JP2018520696A - 粗さのある表面による核酸の迅速な単離のための方法および試験キット - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、本発明の課題は、先行技術に記載される技術的解決策の欠点を取り除くことであった。
前記課題は、特許請求の範囲の特徴部によって解決された。請求項1によれば、遊離の核酸または溶解によって遊離された核酸を含有する水溶液を、該水溶液の極性を低下させる前にまたはその後に、粗さのある表面または構造化された表面を有する固相と接触させて、核酸を含有する水性試料から核酸を単離する方法であって、核酸を固相へと沈着させ、それとともに固相へと結合させ、引き続き、この水溶液から固相と一緒に取り出す方法が記載される。「水溶液の極性を低下させる前にまたはその後に」という概念は、その水溶液がまずは固相と接触され得、次いで水の極性が低下される可能性と同様に、まず最初に水の極性を低下させてから、固相との接触が行われる可能性も説明している。最初に挙げた方では、水の極性が、一般にアルコールの添加によって低下されたときにはじめて、核酸の固相への沈着が起こる。もう一方の別形では、接触したらすぐに、核酸の固相への沈着が起こる。水不溶性の有機溶剤が使用される場合に、固相上に核酸の沈着が起こるように、その混合物を動かさねばならない。好ましくは、それは、該混合物内で固相を動かすことによって行われる。
キャビティ1: 400μlのイソプロパノール
キャビティ2: 800μlの洗浄溶液LS(抽出キットから)
キャビティ3: 800μlの80%エタノール
キャビティ4: 800μlの80%エタノール
キャビティ5: 200μlの溶出バッファー(抽出キットから)。
実施例1. 市販の抽出用化学薬品を利用して、核酸が粗さのある表面へと結合することの実証
核酸が粗さのある表面に結合し、単離することができることの実証は、以下のように実施した。この場合に、抽出は自動化された形式で実行した。磁性粒子プロセッサ(KingFisher ml;Thermo Electron社)が使用された。該装置は、棒磁石が中に入るプラスチックコームを使用しており、前記棒磁石は、その後にウォークアウェイプロセスで、核酸の単離のために使用される磁性粒子を動かす。これらのプラスチックコームは、本発明による方法のためには、本来の目的から外れて使用されており、それは核酸の結合および引き続いての抽出に用いられるものである。そのプラスチック材料は、ポリプロピレンである。本発明によれば、プラスチックコームは、研磨装置によって粗面化された。同様に、未処理のプラスチックコームも使用した。試料としては、それぞれ約1×106個のNIH 3T3細胞を使用した。核酸の単離のために使用される抽出用化学薬品は、この場合に、部分的には、市販の抽出キットinnuPREP Blood DNA Kit/IPC16X(Analytik Jena AG社)から採用された。溶解バッファー(溶解溶液CBV)およびプロテイナーゼKによって、細胞を60℃で15分間にわたって溶解させた。溶解の間に、KingFisher mlの反応プラスチックを、以下の溶液で充填した:
キャビティ1: 400μlのイソプロパノール
キャビティ2: 800μlの洗浄溶液LS(抽出キットから)
キャビティ3: 800μlの80%エタノール
キャビティ4: 800μlの80%エタノール
キャビティ5: 200μlの溶出バッファー(抽出キットから)。
1. DNAラダー(1bラダー)
2. 未処理のプラスチックコーム
3. 未処理のプラスチックコーム
4. 粗面化されたプラスチックコーム1
5. 粗面化されたプラスチックコーム2
6. 粗面化されたプラスチックコーム3。
核酸が様々なプラスチック材料の粗さのある表面に結合し、単離することができることの実証は、以下のように実施した。この場合に、抽出は自動化された形式で実行した。磁性粒子プロセッサKingFisher mlが再び使用された。それらのプラスチックコームは、本発明による方法のためには、ここでも本来の目的から外れて使用された。核酸の結合のための材料としては、実施例1と同様に粗面化されたプラスチックコームを使用した。コントロールとして、未処理のコームを使用した。それ以外の材料の試験のために、3Dプリンタによって様々な材料でできたプラスチックリングを製造し、それらのリングを次いでKingFisher ml機器のコームに嵌めた。これらのリングも、またもや研磨装置で粗面化した。前記の様々な材料は、KingFisher mlのプラスチック(ポリプロピレン)の粗面化されたコームであり、さらに、材料Biofila Linen(TwoBEars社)、つまりリグニンおよび芳香族アルコールでできた錯体ポリマーからなる複合材料、材料アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン(ABS)、ポリ乳酸(PLA)でできた材料、材料ポリカーボネート(PC)ならびに材料ポリスチレン(PS)である。この場合に、KingFisher mlのコームには、異なる粗面化がなされた(A型:コームの約3cm、B型:コームの約1cm;C型:コームの先端だけ)。試料としては、それぞれ約1×106個のNIH 3T3細胞を使用した。核酸の単離のために使用される抽出用化学薬品は、ここでも、部分的には、市販の抽出キットinnuPREP Blood DANN Kit/IPC16(Analytik Jena AG社)から採用された。溶解バッファー(溶解溶液CBV)およびプロテイナーゼKを使用して、細胞を60℃で15分間にわたって溶解させた。溶解の間に、KingFisher mlの反応プラスチックを、以下の溶液で充填した:
キャビティ1: 400μlのイソプロパノール
キャビティ2: 800μlの洗浄溶液LS(抽出キットから)
キャビティ3: 800μlの80%エタノール
キャビティ4: 800μlの80%エタノール
キャビティ5: 200μlの溶出バッファー(抽出キットから)。
1. DNAラダー(1bラダー)
2. 未処理のプラスチックコーム
3. 粗面化されたプラスチックコームA型
4. 粗面化されたプラスチックコームB型
5. 粗面化されたプラスチックコームC型
6. BioFila製の粗面化されたリングを備えるプラスチックコーム
7. ABS製の粗面化されたリングを備えるプラスチックコーム
8. PLA製の粗面化されたリングを備えるプラスチックコーム
9. PC製の粗面化されたリングを備えるプラスチックコーム
10. PS製の粗面化されたリングを備えるプラスチックコーム。
この実施例により、核酸の単離のための古典的なキットと、本発明による方法との間の比較が行われるべきである。比較キットとして、Qiagen社のキットDNeasy Blood&Tissue Kitを使用した。このキットは、細胞を溶解させ、核酸をシリカ膜を有するスピンフィルタカラムの表面上に結合させ、引き続き結合された核酸を洗浄し、そして最後に核酸をシリカ膜から溶出させることを基礎としている。このキットは、核酸の抽出のための標準的なキットであり、世界的にそのために使用される。手元のマニュアルに従って作業した。
1. DNAラダー(1bラダー)
2. Qiagenキット(約1×106個の細胞)
3. Qiagenキット(約2×106個の細胞)
4. 本発明による方法;粗面化されたプラスチックコーム(約1×106個の細胞)
5. 本発明による方法;粗面化されたプラスチックコーム(約2×106個の細胞)
6. 本発明による方法;粗面化されたPLA製のリングを備えるプラスチックコーム(約1×106個の細胞)
7. 本発明による方法;粗面化されたPLA製のリングを備えるプラスチックコーム(約2×106個の細胞)。
この実施例で、本発明による方法によって血液試料からもDNAを単離することができ、この場合に収量が極めて高いことが示される。3mlの全血試料を使用した。赤血球の溶解後に、有核細胞をペレット化し、再び、市販のキットinnuPREP Blood DNA Kit/IPC16(Analytik Jena AG社)からの溶解バッファー(溶解バッファーCBV)を添加後に、プロテイナーゼKを添加して60℃で30分間にわたって溶解させた。300μlの溶出バッファー中で溶出させた。
この実施例で、本発明による方法によって、核酸を、改変されたピペットチップを用いて極めて簡単かつ迅速に単離できることが示される。
再び、磁性粒子プロセッサKingFisher mlを使用した。核酸の結合のための材料としては、KingFisher mlのプラスチックのコームに嵌められた、研磨装置で粗面化されたBioFila材料製のリングを用いた。試料としては、それぞれ約1×106個のNIH 3T3細胞を使用した。細胞の溶解は、3種の異なるバッファーで実施した:
1. カオトロピック塩を含有するバッファーA:尿素、SDS、Tris塩酸、EDTA
2. 塩を含有しないバッファーB:SDS、Tris塩酸、EDTA
3. 非カオトロピック塩を含有するバッファーC:塩化ナトリウム、CTAB、Tris塩酸、EDTA。
キャビティ1: 400μlのイソプロパノールまたは無水エタノールもしくはアセトン
キャビティ2: 800μlの洗浄溶液LS(抽出キットinnuPREP Blood DNA Kit/IPC16から)
キャビティ3: 800μlの80%エタノール
キャビティ4: 800μlの80%エタノール
キャビティ5: 200μlの溶出バッファー(抽出キットinnuPREP Blood DNA Kit/IPC16から)。
1. DNAラダー(1bラダー)
2. 溶解バッファーA+イソプロパノール
3. 溶解バッファーA+無水エタノール
4. 溶解バッファーA+アセトン
5. 溶解バッファーB+イソプロパノール
6. 溶解バッファーB+無水エタノール
7. 溶解バッファーB+アセトン
8. 溶解バッファーC+イソプロパノール
9. 溶解バッファーC+無水エタノール
10. 溶解バッファーC+アセトン。
血液から単離されたゲノムDNAを含有する水溶液を調製した。300μlのこのDNA溶液に、30μlの3モラーの酢酸ナトリウム溶液および300μlのイソプロパノールを加えた。既に単離された核酸も粗さのある表面に結合し、単離することができることの実証は、以下のように実施した。この場合に、抽出は自動化された形式で実行した。本発明による方法のために、ここでもKingFisher mlを使用した。粗さのある表面として、コームに嵌められた、BioFila材料製のリングを使用した。このリングは、3Dプリント技術によって製造され、表面上に溝構造を有していた。
キャビティ1: DNA溶液/酢酸ナトリウム/イソプロパノール
キャビティ2: 800μlの80%エタノール
キャビティ3: 空
キャビティ4: 空
キャビティ5: 150μlの水。
1. DNAラダー(1bラダー)
2. 空
3. 未処理のプラスチックコーム
4. 未処理のプラスチックコーム
5. BioFila製の粗面化されたリングを備えた、溝構造を有するプラスチックコーム
6. BioFila製の粗面化されたリングを備えた、溝構造を有するプラスチックコーム。
Claims (15)
- 核酸を含有する水性試料から核酸を単離するための方法であって、遊離の核酸または溶解によって遊離された核酸を含有する水溶液を、該水溶液の極性を低下させる前にまたはその後に、粗さのある表面または構造化された表面を有する固相と接触させることで、核酸を固相へと沈着させ、引き続きこの水溶液から固相と一緒に取り出すことを特徴とする方法。
- 前記核酸は、固相へと同時に結合される短鎖および長鎖の核酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記水溶液の極性を低下させるために、有機溶剤、好ましくはアルコールが使用されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記有機溶剤は、5容量%から90容量%の間の濃度で、好ましくは30容量%から75容量%の間の濃度で使用されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記水溶液は、
a)塩、および/または
b)少なくとも1種の界面活性剤、および/または
c)アミノアルコールまたはpH値の調整のための物質、例えばTRIS
をさらに取り扱うことを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。 - a)前記塩が、1mMから5Mの間の濃度で、好ましくは5mMから2Mの間の濃度で存在すること、
b)前記界面活性剤が、0.1容量%から30容量%の間の濃度で、好ましくは1%から10%の間の濃度で存在すること、
c)TRISが、1mMから2Mの間の濃度で、有利には10mMから1Mの間の濃度で存在すること
を特徴とする、請求項4に記載の方法。 - さらなる添加剤、好ましくはプロテイナーゼが含まれていることを特徴とする、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 粗さのある表面または構造化された表面は、平滑でない金属表面、プラスチック表面もしくはゴム表面であるか、または磁性粒子であることを特徴とする、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- 平滑でないプラスチック表面は、3Dプリントによるか、またはプラスチックの粗面化によって作製されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 粗さのある複合材料が固相として使用されることを特徴とする、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- 固相として、粗面化されたピペットチップが使用されることを特徴とする、請求項1から10までのいずれか1項に記載の方法。
- ネジのねじ山、金属スポンジまたは粒状物、穿孔材料または二次元もしくは三次元の網目構造が、構造化された表面を有する固相として働くことを特徴とする、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記固相は、水溶液内で動かすことができることを特徴とする、請求項1から12までのいずれか1項に記載の方法。
- 水溶液の極性を低下させるための少なくとも1種の物質と、粗さのある表面または構造化された表面を有する核酸の結合のための少なくとも1種の固相と、溶出バッファーとを含む、核酸を含有する水性試料から核酸を単離するための試験キット。
- 粗さのある表面または構造化された表面を有する材料の、核酸を含有する試料からの核酸の単離のための使用。
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