、ＲＶ （５’−ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３’） （配列番号：８） をプライマーとして挿入された塩基配列をＰＣＲ法により増幅し、この反応液からＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ （ＵＳＢ） を用いて未反応のプライマーとｄＮＴＰを取り除いて、シークエンス反応の鋳型を作成した。この鋳型に対して、Ｍ４をプライマーとして、ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＭｅｇａＢＡＣＥ （Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ） を用いてシークエンスサイクル反応を行い、シークエンス用サンプルを作成した。
【００５９】
得られたシーケンスデータは、植物ゲノムセンターのデータサーバに転送し、遺伝子発現プロファイリングシステムにより、それぞれのクローンの配列情報の精製・グルーピング・相同性検索を行い、ライブラリ間の各シークエンスグループの発現頻度比較を行った。その結果の詳細は省略するが、得られたシーケンスを確認したところ９０％以上がポリＡテイルを有しており、高品質のｃＤＮＡ ３’末端ライブラリを作成することが可能であることが確認された。
【００６０】
［実施例８］
＜ＡＴＡ共存下でのＲＮＡ抽出＞
次に、核酸溶出用バッファーにａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＴＡ）を２ ｍＭの濃度で添加したＡＴＡ添加核酸溶出用バッファーを用いて、＜精米からのＲＮＡ抽出＞と同様の手順で、精米からのＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡ溶液は、ＡＴＡの存在のために赤色を有しており、吸光光度計による測定では正確な濃度が判定できない。このため、アガロースゲル電気泳動により得られたＲＮＡの量と純度を確認した。その結果、ＡＴＡを添加しない場合に比べ若干効率が落ちてはいるものの、十分な量と純度のｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られていることが確認された。
ＡＴＡは核酸と挙動をともにし、核酸分解酵素等のタンパク質のＲＮＡへの結合を強力に阻害する。このため、この方法で得られたＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ等には使えない。しかし、ＲＮａｓｅを十分に排除できない条件下でのハイブリダイゼーション実験（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）等に用いることができる。
【００６１】
［実施例９］
＜多検体処理および機械化の検討＞
本発明のＲＮＡ抽出法は、ステップ数が少なく簡便であるために、多検体処理および機械化に適すると考えられる。
１．２ ｍｌ容９６コレクションチューブラック（ＱＩＡＧＥＮ）に、１チューブあたり精米４粒、１ Ｍ ＫＣｌを含む核酸溶出バッファー ２５０μｌ、酸性フェノール １５０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム ２０μｌを混合した溶液（以下、混合抽出バッファーと称する）４２０μｌ、クロロホルム ７０μｌ、３ミリ径ジルコニアボール１個を加えてキャップをし、ＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４分間、２回粉砕した。ラックを遠心機（日立工機、ＨＩＭＡＣ−ＣＲ２０Ｇ、ローターとしてＲ３Ｓ）を用いて、３０００ ｒｐｍ、２０分間遠心した。ラックを静かにとりだし、キャップをあけ、８連あるいは１２連ピペッターを用いて上清約１００μｌを取り、市販のＰＣＲ用９６ウェルプレート（日本ジェネティクス）に移した。そこに、１００μｌイソプロパノ−ルを８連または１２連ピペッターを用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に混合した。プレートをサランラップで軽く包み、−２０℃のフリーザー中で２０分間冷却した。その後、遠心機（日立工機、ＨＩＭＡＣ−ＣＲ２０Ｇ、ローターとしてＲ３Ｓ）を用いて３０００ ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。プレートをペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去後、２００μｌの７０％エタノールを８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、ただちに３０００ ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。再びプレートをペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去し、さらに新しいペーパータオル上に伏せたまま、遠心機にセットし、１００ ｒｐｍで１秒間遠心してエタノールを完全に除去した。１０μｌのジエチルピロカーボネート処理済の滅菌水を８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に溶解した。吸光度を測定したところ、精米４粒から平均２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られたことがわかった。
【００６２】
機械化の例として、日立工機のマイクロプレートロボットＡＰ−１を用いた自動抽出を試みた。使用するプログラムは、ＡＰ−１にあらかじめインストールされているゲノムＤＮＡ抽出用のプログラム（日立工機）をほぼそのまま使用した。
【００６３】
１．２ ｍｌ容９６コレクションチューブラック（ＱＩＡＧＥＮ）に試料として精米４粒と混合抽出バッファー４２０μｌ、クロロホルム７０μｌを加えて上記の方法で粉砕・混合し、キャップの裏についた液体を取り除く程度に軽く（１０００ ｒｐｍ、１０秒程度）遠心後、チューブのキャップを外してＡＰ−１にセットした。その後、ＡＰ−１はセットされたラックを遠心機内に移動し、遠心し、取り出し、９６サンプル同時に上清１００μｌを吸い上げ、あらかじめ１００μｌのイソプロパノールを分注しておいた９６ウェルＰＣＲプレートに移し、数回ピペッティングして完全に混合した。さらに混合したサンプルを遠心機に移動し、３０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心した。ＡＰ−１自体には冷却装置がないため、４℃での遠心時間を長くした。遠心後の上清除去は、ピペットによる吸出しで行った。さらに、ＡＰ−１は２００μｌの７０％エタノールを加え、再び遠心機に移動し、３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。遠心終了後、プレートを規定の位置に戻してＡＰ−１の動作は終了した。
【００６４】
プレートを取り出し、ペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去し、さらに新しいペーパータオル上に伏せたまま、遠心機にセットし、１００ｒｐｍで１秒間遠心してエタノールを完全に除去した。１０μｌのジエチルピロカーボネート処理済の滅菌水を８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に溶解した。吸光度を測定したところ、精米４粒から平均２０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られたことがわかった。９６×４＝３８４検体からのＲＮＡ抽出に必要な時間は約２時間であった。
以上の結果から、本発明のＲＮＡ抽出法を用いることにより、多検体からのＲＮＡ抽出を自動化できることが示された。
【００６５】
【発明の効果】
本発明により、簡便かつ迅速に生体試料などからＲＮＡを抽出／精製することが可能となった。本発明の方法は、澱粉を多量に含む生体試料からでも少ないステップでＲＮＡを精製することができる。また、多検体を同時に処理したり、機械化が容易な点でも優れている。得られたＲＮＡは、ｃＤＮＡライブラリの作製およびその他の用途に用いることができる。
【００６６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は迅速かつ簡便にＲＮＡを抽出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物・動物等の生体組織からＲＮＡを抽出するための方法としてこれまで知られているものとして代表的なものは以下の方法である。
（１） グアニジウム法
強力なタンパク質変性剤であるグアニジンチオシアネートをＲＮａｓｅ阻害剤として利用する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９ （１９８７））。通常、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（サルコシル）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を添加する。これらは細胞膜を破壊すると同時に、弱いＲＮａｓｅ阻害剤として作用する。また、β−メルカプトエタノールはＲＮａｓｅ内のＳ−Ｓ結合を還元することによりＲＮａｓｅを不活性化する。これらを主な成分として含むバッファー中に核酸を溶出させる。その後の処理としては、酸性条件下でフェノール抽出を行い、ＲＮＡのみを水層に分離する方法（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ： ＡＧＰＣ法）が一般的であるが、塩化セシウム勾配を利用した超遠心によりＲＮＡを分離する方法もある。
【０００３】
（２） ＳＤＳ−フェノール法
１％程度のＳＤＳを主な成分として有するバッファーにより組織から核酸を溶出し、その後、酸性条件下でフェノール抽出することによりＲＮＡを水層に分離する方法である。根などの多糖類の多く含まれる組織からのＲＮＡ抽出において多糖類の混入が少ないといわれているが、多糖類を十分に取り除くためには、２〜３Ｍの塩化リチウム水溶液を用いた沈殿を繰り返す必要がある。
【０００４】
（３）ＡＴＡ法
ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＡ）を核酸溶出バッファー中のＲＮａｓｅ阻害剤として使用する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９， ４２９９−４３０３ （１９８０））。以降の操作はＡＧＰＣ法、ＳＤＳ−フェノール法と同様である。ＡＴＡはＲＮＡと挙動をともにしやすいため、グアニジウム法に比べてＲＮＡの分解が少なく、より高品質のＲＮＡが得られる。しかし、ＡＴＡは逆転写反応を阻害するため、ノーザン解析には問題ないが、ＲＴ−ＰＣＲまたはｃＤＮＡライブラリ作成には用いることができないという欠点がある。多糖類の少ない草本植物の葉などに適した方法である。
【０００５】
（４）ＣＴＡＢ法
１．５％程度のＣＴＡＢと０．７Ｍ程度の塩化ナトリウムを含む溶液中では、核酸は溶解できるが多糖類は溶解できない性質を利用するものであり、木本植物の葉などからのＲＮＡ抽出等に用いられた例がある（Ｃｈａｎｇ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔ １１， １１３−１１６ （１９９３）；「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」島本功、佐々木卓治 監修（秀潤社）（１９９７年））。核酸溶出後はクロロホルム抽出、リチウム沈殿、フェノール・クロロホルム抽出を繰り返して多糖類を除去する。しかし、米などのように極度に澱粉含量が高い試料の場合には限界があり、十分な量のＲＮＡを確保するためには多量の出発材料を確保する必要がある。
【０００６】
上記のような抽出法には以下のような問題点がある。
１）強力なタンパク質変性剤、タンパク質・核酸結合阻害剤等、人体に有害である可能性が高く、また高価な試薬が必要である。
２）タンパク質・多糖類等を取り除くために、ステップ数が多い。
とくにポリフェノールまたは澱粉の多い組織から抽出するためには煩雑な方法が必要である。
３）上記の結果、多検体処理または機械化が困難である。
【０００７】
実際に、澱粉含量が非常に高いイネ種子（精米）を出発材料としたＲＮＡ抽出を、グアニジウム法で行った。グアニジウム法は、発明者らがイネ植物体組織（葉など）通常用いている方法である。その結果、粉砕した精米をグアニジウム塩を含むバッファーに溶解した段階で澱粉が大量に溶出し、溶液が糊状になった。遠心分離後の上清を移転し、アルコール塩析したところ、ＲＮＡと澱粉の混合物と見られる団子状の沈殿が析出した。澱粉とＲＮＡを分離するために、滅菌水への溶解と塩析を繰り返したが、澱粉の減少とともにＲＮＡも失われるため、純度の高いＲＮＡの抽出には至らなかった。上記のいずれの方法においても、核酸溶出バッファー中に澱粉が混入するため、澱粉除去のためのステップが不可避になること、出発材料が多量に必要なことから多検体処理または機械化は困難である。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９ （１９８７）
【非特許文献２】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９， ４２９９−４３０３ （１９８０）
【非特許文献３】
Ｃｈａｎｇ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔ １１， １１３−１１６ （１９９３）
【非特許文献４】
「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」島本功、佐々木卓治 監修（秀潤社）（１９９７年）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＲＮＡを単離する方法を提供する。特に本発明は、澱粉を多量に含む生体組織から迅速かつ簡便にＲＮＡを単離する方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来のＲＮＡ単離法の欠点を克服する新たなＲＮＡ単離方法を確立するため鋭意研究を行った。その結果、（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、または（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、のいずれにも試料を接触させずに、試料を塩類および緩衝剤を含む水溶液ならびに有機溶媒と酸性条件下で混合して水溶液から蛋白質を除去し、得られたＲＮＡを含む水溶液をアルコール類と混合してＲＮＡを不溶化し、このＲＮＡを回収することによって、極めて効率的にＲＮＡを単離することができることを見いだした。
【００１１】
本発明の方法を利用することにより、動物および植物のさまざまな組織等から簡便かつ迅速にＲＮＡを抽出することが可能となった。この方法では、通常遺伝子操作を行う実験室等に常備されている一般試薬以外の特殊または高価な試薬、あるいは特殊な設備または器具は不要である。また、少量の検体から効率よく抽出できること、操作が単純で段階数が少ないことから、多検体処理および機械化が可能である。また、従来の方法では、ポリフェノールまたは澱粉等を多く含む試料では、これらがＲＮＡと共に回収されてしまい、これを取り除くために付加的なステップを必要としていた。しかし本発明の方法では、ポリフェノールまたは澱粉等を多く含む試料からでもＲＮＡを特異的に単離することができる。従って本発明の方法は、澱粉等を多く含む試料、例えば植物の種子等からのＲＮＡ調製に特に好適に用いられる。
【００１２】
すなわち本発明は、所望の試料からＲＮＡを単離するための方法およびキット等に関し、より具体的には、
（１）ＲＮＡの単離方法であって、
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の混合物から得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収する工程、を含み、
工程（ａ）または工程（ａ）から工程（ｂ）の間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させない方法、
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、
（２）酸性条件が、ｐＨ３から６である、（１）に記載の方法、
（３）緩衝剤が、Ｔｒｉｓ−Ｃｌである、（１）に記載の方法、
（４）塩類が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種類またはそれ以上の無機塩類である、（１）に記載の方法、
（５）有機溶媒が、フェノール、クロロホルム、またはそれらの両方である、（１）に記載の方法、
（６）アルコール類が、イソプロパノール、エタノール、またはそれらの両方である、（１）に記載の方法、
（７）塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類を含む、（１）に記載の方法によりＲＮＡを単離するためのキット、
（８）（１）に記載のＲＮＡの単離方法を実行するＲＮＡ単離装置、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲＮＡの単離方法であって、（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する工程、（ｂ）工程（ａ）において得られた水溶解液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収する工程、を含み、工程（ａ）または工程（ａ）から工程（ｂ）の間において、該試料を（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）、または（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素、のいずれとも接触させない方法に関する。
【００１４】
試料としてはＲＮＡを含む所望の材料であってよく、例えばＲＮＡを含む食品または任意の試薬等が含まれる。試料として想定される主要な対象は生物材料である。具体的には、血液、血清、尿、糞便、精液、唾液、リンパ液またはその他の体液、組織、細胞、および水もしくは土壌サンプルなどが含まれる。本発明は、澱粉等の多糖類を比較的多く含む生体材料からのＲＮＡの抽出に特に優れた効果を発揮する。多糖とは、グルコースなどの単糖が直線状または分枝状につながった結合物を言い、グリコーゲン、澱粉、セルロースが含まれる。また澱粉には、アミロースおよびアミロペクチンが含まれる。多糖１分子には、通常グルコースは５個以上、例えば１０個以上つながって構成されており、例えば数十個以上、数百個以上、あるいは数千個以上つながっている。本発明において好適なＲＮＡ含有試料としては、具体的には、澱粉、および／またはグリコーゲン（これらの複数を含む場合はそれらの合計）を１％（乾燥重量比）またはそれ以上、より好ましくは２％以上、より好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上で含むような試料である。このような材料としては、特に植物の種子、子房、根、根茎、および葉鞘が挙げられる。特に、本発明は植物の種子からＲＮＡを調製するために好適に用いられる。
【００１５】
本発明の方法においては、ＲＮＡ含有試料、塩類および緩衝剤を含む水溶液、ならびに有機溶媒を混合して酸性になるようにする。これらを混合する順序は任意であってよい。また、段階的に混合しても、一度に混合してもよい。例えばまず試料と塩類および緩衝剤を含む水溶液とを混合し、これを有機溶媒と混合することは好ましい。この場合、緩衝剤を含む水溶液は、有機溶媒との混合前は酸性でなくてもよい。例えば水溶液を最初は中性〜弱アルカリ（ｐＨ６．８〜８．５程度）のｐＨにしておき、これを有機溶媒を混合した時またはその後に酸性にすることができる（実施例１参照）。また、全てを同時に混合してもよい（実施例６参照）。同時に混合することによって、ＲＮＡ抽出のためのステップを減らすことができる。これは、多くの試料を処理する場合、およびＲＮＡ調製の自動化などにおいて有利である。
【００１６】
試料は、ＲＮＡが抽出されやすいようにするため、有機溶媒と混合する前などに、適宜破砕または溶解することができる。例えばミキサー、ミンサー、ホモジェナイザー、ソニケーターなどを用いて試料を破砕し、これを塩類および緩衝剤を含む水溶液に混合することができる。試料は、該水溶液に混合してから破砕してもよいし、あるいはさらに有機溶媒と混合した後で破砕することもできる（実施例６参照）。塩類および緩衝剤を含む水溶液には、好ましくはキレート剤を添加しておく。キレート剤とは、陽イオン金属原子（好ましくは２価の陽イオン金属原子）と配位結合を形成する化合物であり、好ましくはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）が用いられる。水溶液中のＥＤＴＡ濃度は、例えば １ ｍＭ〜０．５ Ｍ、好ましくは３ ｍＭ〜３００ ｍＭ、より好ましくは５ ｍＭ〜１００ ｍＭ、例えば約１０ ｍＭにする。キレート剤により、例えばＭｇ２＋依存性の酵素活性を阻害し試料の分解を抑制することができる。またキレート剤として、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）を添加してもよい。また該水溶液には、還元剤が含まれることが好ましい。これにより、溶液中に共存し得るＲＮａｓｅ活性を低下させることができる。還元剤としては、β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などが用いられる。還元剤濃度は適宜調整してよいが、β−メルカプトエタノールであれば例えば ０．１％〜５％（容量／容量； ｖ／ｖ）、ＤＴＴであれば ０．１ ｍＭ〜３０ ｍＭ程度である。しかし、還元剤非存在下でも、十分高い効率でＲＮＡを単離することができる（実施例１）。また、水溶液にはａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＴＡ）を添加してもよい（実施例８参照）。
【００１７】
工程（ａ）の温度は通常、０℃〜８０℃の間で行うが、好ましくは０℃〜３０℃の間、より好ましくは０℃〜１０℃の間、より好ましくは０℃〜５℃の間で行う。工程（ａ）で水溶液と有機溶媒が混合されてから工程（ｂ）を行うまでの時間（すなわち有機溶媒による抽出時間）は、試料中の蛋白質等を変性させ、不溶化または有機溶媒側に抽出するのに十分な時間であれば特に制限はないが、下限は通常１分以上、好ましくは５分以上であり、上限に特に制限はないが通常数日以内、好ましくは２４時間以内である。水溶液と有機溶媒の混合液は、振とう器またはボルテックスミキサーなどでよく混合し、効率的に蛋白質を変性・除去することが好ましい。
【００１８】
本発明の方法で用いる塩類としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、および酢酸ナトリウムなどの所望の塩を単独または複数組み合わせてよい。好ましくは無機塩類、特に一価の金属塩が挙げられ、例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、および酢酸ナトリウムなどが含まれる。水溶液中の塩（複数の塩を含む場合はその合計）の濃度は、通常 １０ ｍＭ〜５ Ｍの間であり、好ましくは ５０ ｍＭ〜３ Ｍの間であり、より好ましくは ８０ ｍＭ〜２ Ｍの間であり、より好ましくは １００ ｍＭ〜１．５ Ｍの間である。例えば約１ Ｍの濃度が用いられる。
【００１９】
緩衝剤としては、ｐＨ緩衝作用のある所望の化合物が含まれ、例えばリン酸、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ （２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ （２，２−Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−２，２’，２”−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｅｔｈａｎｏｌ）、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ ｛１，３−Ｂｉｓ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅ｝、ＡＤＡ （Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ （Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ （Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳＯ （３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＥＳ （Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＴＥＳ （Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ ｛２−（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ｝、Ｔｒｉｓ （Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）、およびそれらの塩の組み合わせが含まれる。好ましい一例はＴｒｉｓである。濃度は例えば ５〜５００ ｍＭ、より好ましくは１０〜３００ ｍＭである。水溶液としてＴｒｉｓ−Ｃｌを含む水溶液を用いることができる。ＲＮＡ試料を含む水溶液と有機溶媒とは、混合する時またはその後で酸性になるようにしてよい。塩および緩衝材と含む水溶液と有機溶媒との混合液のｐＨは、具体的には、ｐＨ２．７〜６．９の間、より好ましくはｐＨ２．８〜６．７の間、より好ましくはｐＨ２．９〜６．５の間、より好ましくはｐＨ３．０〜６．０の間にすることが好ましい。有機溶媒と混合する前の塩および緩衝材と含む水溶液のｐＨは、中性〜弱アルカリ（ｐＨ６．８〜８．５程度）であってよい。溶液を酸性にするには、例えばＲＮＡ試料を含む水溶液と有機溶媒とを混合する時またはその後に、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムなどの酸性酢酸塩溶液を加える。具体的には、例えば １００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌを含む水溶液と、水飽和フェノールおよび／またはクロロホルムとを混合し、水溶液に終濃度１００〜１５０ ｍＭ程度となるよう酢酸ナトリウム液（ｐＨ ５．４）を加えて全体を酸性にする（実施例１）。
【００２０】
有機溶媒としては、水溶液に含まれる蛋白質を抽出または水溶液から不溶化させる性質を持ち、水溶液と完全には溶解しない（すなわち水層と有機層とに分離する）溶媒が用いられ、具体的にはフェノール、クロロホルム、またはそれらの混合物を好適に用いることができる。フェノールは、予め滅菌水と混合して飽和させておくことが好ましい。有機溶媒と、塩および緩衝材と含む水溶液との混合比（容量比）は約１：１が好ましいが、これに制限されない。
【００２１】
本発明の方法は、ＲＮＡを含む試料、塩類および緩衝剤を含む水溶液、ならびに有機溶媒を酸性条件となるように混合する工程（工程（ａ））、あるいは、この工程（ａ）から、この工程（ａ）で得られた水溶解液とアルコール類とを混合してＲＮＡを不溶化する工程（工程（ｂ））までの間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないことが特徴である。
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００２２】
これにより、澱粉などを多く含む試料においても、ＲＮＡ試料に多量の多糖が混入するのを防ぐことができる。また、試料溶液が糊状にならず、高い効率でＲＮＡを単離することが可能である。本発明の方法は、好ましくは、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０３％ （ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度のＳＤＳ、ＣＴＡＢ、またはサルコシルを試料に接触させない。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明の方法において、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度のイオン界面活性剤を試料に接触させない。界面活性剤とは、分子内に親水性部分と疎水性部分が分かれて存在し、液体に溶けて表面張力を有意に低下させる物質である。
【００２４】
イオン界面活性剤とは、水溶液中でイオンに乖離する界面活性剤であり、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および両性界面活性剤の任意のいずれかのことである。陰イオン界面活性剤には、Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ （ＳＤＳ）、Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ （ＬＤＳ）、Ｌｉｔｈｉｕｍ ３，５−Ｄｉｉｏｄｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ （Ｔｒｉｓ ＤＳ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｏｌａｔｅ、Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓａｌｃｏｓｉｎａｔｅが含まれる。陽イオン界面活性剤には、Ｃｅｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅが含まれる。両性界面活性剤には、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ （ＣＨＡＰＳＯ）および ３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ （ＣＨＡＰＳ） の任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。これらのいずれのイオン界面活性剤も、上記濃度で試料に接触させないことが好ましい。
【００２５】
さらに好ましくは、本発明の方法においては、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、０．０５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０２％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．０１％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００５％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度、より好ましくは０．００３％ （ｗ／ｖ） またはそれ以上の濃度の任意の界面活性剤（イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を含む）を試料に接触させない。
【００２６】
非イオン界面活性剤としては、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ） ｃｈｏｌａｍｉｄｅ （ＢＩＧＣＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ） ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ （Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ （Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （９） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ）、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−８）、Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−９）、Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ （ＭＥＧＡ−１０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （８） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （９） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （ＮＰ−４０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （１０） Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ２０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ４０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ６０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ （Ｔｗｅｅｎ ８０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２３） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｂｒｉｊ３５）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ （２０） Ｃｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ （Ｂｒｉｊ５８）、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｎｏｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｓａｐｏｎｉｎ の任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。これらのいずれの非イオン界面活性剤も、上記濃度で試料に接触させないことが好ましい。
【００２７】
また本発明の方法は、好ましくは、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、１ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンチオシアネートまたはグアニジンイソチオシアネート、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素のいずれとも試料に接触させない。溶液中でチオシアンイオンを解離させる化合物には、例えばチオシアン酸アンモニウム／イソチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。またグアニジンイオンを生じる化合物には、塩酸グアニジンが含まれる。またヨウ素イオンを生じる化合物には、過ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、およびヨウ化カリウムが挙げられる。
【００２８】
より好ましくは、本発明の方法においては、上記工程（ａ）、あるいは、この工程（ａ）から上記工程（ｂ）までの間において、８０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは７０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは６０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは４０ ｍＭまたはそれ以上の濃度のグアニジンチオシアネートを試料に接触させない。また、好ましくは、４００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは３００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは２００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは１００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、チオシアンイオン、またはヨウ素イオンのいずれとも試料に接触させない。また、好ましくは、９００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは８００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは７００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは６００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５００ ｍＭまたはそれ以上の濃度の尿素を試料に接触させない。
【００２９】
さらに本発明は、５００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは４００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは３００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは２００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは１００ ｍＭまたはそれ以上の濃度、より好ましくは５０ ｍＭまたはそれ以上の濃度の塩酸グアニジンと同等またはそれ以上の蛋白質変性作用を示す濃度のカオトロピック化合物のいずれをも試料に接触させないことが好ましい。カオトロピック化合物とは、蛋白質の高次構造（２次構造、３次構造、４次構造）を破壊するが、ＲＮＡの１次構造を分解しない化合物である。蛋白質変性作用は、例えば蛋白質変性マーカーとしてウレアーゼを利用し、その残存活性を測定することにより定量することができる。代表的なカオトロピックイオンとしては、ＳＣＮ−、ＣｌＯ４ −、Ｉ−、ＮＯ３−、Ｂｒ−、ＮＨ２Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ２ ＋ などが挙げられる（Ｆ． Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ， Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｐｈａｒｍａｋｏｌ． （Ｌｅｉｐｚｉｇ） ２４ （１８８８） ２４７−２６０）。具体的なカオトロピック試薬としては、上記のグアニジンチオシアネート／グアニジンイソチオシアネート、チオシアン酸アンモニウム／イソチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、過ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、および尿素などの他、例えば過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸、などの任意の１つまたは任意の組み合わせが挙げられる。
【００３０】
試料、塩および緩衝材を含む水溶液、および有機溶媒を含む混合液から、水層を回収（または有機層を除去）すれば、試料から蛋白質、脂肪などが除かれ、高い純度でＲＮＡを含む溶液が得られる。この溶液からＲＮＡを回収することによって、ＲＮＡを単離することができる。そのためには、この溶液にアルコール類を混合し、ＲＮＡを不溶化すればよい。
【００３１】
アルコール類としては、炭素数１〜８の低級脂肪属アルコールが好ましく、具体的にはメタノール（メチルアルコール）、エタノール（エチルアルコール）、プロパノール（プロピルアルコール）、イソプロパノール（イソプロピルアルコール）、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｓｅｃ−ペンタノール、ｔｅｒｔ−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール等を挙げることができる。これらは単独であるいは所望の比率で混合して用いることができる。特に好ましいアルコール類はエタノール、イソプロパノール、およびそれらの混合物である。エタノールであれば、ＲＮＡを含む水溶液に対して例えば１．５〜２．５倍（ｖ／ｖ）量、イソプロパノールであれば例えば０．５〜１．５倍（ｖ／ｖ）量を加えてＲＮＡを不溶化する。不溶化させたＲＮＡは静置または遠心等によりＲＮＡを沈殿させ、上清を取り除くことによって単離することができる。あるいは、濾過等によって回収してもよい。不溶化させたＲＮＡは、例えば７０％エタノール等によって１回または複数回洗浄してよい。これにより残留し得る塩などを除去することができる。単離したＲＮＡは、例えば水（例えばＤＥＰＣ処理した滅菌水）またはＴＥ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， １ ｍＭ ＥＤＴＡ）などの緩衝液中に溶解することができる。あるいはＲＮＡの沈殿を乾燥させてそのまま保存してもよい。
【００３２】
本発明の方法には、当業者であれば様々なバリエーションを考え得る。例えば、適宜付加的な工程を実施することができる。例えば、有機溶媒による抽出は２回以上行なってもよい。この時、有機溶媒の種類を変えて抽出を行うことができる。例えば最初はフェノール／クロロホルム混合液で抽出を行い、次にクロロホルムで抽出してもよい。また、工程（ａ）において、水溶液に不溶物が析出した場合には、工程（ｂ）の前に遠心または濾過などを行い、不溶物を取り除くことができる（実施例４参照）。また、アルコール類の添加によりＲＮＡを回収する前に、ＲＮＡ吸着性の支持体、例えばシリカゲル等を添加し、ＲＮＡを吸着させてもよい。また、アルコール類で不溶化させたＲＮＡは、アルコール類を含む溶液中に懸濁させたままで保存することもできる。工程（ｃ）の「不溶化したＲＮＡを回収する工程」とは、このように不溶化したＲＮＡをそのままの状態にしておくことであってもよい。これらのバリエーションも本発明の範疇に含まれる。本発明の方法として最も好ましい態様は、実質的に上記工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）からなる方法である。
【００３３】
また本発明は、本発明の方法によりＲＮＡを単離するためのキットであって、塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類を含むキットに関する。キットに含まれる塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類としては、上記に記載した通りのものが好ましい。
キットには、本発明のＲＮＡの単離方法の実施手順を示す記載または該記載へのリンクを含む記録媒体を含むことが好ましい。このような記載は、
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合すること、および
（ｂ）（ａ）の混合物から得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化すること、に関する記載を含み、
上記（ａ）または（ａ）から（ｂ）の間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないように指示する記載を含んでいる。
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００３４】
さらに、（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収することに関する記載を含んでもよい。回収は、例えば不溶化したＲＮＡをアルコール類の混合液から分離することであってよい。また、回収したＲＮＡを水または緩衝液に再溶解することに関する記載を含んでもよい。
【００３５】
記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク （ＦＤ）、コンパクトディスク （ＣＤ）、デジタルビデオディスク （ＤＶＤ）、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられる。リンクとは、該記載がキット中に直接的には記載されていないが、キットに含まれる印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙またはＵＲＬなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙またはＵＲＬに該記載がある場合などが含まれる。
【００３６】
また本発明は、本発明のＲＮＡの単離方法を実行するＲＮＡ単離装置に関する。この装置は、具体的には
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する手段、および
（ｂ）該混合により得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する手段、
上記の（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒の、酸性条件下で混合、あるいは該混合から、該混合により得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化するところまでの間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させないような装置である：
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたは０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。
【００３７】
本装置はさらに、（ｂ）で不溶化したＲＮＡを分離する手段を含んでもよい。不溶化したＲＮＡの分離は、例えば遠心、濾過、または重力（静置）により行なわれる。さらに分離されたＲＮＡを、水または緩衝液に再溶解する手段を含んでもよい。
【００３８】
（ａ）および（ｂ）は、ポンプ等を用いて試料を含む容器（例えばサンプルチューブなど）に塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、またはアルコール類を注入するものであってよい。混合液は、ミキサー等により混合し、試料を破砕してもよい。また（ｃ）の不溶化したＲＮＡの分離は、水溶液とＲＮＡを互いに接触しないように分離してもよいが、単に水溶液中にＲＮＡを沈殿（または自然の重力により沈降）させるだけでもよい。あるいは遠心分離によってＲＮＡを沈殿させてもよい。また、ＲＡＮを沈殿させた後で、上清を取り除く工程があってもよい。
【００３９】
本発明の装置は、例えばＲＮＡを含む試料を含む容器を固定するキャリアー、およびこの容器中の各試料に水溶液および有機溶媒を注入するためのピペットを持っていてよい。容器としては、遠心管、スピン管、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、マルチウェルプレート、試験管などであってよい。容器の各サンプルに溶液を注入できるよう、ピペットまたは容器のキャリアーは可動できるようになっており、ＲＮＡの単離工程に従って塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、またはアルコール類を各試料を含む容器内に注入することができるようになっている。本発明の装置は、好ましくはマイクロプロセッサーにより処理される適当なソフトウェアの制御下にある。これにより処理した試料の監視、記録、および操作の容易性が向上する。本発明の装置は、処理工程を行うために種々の機械デバイスを使用することができる。好適なデバイスには、モーター、圧力ポンプ、真空ポンプおよび遠心／微遠心デバイスが含まれ得る。本発明の装置のハードウェアは、既存の機械モジュールを組み合わせて作り上げることが可能である。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
【００４１】
［実施例１］
＜精米からのＲＮＡ抽出＞
澱粉含量が非常に高いイネ種子（精米）を出発材料としてＲＮＡ抽出を行った。精米から核酸を溶出するためのバッファーとして、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ Ｍ ＫＣｌを含むｐＨ ８．０の緩衝液（オートクレーブしたもの）を用いた。このバッファーは、イネ葉からＰＣＲなどに用いるための純度の低いＤＮＡを簡易抽出するためのバッファーとして使用しているものであるが、ＲＮＡ抽出に利用された例はない。これに、ＲＮＡ分解酵素の働きを抑制するため、１％β−メルカプトエタノールを加えて用いた。
用意したバッファー０．５ ｍｌ（２ ｍｌチューブ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に精米８粒と５ ｍｍ径のジルコニアボール（井内盛栄堂）１粒を加え、しばらく吸水させたのち、粉砕装置ミキサーミルＭＭ３００（Ｒｅｔｃｈｅ社製）に４０秒間かけて粉砕したところ、精米は粉状に粉砕され、バッファーはミルク状に白濁した。糊状になるようなことはなく、また界面活性剤を添加していないため、泡の発生も見られなかった。これに０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加えて混合した。これを微量高速冷却遠心機にかけ（１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解した。２６０ ｎｍと２８０ ｎｍの吸光度を測定したところ、約３２０μｇの高純度のトータルＲＮＡが抽出されていた （２６０／２８０＝１．９０〜２．００）。得られたＲＮＡは、ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ｃＤＮＡライブラリ作成に問題なく使うことができた（後述）。
次に、１％β−メルカプトエタノールが必須かどうかを確認するため、１％β−メルカプトエタノールを含まない同じバッファーを用いて同様の実験を行ったところ、収率にはあまり変わりがなかった。よって、ＲＮＡ分解酵素の混入に十分配慮した環境で抽出を行う限りにおいては、β−メルカプトエタノールは必須ではないことがわかった。
【００４２】
［実施例２］
＜塩の種類についての検討＞
次に、核酸溶出用バッファーに用いる無機塩類の種類によるＲＮＡ抽出効率の違いを調べた。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＭｇＣｌ２（濃度はそれぞれ １ Ｍ）、なし（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭＥＤＴＡのみ）、および滅菌水のみ、の６種類のバッファーを作成し、同様に精米からのＲＮＡ抽出を行った。その結果、精米８粒から得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡの量は、以下の表のとおりになった。
【００４３】
【表１】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。最も多量のＲＮＡが得られたのはＫＣｌであり、滅菌水、ＴＥのみの場合の１０倍以上のＲＮＡ抽出効率があることがわかった。また、ＭｇＣｌ２は最も効率が悪かった。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌはＫＣｌよりは低いものの、ＲＮＡ抽出効率を上げる効果が確認できた。
以上の結果より、核酸溶出に用いるバッファーに用いる無機塩として、ＫＣｌの他、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌも有効であることが確認された。
【００４５】
［実施例３］
＜イネの他の組織からのＲＮＡ抽出＞
イネは成長・出穂・登熟の過程で、葉で合成した澱粉を貯蔵する場所を変えていくことが知られており、栄養成長過程、出穂時期には葉鞘に大量の澱粉を蓄積し、受精・登熟期には蓄積した澱粉を糖に変えて子房に転流しふたたび澱粉として蓄積する。従って、出穂期の葉鞘および受精後の子房は澱粉含量が高く、従来のＲＮＡ抽出法では十分な量・純度のＲＮＡを得ることが難しかった。そこで、本発明の方法を用いて抽出を行った。
【００４６】
子房：受精後１日〜５日の子房の混合物４０ ｍｇを出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、３ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて粉砕・混合し、以下実施例１と同様に抽出作業を行った。その結果、約３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
葉鞘：出穂期のイネ植物体のとめ葉、およびとめ葉から２番目の葉の葉鞘４００ ｍｇを出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、３ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、約３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
以上の結果より、澱粉が多量に蓄積されているイネの精米以外の組織からのＲＮＡ抽出にも、本発明の方法が有効に用いられることが確認された。
【００４７】
［実施例４］
＜他の植物種の種子からのＲＮＡ抽出＞
他の植物種の澱粉の多い組織からも本発明の方法によりＲＮＡが抽出できるかどうかを調べた。材料として、ダイズ種子、エンドウ種子、ヒマワリ種子を用いた。
【００４８】
ダイズ種子：乾燥種子１粒をアルミホイルに包み、ペンチで軽くつぶした後の半粒分を１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、種子１粒あたり約５００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
エンドウ種子：乾燥種子１粒をアルミホイルに包み、ペンチで軽くつぶしたものを１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。その結果、１粒あたり２３０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
ヒマワリ種子：乾燥種子２粒を１試験分の出発材料とし、２ ｍｌチューブ内で０．５ ｍｌの核酸溶出用バッファー、５ ｍｍ径ジルコニアボールを用いて４０秒間粉砕・混合し、以下同様に抽出作業を行った。ヒマワリの場合には、水に不溶の白濁物の混入が見られたため、最後に遠心分離を追加し、上澄みをＲＮＡ溶液として回収した。その結果、１粒あたり５０〜６０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
【００４９】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。
この結果を以下の表にまとめる。
【表２】
【００５０】
［実施例５］
＜フェノール、クロロホルムが必要かどうかの検討＞
本発明の方法によるＲＮＡ抽出において用いられる有機溶媒として、フェノールとクロロホルムの両者が必要かどうかを調べた。精米８粒を出発材料とし、１ Ｍ ＫＣｌ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む核酸溶出バッファー０．５ ｍｌ、５ ｍｍ径ジルコニアボール、を含む２ ｍｌチューブ内でＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４０秒間粉砕した。その後、実施例１と同様に０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加えて混合した。これを微量高速冷却遠心機にかけ （１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。また、０．３ ｍｌ 酸性（水飽和）フェノール、０．１４ ｍｌ クロロホルム、０．０４ ｍｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．４）を加える代わりに、
（ア） ３００μｌ酸性フェノール、４０μｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて混合し、以下同様にＲＮＡを回収した。
（イ） ３００μｌクロロホルム、４０μｌ ３Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて混合し、以下同様にＲＮＡを回収した。
の２通りの方法を試みた。
【００５１】
その結果、フェノールのみ、クロロホルムのみ、のいずれの場合にも、若干効率は落ちるもののある程度のＲＮＡが得られることがわかった。結果を以下の表にまとめる。
【００５２】
【表３】
電気泳動により確認したところ、いずれも確かにＲＮＡが得られていることが確認され、ＤＮＡの混入はほとんど見られなかった。
これにより、本発明の方法で用いる、タンパク質、ＤＮＡ等夾雑物質を取り除くための有機溶媒としては、フェノール、クロロホルムの両方用いた場合が最も効率がよいが、どちらか一方のみでもかなりの程度ＲＮＡを抽出できることが確認された。
【００５４】
［実施例６］
＜試料と水溶液との混合（工程（ａ１））、および水溶液と有機溶媒との混合と（工程（ａ２））を同時に行えるかどうかの検討＞
多検体処理、機械化を考えた場合、工程の数はできるだけ少ない方が好ましい。このため試料の粉砕および核酸溶出バッファーへの混合（工程（ａ１））と、有機溶媒による夾雑物質の除去（工程（ａ２））とを、同時に行う方法を検討した。精米８粒を出発材料とし、１ Ｍ ＫＣｌ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む核酸溶出バッファー０．５ ｍｌ、５ ｍｍ径ジルコニアボール、３００μｌ 酸性フェノール、１４０μｌ クロロホルム、４０μｌ ３Ｍ酢酸ナトリウムを含む２ ｍｌチューブ内でＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４０秒間粉砕した。これを微量高速冷却遠心機にかけ（１００００ ｒｐｍ×１０分）、水層を別の２ｍｌチューブに移し、３／４量のイソプロパノールを加えて混合し、再度遠心（１００００ ｒｐｍ×２０分）した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、軽く乾燥してから６０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【００５５】
その結果、工程（ａ１）、工程（ａ２）を順に行う場合に比べて遜色ない程度のＲＮＡを得ることができ、工程（ａ１）と工程（ａ２）を同時に行っても、十分な量と純度のＲＮＡを得られることが確認できた（データ省略）。工程（ａ１）と工程（ａ２）を同時に行うことにより、別々に行なった場合、工程（ａ２）において必要な、「チューブのふたを開け、試薬を加え、ふたを閉め、混合する」というような手間を省くことができる。このことは、特に多検体処理または機械化を考える際に重要である。
【００５６】
［実施例７］
＜精米から抽出したＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリの作成＞
本発明の方法で抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリの作成を行った。
材料として、精米「魚沼産コシヒカリ」（Ａ， Ｂ， Ｃ）「茨城産コシヒカリ」（Ｄ， Ｅ， Ｆ）の６種類を用い、本発明の方法により、１ ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをそれぞれの材料より得た。
得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて精製を行い、それぞれの材料由来のｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡから、以下の配列を持つプライマーの混合物の存在下で逆転写反応を行い、３’末端側のｐｏｌｙＡが約１１ ｂｐに短縮されたｃＤＮＡを得た。使用したプライマーの配列は、５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ａ−３’ （配列番号：１）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｇ−３’ （配列番号：２）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＡ−３’ （配列番号：３）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＧ−３’ （配列番号：４）， ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＣ−３’ （配列番号：５） 及び ５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴ−３’ （配列番号：６） である。
【００５７】
作成したｃＤＮＡは、制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造）で消化した後、ＮｏｔＩ（宝酒造）及びＢａｍＨＩ（宝酒造）で二重消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ） を用いてライゲーションした。これを、制限酵素ＭｂｏＩ （宝酒造） で消化し、再度Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ） を用いてセルフライゲーションした。これをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ （ＴＯＹＯＢＯ） に形質転換し、青白セレクションを行い、得られた白コロニーをｃＤＮＡライブラリのクローンとした。作成した６種のｃＤＮＡライブラリより各１１００クローンのｃＤＮＡのインサートをもつ白コロニークローンを収集し、アンピシリン（Ａｍｐ）入りＬＢ培地 １００μｌ を入れた９６穴 ｍｉｃｒｏ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ で培養及び保管した。以上の操作により、３’末端のｐｏｌｙＡが１１塩基に短縮され、３’末端側の特異的配列を持つｃＤＮＡライブラリを作成した。
【００５８】
続いて収集した全てのクローンの塩基配列を、ＭａｇａＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍｎａｍｉｃｓ） を用いて塩基配列決定を行った。
シーケンス反応は、まず、９６穴ｍｉｃｒｏ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅで培養した培養液１μｌを鋳型とし、２０μｌスケールでＭ４ （５’−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣ−３’） （配列番号：７）、ＲＶ （５’−ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３’） （配列番号：８） をプライマーとして挿入された塩基配列をＰＣＲ法により増幅し、この反応液からＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ （ＵＳＢ） を用いて未反応のプライマーとｄＮＴＰを取り除いて、シークエンス反応の鋳型を作成した。この鋳型に対して、Ｍ４をプライマーとして、ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＭｅｇａＢＡＣＥ （Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ） を用いてシークエンスサイクル反応を行い、シークエンス用サンプルを作成した。
【００５９】
得られたシーケンスデータは、植物ゲノムセンターのデータサーバに転送し、遺伝子発現プロファイリングシステムにより、それぞれのクローンの配列情報の精製・グルーピング・相同性検索を行い、ライブラリ間の各シークエンスグループの発現頻度比較を行った。その結果の詳細は省略するが、得られたシーケンスを確認したところ９０％以上がポリＡテイルを有しており、高品質のｃＤＮＡ ３’末端ライブラリを作成することが可能であることが確認された。
【００６０】
［実施例８］
＜ＡＴＡ共存下でのＲＮＡ抽出＞
次に、核酸溶出用バッファーにａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＴＡ）を２ ｍＭの濃度で添加したＡＴＡ添加核酸溶出用バッファーを用いて、＜精米からのＲＮＡ抽出＞と同様の手順で、精米からのＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡ溶液は、ＡＴＡの存在のために赤色を有しており、吸光光度計による測定では正確な濃度が判定できない。このため、アガロースゲル電気泳動により得られたＲＮＡの量と純度を確認した。その結果、ＡＴＡを添加しない場合に比べ若干効率が落ちてはいるものの、十分な量と純度のｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られていることが確認された。
ＡＴＡは核酸と挙動をともにし、核酸分解酵素等のタンパク質のＲＮＡへの結合を強力に阻害する。このため、この方法で得られたＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ等には使えない。しかし、ＲＮａｓｅを十分に排除できない条件下でのハイブリダイゼーション実験（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）等に用いることができる。
【００６１】
［実施例９］
＜多検体処理および機械化の検討＞
本発明のＲＮＡ抽出法は、ステップ数が少なく簡便であるために、多検体処理および機械化に適すると考えられる。
１．２ ｍｌ容９６コレクションチューブラック（ＱＩＡＧＥＮ）に、１チューブあたり精米４粒、１ Ｍ ＫＣｌを含む核酸溶出バッファー ２５０μｌ、酸性フェノール １５０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム ２０μｌを混合した溶液（以下、混合抽出バッファーと称する）４２０μｌ、クロロホルム ７０μｌ、３ミリ径ジルコニアボール１個を加えてキャップをし、ＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３００を用いて４分間、２回粉砕した。ラックを遠心機（日立工機、ＨＩＭＡＣ−ＣＲ２０Ｇ、ローターとしてＲ３Ｓ）を用いて、３０００ ｒｐｍ、２０分間遠心した。ラックを静かにとりだし、キャップをあけ、８連あるいは１２連ピペッターを用いて上清約１００μｌを取り、市販のＰＣＲ用９６ウェルプレート（日本ジェネティクス）に移した。そこに、１００μｌイソプロパノ−ルを８連または１２連ピペッターを用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に混合した。プレートをサランラップで軽く包み、−２０℃のフリーザー中で２０分間冷却した。その後、遠心機（日立工機、ＨＩＭＡＣ−ＣＲ２０Ｇ、ローターとしてＲ３Ｓ）を用いて３０００ ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。プレートをペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去後、２００μｌの７０％エタノールを８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、ただちに３０００ ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。再びプレートをペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去し、さらに新しいペーパータオル上に伏せたまま、遠心機にセットし、１００ ｒｐｍで１秒間遠心してエタノールを完全に除去した。１０μｌのジエチルピロカーボネート処理済の滅菌水を８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に溶解した。吸光度を測定したところ、精米４粒から平均２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られたことがわかった。
【００６２】
機械化の例として、日立工機のマイクロプレートロボットＡＰ−１を用いた自動抽出を試みた。使用するプログラムは、ＡＰ−１にあらかじめインストールされているゲノムＤＮＡ抽出用のプログラム（日立工機）をほぼそのまま使用した。
【００６３】
１．２ ｍｌ容９６コレクションチューブラック（ＱＩＡＧＥＮ）に試料として精米４粒と混合抽出バッファー４２０μｌ、クロロホルム７０μｌを加えて上記の方法で粉砕・混合し、キャップの裏についた液体を取り除く程度に軽く（１０００ ｒｐｍ、１０秒程度）遠心後、チューブのキャップを外してＡＰ−１にセットした。その後、ＡＰ−１はセットされたラックを遠心機内に移動し、遠心し、取り出し、９６サンプル同時に上清１００μｌを吸い上げ、あらかじめ１００μｌのイソプロパノールを分注しておいた９６ウェルＰＣＲプレートに移し、数回ピペッティングして完全に混合した。さらに混合したサンプルを遠心機に移動し、３０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心した。ＡＰ−１自体には冷却装置がないため、４℃での遠心時間を長くした。遠心後の上清除去は、ピペットによる吸出しで行った。さらに、ＡＰ−１は２００μｌの７０％エタノールを加え、再び遠心機に移動し、３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。遠心終了後、プレートを規定の位置に戻してＡＰ−１の動作は終了した。
【００６４】
プレートを取り出し、ペーパータオル上に逆さに１分間おいて上清を除去し、さらに新しいペーパータオル上に伏せたまま、遠心機にセットし、１００ｒｐｍで１秒間遠心してエタノールを完全に除去した。１０μｌのジエチルピロカーボネート処理済の滅菌水を８連または１２連ピペッタ−を用いて添加し、数回ピペッティングを行って完全に溶解した。吸光度を測定したところ、精米４粒から平均２０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られたことがわかった。９６×４＝３８４検体からのＲＮＡ抽出に必要な時間は約２時間であった。
以上の結果から、本発明のＲＮＡ抽出法を用いることにより、多検体からのＲＮＡ抽出を自動化できることが示された。
【００６５】
【発明の効果】
本発明により、簡便かつ迅速に生体試料などからＲＮＡを抽出／精製することが可能となった。本発明の方法は、澱粉を多量に含む生体試料からでも少ないステップでＲＮＡを精製することができる。また、多検体を同時に処理したり、機械化が容易な点でも優れている。得られたＲＮＡは、ｃＤＮＡライブラリの作製およびその他の用途に用いることができる。
【００６６】
【配列表】
Claims (8)
- ＲＮＡの単離方法であって、
（ａ）（ｉ）試料、（ｉｉ）塩類および緩衝剤を含む水溶液、および （ｉｉｉ）有機溶媒を、酸性条件下で混合する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の混合物から得られた水溶液およびアルコール類を混合してＲＮＡを不溶化する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で不溶化したＲＮＡを回収する工程、を含み、
工程（ａ）または工程（ａ）から工程（ｂ）の間において、該試料を以下の化合物のいずれとも接触させない方法。
（１）０．０５％（重量／容積； ｗ／ｖ）またはそれ以上の濃度のドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＴＡＢ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム （サルコシル）。
（２）０．１ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアン酸グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のチオシアンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のグアニジンイオン、０．５ Ｍまたはそれ以上の濃度のヨウ素イオン、あるいは１ Ｍまたはそれ以上の濃度の尿素。 - 酸性条件が、ｐＨ３から６である、請求項１に記載の方法。
- 緩衝剤が、Ｔｒｉｓ−Ｃｌである、請求項１に記載の方法。
- 塩類が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種類またはそれ以上の無機塩類である、請求項１に記載の方法。
- 有機溶媒が、フェノール、クロロホルム、またはそれらの両方である、請求項１に記載の方法。
- アルコール類が、イソプロパノール、エタノール、またはそれらの両方である、請求項１に記載の方法。
- 塩類および緩衝剤を含む水溶液、有機溶媒、およびアルコール類を含む、請求項１に記載の方法によりＲＮＡを単離するためのキット。
- 請求項１に記載のＲＮＡの単離方法を実行するＲＮＡ単離装置。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009011210A (ja) * | 2007-07-03 | 2009-01-22 | Keio Gijuku | Ｄｎａ抽出方法及びそのためのキット |
| JP2011152142A (ja) * | 2004-04-16 | 2011-08-11 | Piotr Chomczynski | 精製ｒｎａの単離試薬及び方法 |
| JP2012055308A (ja) * | 2010-08-09 | 2012-03-22 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012223098A (ja) * | 2011-04-15 | 2012-11-15 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235743A (ja) * | 2011-05-12 | 2012-12-06 | Sumitomo Osaka Cement Co Ltd | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235716A (ja) * | 2011-05-10 | 2012-12-06 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| WO2014142357A1 (ja) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | サントリーホールディングス株式会社 | 植物細胞壁の処理剤及び同処理剤を用いた物質デリバリー方法並びに物質デリバリーシステム |
| CN110964719A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-07 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法 |
| CN112522360A (zh) * | 2020-02-06 | 2021-03-19 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种组合物、采样装置、试剂盒及居家病毒检测方法 |
| CN114934041A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-23 | 北京金豪制药股份有限公司 | 一种核酸提取的试剂和方法 |
-
2003
- 2003-05-12 JP JP2003133633A patent/JP2004329176A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011152142A (ja) * | 2004-04-16 | 2011-08-11 | Piotr Chomczynski | 精製ｒｎａの単離試薬及び方法 |
| JP2009011210A (ja) * | 2007-07-03 | 2009-01-22 | Keio Gijuku | Ｄｎａ抽出方法及びそのためのキット |
| JP2012055308A (ja) * | 2010-08-09 | 2012-03-22 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012223098A (ja) * | 2011-04-15 | 2012-11-15 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235716A (ja) * | 2011-05-10 | 2012-12-06 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235743A (ja) * | 2011-05-12 | 2012-12-06 | Sumitomo Osaka Cement Co Ltd | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| WO2014142357A1 (ja) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | サントリーホールディングス株式会社 | 植物細胞壁の処理剤及び同処理剤を用いた物質デリバリー方法並びに物質デリバリーシステム |
| CN110964719A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-07 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法 |
| CN112522360A (zh) * | 2020-02-06 | 2021-03-19 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种组合物、采样装置、试剂盒及居家病毒检测方法 |
| CN114934041A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-23 | 北京金豪制药股份有限公司 | 一种核酸提取的试剂和方法 |
| CN114934041B (zh) * | 2022-04-27 | 2023-12-15 | 北京金豪制药股份有限公司 | 一种核酸提取的试剂和方法 |
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