CN117377760A - 用于直接从全血样品中快速分离核酸的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的主题是采用通常用于借助于磁性或顺磁性颗粒从生物样品中、尤其直接从全血样品中自动纯化核酸的可商购的这一代设备但是在没有这些磁性或顺磁性颗粒的情况下取而代之用粗糙化的塑料材料来纯化核酸。在此关键的是，用包含至少一种锂盐的清洗缓冲液来处理结合到粗糙材料上的核酸。
Description
本发明的主题是采用通常用于借助于磁性或顺磁性颗粒从生物样品中、尤其直接从全血样品中自动纯化核酸的可商购的这一代设备在没有这些磁性或顺磁性颗粒的情况下纯化核酸。
此类设备示例性地为赛默飞世尔(Thermofischer)公司的所谓的KingFisherFlex磁性颗粒处理机(https://www.thermofisher.com/de/de/home/lifescience/ bioproduction/contaminant-and-impurity-testing/sample-prep-andautomation/ kingfisher-flex-magnetic-particle-processor.html)。其他供应商还提供了按照同一原理工作的类似设备。所有这些设备都按照以下原理工作：
这些设备使用塑料梳，磁体小棒进入其中，然后在走开过程(walk-away-Prozess)中磁体颗粒发生移动并且浸入标准提取所需的缓冲液中。从血样中提取核酸以样品的细胞溶解开始，样品与细胞溶解缓冲液以及任选地蛋白分解酶一起例如处于96孔深孔板的空腔中。
在完成细胞溶解之后，一般将细胞溶解液与结合缓冲液或醇以及磁性或顺磁性颗粒混合(在某些供应商处，待处理的血样还可能在细胞溶解期间就已经包含结合缓冲液和磁性或顺磁性颗粒。于是在细胞溶解之后就无需再加入它们。在所有这些方法中对于提取而言关键的是使用磁性或顺磁性颗粒，因为在其释放之后核酸被结合到这些颗粒上。所谓的塑料梳然后根据预定的编程方式移动到其他的空腔中，在这些空腔中存在进行提取所需的反应物。于是，通过从空腔到空腔的前进式移动，带有经结合的核酸的颗粒也发生移动。这是以如下方式进行的：磁体小棒进入到塑料梳中，然后使得颗粒可以在外部聚集到塑料梳上并且可以从一个空腔运输到另一个空腔。借助于这种简单的自动化方法，根据经典的细胞溶解-结合-清洗-干燥-洗脱原理来进行核酸的提取。对于本领域技术人员而言，这个原理是长久以来已知的。这类提取设备以及工作原理都是长久以来已知的并且在全世界广泛使用。但是一般而言不利的是，使用磁性或顺磁性颗粒通常导致在待分离的核酸纯度方面的困难。尤其是在处理全血样品时。清洗经结合的核酸通常是困难的。另外，使用这些颗粒通常还导致核酸洗出液的变色。另一个严重的缺点在于，在每一个处理步骤之后都必须借助于磁体来收集进入到梳中的颗粒。这些步骤需要时间并且在不完全收集的情况下导致核酸的损失。
在公开文件WO 2016/169677 A1中显示，借助于通过磁性颗粒分离核酸的核酸自动提取机(KingFisher ml，热电公司(Thermo Electron))还可以在没有磁体颗粒的情况下分离核酸。这种设备属于上述自动提取机的组别并且允许并行地从最多15个样品中提取核酸。这篇文件公开了，仅仅对塑料梳的机械粗糙化就足以使核酸结合到粗糙表面上。这篇文件详述了用于分离核酸的若干初始材料。还描述了从血液中分离核酸。然而，并不是将血样直接用于提取。仅描述了从含核的血液细胞中分离DNA，这些血液细胞必须借助于准备步骤才能获得。此类方法的缺点是要执行溶解红细胞和将含核的细胞造粒的方法步骤。这些步骤的自动化要求离心。已知的是，在用于分离核酸的自动化过程中在技术上实现离心是高耗费且昂贵的。在没有这些附加的预处理步骤的情况下使用全血样品导致所分离的DNA的品质极差并且在DNA从粗糙化的塑料梳上解除附着之后洗出液明显可见地变色。
在借助于磁性颗粒从血样中提取核酸时也常常观察到这种变色的洗出液。对于本领域技术人员而言，这是已知的。用作清洗缓冲液的溶液不足够高效，而无法产生干净的核酸洗出液。当希望借助于结合到粗糙表面上来分离核酸时就更是如此。因此需要首先将含核的血液细胞分离。由此，从血液中提取核酸的过程不是完全自动化的过程并且需要高耗费的手动准备步骤。为了让提取核酸的过程完全自动化运行，文件WO 2018/167138采用了另一种解决方案。该公开文件的主题是一种新型的且大幅度简化的方法和装置，该方法或装置允许从样品中富集细胞以及从样品中去除生物细胞，然后释放并分离细胞中包含的核酸，其方式使得用于富集细胞的介质还可以用于分离核酸。这意味着，可以直接用全血样品开始提取过程。将含核的细胞结合到其中使用的粗糙表面上，随后溶解细胞，释放核酸并随后将核酸再次结合到粗糙材料上、清洗并最终洗出核酸。由此将该过程完全自动化并且提供高品质的核酸。但是这个过程持续时间非常久，因为需要许多的工作步骤。
使用氯化锂来沉淀RNA是已知的(https://www.thermofisher.com/de/de/home/ references/ambion-tech-support/rnaisolation/general-articles/the-use-of-licl- precipitation-for-rna-purification.html)。例如欧洲专利文件EP 3 277 809 B1描述了借助于浓度为0.05至1M的氯化锂来溶解细胞。使用锂盐作为清洗缓冲液的组分以纯化经分离的核酸是迄今为止未知的。
发明目的
因此，本发明的基本目的在于克服现有技术部分中描述的技术解决方案的缺点。
发明内容
已经根据本专利权利要求所述的特征实现了这个目的。
根据本发明提供了一种用于借助于所展示的用于磁体颗粒的这一代自动提取机——优选直接从全血样品中——分离核酸的方法，所述方法在执行方面明显比已知的方法更简单快速并且所述方法允许以高品质分离非常高产率的核酸并且不需要磁体颗粒。另一个重要的优点是，磁性和顺磁性颗粒通常非常昂贵，这显著影响了每次提取的价格。
本发明的基础是文件WO 2016/169677 A1，该文件描述了借助于粗糙表面分离核酸。由于术语“粗糙度”没有确切定义，所以在本发明的意义上粗糙表面是指可以通过查看或触摸来了解其粗糙度的表面。可设想的是，制造粗糙表面是较简单的，至少在塑料的情况下是较简单的。为此只需要用砂纸、研磨设备、锉或通过刮擦来处理原本光滑的表面。
与WO 2016/169677 A1或WO 2018/167138不同，本发明可以实现直接从全血样品中分离核酸并且不需要准备步骤或高耗费的运行方案。还省去了将血液细胞预先结合到粗糙表面(如WO 2018/167138中描述的)。本发明具有通用性并且可以与根据本领域技术人员已知的“KingFisher”设备平台(热电公司和根据相同原理工作的设备的全世界其他供应商)的走开原理工作的所有提取设备一起执行。用于以磁体颗粒进行工作的所有这些设备可以用于在没有磁性颗粒的情况下提取核酸。由此可以以价格明显更低的方式执行提取，因为已知的磁性或顺磁性颗粒是昂贵的。对于本发明的方法而言，只需要对通常预期用于收集磁体颗粒的塑料梳进行机械粗糙化或刮削。另外，使用本领域技术人员已知的细胞溶解缓冲液和结合缓冲液以及蛋白水解酶。但是出人意料地显示出，当不使用已知的常用的清洗缓冲液组合物时，获得了干净的核酸洗出液和较高的核酸产率。这些已知的组合物由醇组分和优选离液盐或Tris共混物或EDTA共混物组成。已经显示出，这些清洗缓冲液不适合于借助于粗糙表面或磁体颗粒直接从全血样品中分离核酸。当使用已知的清洗缓冲液组合物时观察到了两种现象。要么洗出液是干净的，则核酸产率非常低，要么洗出液变色，则虽然洗出液中包含有足够多的核酸但品质非常差。根据本发明，在理想情况下包含锂盐(优选大于0.1M的高浓度氯化锂)和Tris以及高浓度乙醇(优选大于50％)的清洗缓冲液完成了高效地清洗结合到粗糙塑料梳上的核酸的任务。将这种清洗缓冲液用作运行方案中的首次清洗缓冲液。然后，其他必需的清洗缓冲液是具有低盐浓度的醇类清洗缓冲液以及Tris或纯(优选80％的)乙醇的共混物。关键是使用本发明的首次清洗缓冲液。由此可以实现直接从全血样品中以高品质和高产率分离核酸并且这可以借助于详述的设备系统(通常用磁体颗粒工作)来实现。核酸的结合仅仅在这些设备必需的、已经为此机械粗糙化的塑料梳上进行。由此可以以简单、快速且价格低廉且全自动的方式从全血样品中分离核酸。当然可以在每个清洗步骤中而且还可以在从不同于血液细胞的其他细胞进行分离时使用锂清洗缓冲液，但不是必须的，而是仅在从来自全血的血液细胞分离时。在使用磁体颗粒时的相对较差的比率A260:A230(见表1)表明，即使在该方法中使用锂清洗缓冲液可能也是有意义的。
本发明的方法包括以下步骤：
■溶解所述细胞并且使所述核酸从所述细胞中结合到固定相上
■借助于包含锂盐的缓冲液来首次清洗结合到所述固定相上的核酸
■用所述清洗缓冲液或者用本身已知的清洗缓冲液进行反复清洗
■用已知的试剂洗出经纯化的核酸。
锂盐的优选浓度范围为0.1至0.5M，特别优选浓度为0.3M。高于0.5M的浓度没有可测量的效果，而是仅增加了另外的清洗步骤。
根据本发明的系统包括：
■本身已知的用于溶解生物细胞的缓冲液
■本身已知的用于将核酸从经溶解的细胞中结合到固定相上的缓冲液
■包含至少一种锂盐的清洗缓冲液
■其他本身已知的清洗缓冲液
■用于洗出经清洗的核酸的试剂
■至少一个固定相，所述固定相优选由具有粗糙表面的塑料组成，其中这个粗糙表面浸入到所述缓冲液中。
可以使用任何类型的聚合物作为塑料，还包括以3D打印方法生产的。在后者的情况下，虽然省去了粗糙化(因为逐层制备的方式已经产生了所需的粗糙度)，但目前是不经济的。
本发明的主题还有一种通过借助于磁体分离来进行核酸的自动化分离和纯化的设备进行的自动化方法。通过以简单地将塑料梳表面粗糙化的方式省去磁体微粒，所述自动化方法明显变得更简单。
下面应借助于一个实施例详细阐释本发明。这个实施例在此不形成对本发明的限制。
实施例
借助于本发明的装置以及采用用于借助于磁体颗粒从全血中分离DNA的经典套装
从4个不同的全血样品中分离DNA
用KingFisher Flex磁体颗粒处理机(热电公司)设备进行提取。为此以并非预定的方式使用塑料梳(在标准方法中磁体小棒进入到其中)并将其用于结合核酸以及后续提取核酸。根据本发明，借助于研磨设备将塑料梳粗糙化。用于首次清洗步骤的清洗缓冲液为本发明的清洗缓冲液(50mM Tris HCl；pH 7.5，0.3M氯化锂，80％乙醇)。用所需的缓冲液如下加载深孔板：
板1(细胞溶解/结合)：200μl全血，300μl细胞溶解缓冲液CLS和20μl蛋白酶K
板2(清洗1)：50mM Tris HCl；pH 7.5，0.3M氯化锂，80％乙醇)板3(清洗2)：20mMTris HCl；pH 7.5，10mM NaCl，80％乙醇)
板4(清洗3)：80％乙醇
板5(清洗4)：80％乙醇
板6(洗出)：10mM Tris HCl；pH 8.5
开始自动化提取。首先在KingFisher Flex上进行样品的细胞溶解。在细胞溶解之后向第一板中加入结合优化剂(耶拿分析仪器股份公司，Analytik Jena AG)以及400μl的异丙醇。
然后继续进行自动化提取。在约45分钟之后完成整个提取过程。
根据手册用磁体颗粒进行提取方法。使用了耶拿分析仪器公司的套件(innuPREPBlood DNA-Kit KFFLX)。没有处理用于此目的的塑料。提取过程需要约55分钟。
借助于分光光度测量来证实所分离的核酸。除了产率之外还测定了所分离的核酸的纯度。
表1：分光光度测量的结果：
如结果令人印象深刻地显示的，用本发明的装置和磁体颗粒处理机设备可以直接从全血样品中分离DNA。用其获得的产率与借助于磁性颗粒的经典提取方法的产率相当。但是令人印象深刻地显示出，在与本发明的装置一起使用磁体颗粒时，没有出现已知的较差的A260:A230比率。与经典方法相比，该比率明显更好。无洗出液变色。在经典方法中洗出液明显变色。利用本发明可以比用经典方法更快地进行提取。该方法复杂程度也明显更低，因为不再需要任何用于收集和运输磁体颗粒的步骤。最后由于以无磁体颗粒的方式进行，该方法成本更低廉。
Claims (10)
1.一种用于从生物细胞中分离核酸的方法，其中在所述细胞溶解之后将包含在所述细胞中的核酸结合到固定相上，其特征在于，用包含至少一种锂盐的清洗缓冲液来处理结合到所述固定相上的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锂盐的浓度介于0.1与0.5M之间、优选为0.3M。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于以下步骤：
a)溶解所述细胞并且使所述核酸从所述细胞中结合到固定相上
b)借助于包含锂盐的缓冲液来首次清洗结合到所述固定相上的核酸
c)用所述清洗缓冲液或者用本身已知的清洗缓冲液进行反复清洗
d)用已知的缓冲液洗出经纯化的核酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，将粗糙化的塑料材料用作固定相，其中通过触摸或通过查看所述表面能够辨别所述表面的粗糙度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗糙化的塑料材料为粗糙化的塑料梳，所述塑料梳能够在多种可商购的自动提取机中用于借助于磁性颗粒分离核酸并且其粗糙表面能够浸入到根据权利要求3所述的缓冲液中。
6.根据权利要求4或5所述的自动化方法，所述方法根据走开原理具有多个粗糙化的塑料梳。
7.一种用于从生物细胞中分离核酸的系统，其中在所述细胞溶解之后将包含在所述细胞中的核酸结合到固定相上，其中用清洗缓冲液来处理结合到所述固定相上的核酸，所述系统包括：
a)本身已知的用于溶解生物细胞的缓冲液
b)本身已知的用于将核酸从经溶解的细胞中结合到固定相上的缓冲液
c)包含至少一种锂盐的清洗缓冲液
d)其他本身已知的清洗缓冲液
e)用于洗出经清洗的核酸的缓冲液
f)至少一个固定相，所述固定相优选由具有粗糙表面的塑料组成，其中通过触摸或通过查看所述表面能够辨别所述表面的粗糙度并且所述粗糙表面能够浸入到所述缓冲液中。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法或者根据权利要求7所述的系统用于从生物细胞中分离和纯化核酸的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，用于从全血中分离和纯化核酸。
10.锂盐在用于纯化核酸的清洗缓冲液中的用途，所述核酸在溶解生物细胞之后已经结合到固定相上。
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