CN117625593A - 一种血液样本dna提取试剂盒和核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液样本DNA提取试剂盒和核酸提取方法。所述血液样本DNA提取试剂盒，包括：核酸处理液、核酸漂洗液和洗脱缓冲液；其中，所述核酸处理液包括裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，所述裂解液包括：胍类化合物、双(2‑羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙氧硬化醇、葡聚糖‑70、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮和水。本发明的血液样本DNA提取试剂盒经过精心设计和优化，展现出显著的优点，尤其是能够实现高纯度和高浓度的DNA提取。通过优化的裂解液配方和高度适配的设计，该试剂盒不仅提取效率出众，操作简便，并且具有较强的通用性和灵活性，可广泛适用于不同的实验条件和设备，满足多样化的实验需求，为后续的分子生物学研究提供了极具价值的支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液样本DNA提取试剂盒和核酸提取方法。
背景技术
DNA是遗传信息的基本单位，它储存了个体的遗传信息，包括基因序列和其他遗传变异，是分子生物学研究的主要对象，进行基因相关研究的前提是获得高质量的DNA，因此DNA提取是基础且关键的技术。临床诊断中最常用的样本是血液样本，通过提取血液DNA，可以获取个体的遗传信息，用于基因检测、疾病诊断和研究等领域。
目前的提取包括盐析法、吸附柱法、磁珠法等。现有的试剂盒基本使用吸附柱法、磁珠法，其中离心柱法提取纯度较好，但是该方法提取需要多次离心，不适合进行自动化操作，大量样本的提取耗时较长，而磁珠法提取DNA具有操作简单、高产率、纯度较高的优点。它适用于大规模DNA提取、高通量的自动化处理和临床诊断等领域。
血液DNA提取试剂主要用于从血液样本中提取DNA，广泛应用于基因组学研究、临床诊断等领域，该技术的主要包括以下几个方面：
裂解：裂解是血液DNA提取的关键步骤之一。该步骤利用裂解溶液将细胞膜和细胞核膜破坏，使DNA释放到溶液中。
蛋白酶处理：在血液DNA提取过程中，需要添加蛋白酶以消化细胞膜上的蛋白质，如核蛋白和膜蛋白。这一步骤有助于提高DNA的纯度和质量。
酒精沉淀：为了进一步纯化DNA，通常会使用酒精(如乙醇或异丙醇)来沉淀DNA。
洗涤：洗涤是为了去除沉淀物中的杂质和残留试剂。通常使用乙醇或异丙醇进行洗涤，以去除未溶解的盐和其他污染物。此外，还可以使用缓冲液进行一系列的洗涤步骤，以保证提取到的DNA的纯度和质量。
目前，血液DNA提取试剂盒已经发展成为一种高效、快速、方便且可靠的技术。不同厂家生产的试剂盒可能使用不同的原理和改良方法，但是提取的DNA质量仍有提升空间。
发明内容
本发明的血液样本DNA提取试剂盒和核酸提取方法，主要通过改进裂解液获得更高纯度和高浓度的的DNA，并且操作简单，适用于大规模样本处理。
为实现以上目的，本发明提供一种血液样本DNA提取试剂盒，包括：核酸处理液、核酸漂洗液和洗脱缓冲液；其中，所述核酸处理液包括裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，所述裂解液包括：胍类化合物、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙氧硬化醇、葡聚糖-70、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮和水。
作为一种优选，所述裂解液为：3-4M/L的胍类化合物、10-20mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、10-15wt％的乙氧硬化醇、0.1-0.3wt％的葡聚糖-70、1-3M/L的氯化钠、5-10wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
作为一种优选，所述胍类化合物为异硫氰酸胍、盐酸胍、氨基磺酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
作为一种优选，所述蛋白酶K溶液为：10-30mM/mL的Tris、0.005-0.02wt％的氯化钙、10-30mg/mL的蛋白酶K、40-60wt％的甘油和水。
作为一种优选，所述磁珠悬浮液为：1-2wt％羟基磁珠悬浮液。
作为一种优选，所述核酸漂洗液包括300-600体积单位第一漂洗液和700-1400体积单位第二漂洗液；
作为一种优选，所述第一漂洗液为：30-70mM/L的Tris、500-1000mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8；
作为一种优选，所述第二漂洗液为：30-70mM/L的Tris、50-150mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8。
作为一种优选，所述洗脱缓冲液为：5-15mM/L的Tris、0.5-1.5mM/L的EDTA和水，PH为7.5-8.5。
作为一种优选地，所述血液样本为人源性血液样本、兔源性血液样本、兔源性血液样本、狗源性血液样本、猴源性血液样本、羊源性血液样本、牛源性血液样本、鱼源性血液样本、鸡源性血液样本、鸭源性血液样本或猪源性血液样本。
本发明还公开了一种血液DNA提取方法，采用上述的血液样本DNA提取试剂盒，包括下述步骤：
S1，向血液样本中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀；
S2，吸磁，弃废液；
S3，加入第一漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S4，加入第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S5，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S6，静置，晾干；加入洗脱缓冲液，吸磁，吸取上清液。
作为一种优选，所述血液样本为150-250体积单位。
作为一种优选，一种血液DNA提取方法，包括下述步骤：
S1，向含有150-250体积单位血液样本的离心管中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀，50-70℃加热5-15min；
S2，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S3，将离心管从磁力架上取下，加入第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S4，将离心管从磁力架上取下，加入40-60wt％的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S5，将离心管从磁力架上取下，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S6，将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置，晾干；加入洗脱缓冲液，70-90℃加热2-8min，将离心管置于磁力架上吸磁，吸取上清液至新的离心管中，-15至-25℃保存。
上述技术方案中所使用的试剂如异硫氰酸胍、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙氧硬化醇、葡聚糖-70、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮、Tris、氯化钙、蛋白酶K、甘油、EDTA、磁珠可以根据需要和产品性能选用各种型号。
本发明的试剂盒可以手动操作，也可以使用本领域公知的技术制备成自动操作的形式以进一步提高效率。
本发明的血液样本DNA提取试剂盒经过精心设计和优化，展现出显著的优点，尤其是能够实现高纯度和高浓度的DNA提取。通过优化的裂解液配方和高度适配的设计，该试剂盒不仅提取效率出众，操作简便，并且具有较强的通用性和灵活性，可广泛适用于不同的实验条件和设备，满足多样化的实验需求，为后续的分子生物学研究提供了极具价值的支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1和对比例2提取的DNA荧光定量PCR结果对比图。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
本发明一种血液样本DNA提取试剂盒，包括：415-645体积单位核酸处理液、1000-2000体积单位核酸漂洗液和50-150体积单位洗脱缓冲液。
其中，所述核酸处理液包括400-600体积单位裂解液、10-30体积单位蛋白酶K溶液和5-15体积单位磁珠悬浮液；
裂解液：3-4M/L的胍类化合物、10-20mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、10-15wt％的乙氧硬化醇、0.1-0.3wt％的葡聚糖-70、1-3M/L的氯化钠、5-10wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水；
所述胍类化合物为异硫氰酸胍、盐酸胍、氨基磺酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。优选地，所述胍类化合物为异硫氰酸胍和氨基磺酸胍摩尔比(1-2)：(1-2)组成。
胍类化合物的主要作用是细胞溶解和蛋白质去除，胍类化合物具有较强的细胞膜破坏能力，能够迅速溶解细胞并释放内部的核酸分子。同时，它可以与蛋白质发生反应，使蛋白质变性和沉淀，从而帮助去除细胞中的蛋白质。
双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷，简称bis-tris，其作用在于维持适宜的pH值，bis-tris可以调节溶液的酸碱性，因此在核酸提取中经常用作缓冲剂。它具有良好的缓冲能力，能够在一定范围内稳定维持溶液的pH值，使得核酸分子在合适的环境中进行提取。由于bis-tris具有缓冲能力和中性的特点，它可以稳定DNA的结构。在核酸提取过程中，特别是在DNA纯化和储存中，使用Tris缓冲液可以保护DNA分子免受酶降解和其他损伤。
氯化钠的作用是破坏能蛋白质稳定性。DNA溶于液相，沉淀DNA时会加入高浓度的盐,加氯化钠的目的是破坏蛋白质稳定性,使蛋白质和DNA分离并沉淀下来，而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中。
乙氧硬化醇的作用是沉淀和纯化。乙氧硬化醇是一种非离子表面活性剂，常被用于沉淀和纯化核酸。帮助去除与核酸结合的蛋白质。这有助于纯化核酸并提高其纯度。
葡聚糖-70，能使已聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的作用是去除多胺和多酚。PVP可以与多胺和多酚等干扰物质结合形成络合物，并将它们从核酸样品中去除。这有助于减少这些干扰物对核酸提取和纯化过程的影响，提高核酸的纯度和质量。
蛋白酶K溶液：10-30mM/mL的Tris、0.005-0.02wt％的氯化钙、10-30mg/mL的蛋白酶K、40-60wt％的甘油和水；
蛋白酶K能够降解多种类型的蛋白质。在核酸提取过程中，加入蛋白酶K可以帮助消化细胞或组织样品中的蛋白质，使核酸得以释放和提取。
磁珠悬浮液：1-2wt％羟基磁珠悬浮液。将羟基磁珠加入水中，搅拌混合均匀，制得所述磁珠悬浮溶液；
羟基磁珠，表面修饰大量的硅烷醇基团(羟基)，能和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其他杂质(如蛋白)结合。经过核酸富集步骤后，使用适当的洗涤缓冲液可以帮助去除非特异性的污染物，如盐类、蛋白质和其他杂质。同时，保留目标核酸与磁珠的结合。接着，通过去除外部磁场或改变缓冲液条件，可以从磁珠上解离出纯净的目标核酸。
其中，所述核酸漂洗液包括300-600体积单位第一漂洗液和700-1400体积单位第二漂洗液；
第一漂洗液：30-70mM/L的Tris、500-1000mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8；
第二漂洗液：30-70mM/L的Tris、50-150mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8；
为了进一步纯化DNA，使用乙醇来沉淀DNA。
其中，所述洗脱缓冲液：5-15mM/L的Tris、0.5-1.5mM/L的EDTA和水，PH为7.5-8.5。
所述体积单位均为μL。
一种血液DNA提取方法，包括下述步骤：
S1，向血液样本中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀；
S2，吸磁，弃废液；
S3，加入第一漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S4，加入第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S5，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S6，静置，晾干；加入洗脱缓冲液，吸磁，吸取上清液。
优选地，所述血液样本为150-250体积单位。
优选地，一种血液DNA提取方法，包括下述步骤：
S1，向含有150-250体积单位血液样本的离心管中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀，50-70℃加热5-15min；
S2，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S3，将离心管从磁力架上取下，加入第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S4，将离心管从磁力架上取下，加入40-60wt％的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S5，将离心管从磁力架上取下，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S6，将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置，晾干；加入洗脱缓冲液，70-90℃加热2-8min，将离心管置于磁力架上吸磁，吸取上清液至新的离心管中，-15至-25℃保存。
实施例及对比例中：
异硫氰酸胍，英文名Guanidinethiocyanate，CAS号：593-84-0。
双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷，CAS号：6976-37-0。英文名bis-tris。
葡聚糖-70，CAS号：9004-54-0，英文名Dextran-70，别名右旋糖酐-70。
乙氧硬化醇，采用聚桂醇400，英文名Polidocanol，CAS号：9043-30-5。
聚乙烯吡咯烷酮，CAS号：9003-39-8。具体采用P434443聚乙烯吡咯烷酮,摩尔重量360000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。
Tris，三(羟甲基)氨基甲烷，CAS号：77-86-1。
蛋白酶K，CAS号：39450-01-6，产品编号蛋白酶K。
羟基磁珠，苏州为度生物技术有限公司提供的MA200H硅羟基磁性微球，固含量2.5wt％。
血液样本，为人源性血液样本。
实施例1
一种血液样本DNA提取试剂盒，
包括：530μL核酸处理液、1500μL核酸漂洗液和100μL洗脱缓冲液。
其中，所述核酸处理液包括500μL裂解液、20μL蛋白酶K溶液和10μL磁珠悬浮液；
裂解液：3.5M/L的胍类化合物、15mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、12wt％的乙氧硬化醇、0.2wt％的葡聚糖-70、2M/L的氯化钠、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水；所述胍类化合物为异硫氰酸胍；
蛋白酶K溶液：20mM/mL的Tris、0.01wt％的氯化钙、20mg/mL的蛋白酶K、50wt％的甘油和水；
磁珠悬浮液：1.25wt％羟基磁珠和水。将市售MA200H硅羟基磁性微球加入等重量的水中，搅拌混合均匀，制得该磁珠悬浮液；
其中，所述核酸漂洗液包括500μL第一漂洗液和1000μL第二漂洗液；
第一漂洗液：50mM/L的Tris、750mM/L的氯化钠、60wt％乙醇和水，pH为7.5；
第二漂洗液：50mM/L的Tris、100mM/L的氯化钠、60wt％乙醇和水，pH为7.5；
其中，所述洗脱缓冲液：10mM/L的Tris、1mM/L的EDTA和水，PH为8.0。
一种血液DNA提取方法，包括下述步骤：
(1)取200μL血液样本加入离心管中，加入500μL裂解液、20μL蛋白酶K溶液和10μL磁珠悬浮液，振荡混匀，60℃加热10min；
(2)将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(3)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(4)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(5)重复步骤(4)一次，即：再次将离心管从磁力架上取下，加入余下的500μL第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(6)瞬时离心后转至磁力架上进行，充分吸弃所有溶液，室温下开盖静置3min，晾干；
(7)加入100μL洗脱缓冲液，80℃加热4min，将离心管置于磁力架上吸磁，小心吸取上清液至新的离心管中，-20℃保存，得到提取后的血液DNA样本。
实施例2
实施例2与实施例1的唯一区别在于：所述胍类化合物为盐酸胍。
实施例3
实施例3与实施例1的唯一区别在于：所述胍类化合物为氨基磺酸胍。
实施例4
实施例4与实施例1的唯一区别在于：所述胍类化合物为氨基磺酸胍和异硫氰酸胍摩尔比1:1。
实施例5
实施例5与实施例1的唯一区别在于：所述胍类化合物为盐酸胍和异硫氰酸胍摩尔比1:1。
对比例1
对比例1的血液DNA提取试剂盒为实施例1的血液样本DNA提取试剂盒；
对比例1与实施例1的区别在于：对比例1减少重复第二漂洗液洗涤的步骤，步骤如下：
(1)取200μL血液样本加入离心管中，加入500μL裂解液、20μL蛋白酶K溶液和10μL磁珠悬浮液，振荡混匀，60℃加热10min；
(2)将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(3)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(4)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
(5)瞬时离心后转至磁力架上进行，充分吸弃所有溶液，室温下开盖静置3min，晾干；
(6)加入100μL洗脱缓冲液，80℃加热4min，将离心管置于磁力架上吸磁，小心吸取上清液至新的离心管中，-20℃保存，得到提取后的血液DNA样本。
对比例2
对比例2的血液DNA提取试剂盒为现有市面上的产品(广州湾区生物科技有限公司；商品名称：磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒；货号BLDM-48)，步骤如下：
(1)取200ul的全血样本加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K、300μL裂解液，高速涡旋混匀30秒，50℃振荡孵育10分钟.
(2)取出离心管，待离心管冷却到室温后，加入20μL磁珠，振荡5分钟。
(3)将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液。
(4)加入700μL第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液。
(5)加入500μL第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液。
(6)加入700μL第三漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液。
(7)瞬时离心后转至磁力架上进行磁分离，充分吸弃所有溶液，室温下开盖静置3min，晾干。
(7)加入100μL洗脱液，60℃加热10min，将离心管置于磁力架上吸磁，小心吸取上清液至新的离心管中，-20℃保存。
对比例3
对比例3与实施例1的唯一区别在于：裂解液的配方不同。对比例3采用CN113913421A实施例1公开的裂解液配方。
具体裂解液配方为：pH值为8.5，包含7M/L的盐酸胍、50mM/L的三羟甲基氨基甲烷、50mM/L的EDTA、10％Tween-20。
对比例4
对比例4与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)替换双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷。
裂解液配方：3.5M/L的异硫氰酸胍、15mM/L的三(羟甲基)氨基甲烷、12wt％的乙氧硬化醇、0.2wt％的葡聚糖-70、2M/L的氯化钠、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
对比例5
对比例5与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中Tween-20替换乙氧硬化醇。
裂解液配方：3.5M/L的异硫氰酸胍、15mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、12wt％的Tween-20、0.2wt％的葡聚糖-70、2M/L的氯化钠、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
对比例6
对比例6与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中不含葡聚糖-70。
裂解液配方：3.5M/L的异硫氰酸胍、15mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、12wt％的乙氧硬化醇、2M/L的氯化钠、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水；对比例7：
对比例7与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中不含氯化钠。
裂解液配方：3.5M/L的异硫氰酸胍、15mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、12wt％的乙氧硬化醇、0.2wt％的葡聚糖-70、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
对比例8：
对比例8与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方不同。
裂解液配方：3.5M/L的异硫氰酸胍、15mM/L的三(羟甲基)氨基甲烷、12wt％的Tween-20、8wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于：实施例6使用自动化提取仪操作，实施例6的血液DNA提取试剂盒为实施例1的血液样本DNA提取试剂盒；
核酸提取仪：南京中科拜尔医学技术有限公司的ZK-01全自动核酸提取纯化仪；
核酸处理液和核酸漂洗液分装：各组分分装至深孔板，顺序如表1所示。
表1核酸提取液和核酸漂洗液加样顺序
| 孔位 | 名称 | 体积(μL) |
| 1/7 | 裂解液 | 500 |
| 2/8 | 第一漂洗液 | 500 |
| 3/9 | 第二漂洗液 | 500 |
| 4/10 | 第二漂洗液 | 500 |
| 5/11 | 洗脱缓冲液 | 100 |
| 6/12 | 磁珠悬浮液 | 10 |
往孔位1加入200μL血液样本和20μL蛋白酶K溶液；
6/12中再增加190μL水。
将深孔板放入提取仪中运行设置的程序，如表2所示。
表2核酸提取程序
具体运行步骤如下：
(1)磁棒套在6/12号孔混匀磁珠后吸取磁珠转移至1/7号孔；
(2)磁珠与裂解液和血液在60℃下加热混匀10min后吸取磁珠转移至2/8号孔；
(3)磁珠与第一漂洗液混匀30s后吸取磁珠转移至3/9号孔；
(4)磁珠与第二漂洗液混匀30s后吸取磁珠转移至4/10号孔；
(5)磁珠与第二漂洗液混匀30s后吸取磁珠转移至5/11号孔；
(6)磁珠与洗脱缓冲液在80℃下加热混匀4min后吸取磁珠转移至6/12号孔；
(7)磁珠与溶液混匀10s丢弃磁珠后结束运行。
实施例7
分别采用实施例1和对比例2的血液DNA提取试剂盒对相同的临床血液样本进行DNA提取，实施例7提取得到的核酸样品进行实时荧光定量PCR检测步骤验证核酸提取效果。
实时荧光定量PCR：
检测目的基因：MTHFR
引物：MTHFR-F：CCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；MTHFR-R：GGAAGAATGTGTCAGCCTCAA；
探针：MTHFR-P：TCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCA，5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
选择PCR体系为20μL体系，向PCR管中加入0.4μL正向引物、0.4μL反向引物、0.2μL升探针、10μLPCR反应液、4μL水和5μLDNA模板，盖紧盖子后振荡混匀，使用低速离心机离心1分钟。
将PCR管放入PCR仪上，运行程序：预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火60℃，30s；进行40个循环，结果如图1所示。
图1实施例1和对比例2提取的DNA荧光定量PCR结果对比图。
通过荧光定量PCR检测发现实施例1的扩增效果明显优于对比例2，说明采用本发明的血液DNA提取试剂盒提取的核酸纯度、浓度和效率较高。
相较于现有技术，本案针对血液提取过程中的瓶颈问题进行改进。通过优化试剂盒内各组分的配比和提取过程的步骤，有效提高了血液提取的效率，提取的DNA浓度和纯度更高。
提高提取效率：通过优化试剂盒的配比和提取步骤，该技术能够显著提高血液提取的效率。相较于传统方法，使用这一专利技术的试剂盒可以更快速地完成血液提取并获得高纯度的DNA，节省时间和成本。
自动化适配性好：专利技术对试剂盒的设计进行了改进，适配大部分自动化仪器，提高了用户的使用便捷性。
测试例1：
GB/T37874-2019核酸提取纯化方法评价通则
提取后的血液DNA样本通过超微量分光光度计进行DNA浓度和纯度的测定
核酸纯度是指核酸提取物中目标核酸的纯度，该指标用于表征核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对含量，对于后续的分子生物学试验有重要的影响。核酸在特定波长的吸光度值及其在不同波长吸光度值的比率对不同性质的核酸有对应的特征值，用以表征提取液的核酸纯度。用紫外分光光度计测定260nm、280nm、230nm下提取液的吸光度OD260、OD280、OD230，计算OD260/OD280和OD260/OD230，表征核酸纯度。测量吸光度时，需调整核酸浓度，保证核酸吸光值OD260在0.1-1.5之间。
纯DNA的OD260/OD280为1.8，在DNA提取获得的产物中，OD260/OD280在1.7-1.9表明DNA纯度符合后续一般分子生物学试验需要。OD260/OD280＞1.9时表明有RNA污染；OD260/OD280＜1.7时表明有蛋白质、多酚等污染。纯DNA的OD260/OD230＞2.0。OD260/OD230＜2.0，表明有残存的盐或其他小分子杂质。
表3：测试数据表
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从实施例1和对比例1对比可知，使用第二漂洗液清洗一次后即可得到较高浓度和纯度的DNA，使用第二漂洗液清洗两次后，可以进一步提高提取DNA的浓度和纯度。
从实施例1和对比例2对比可知，通过比较相同样本不同核酸提取试剂盒的核酸提取浓度，可以得出本发明的血液DNA提取试剂盒提取的核酸比传统提取试剂的浓度和核酸更高，表明本发明的核酸提取效率更高。
从实施例1和对比例3对比可知，对比例3与实施例1的唯一区别在于：裂解液的配方不同。实施例1的效果远优于对比例3。
从实施例1和对比例4-7对比可知，对比例4与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)替换双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷。对比例5与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中Tween-20替换乙氧硬化醇。对比例6与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中不含葡聚糖-70。对比例7与实施例1的唯一区别在于：裂解液配方中不含氯化钠。实施例1的效果明显优于对比例4-7。
从实施例1-3对比可知，胍类化合物(异硫氰酸胍、盐酸胍、氨基磺酸胍)不同，效果不同，氨基磺酸胍效果更佳。采用氨基磺酸胍和异硫氰酸胍具有协同增效，但并不是所有胍类化合物均有协同作用。
总之，这些比较表明在DNA提取中，裂解液的成分选择至关重要，不同的成分可能会对提取效果产生显著影响。此外，不同的胍类化合物也可能在提取效果上有明显差异。
从实施例1和实施例6对比可知，通过手工提取和自动化仪器提取相同样本，可以得出本发明的血液DNA提取试剂盒提取适用于自动化提取仪且提取DNA的浓度和核酸无明显差异。
本发明的血液样本DNA提取试剂盒展现了经过深思熟虑与周到设计后的卓越性能和众多优点。其首要的优势在于其能够提取到高纯度和高浓度的DNA，确保了实验的准确性和可靠性。本试剂盒通过优化的裂解液配方和精准的配套设计，显著提升了DNA的提取效率，使得使用者可以便捷高效地进行操作。其设计考虑到了使用者在实验过程中可能遇到的各种需求和条件，展现出极强的通用性和适应性。无论是不同的实验条件还是不同的实验设备，本试剂盒都可以完美适用，满足实验的多样性和多变性需求。此外，该试剂盒的广泛应用性为后续的分子生物学研究提供了强大而可靠的支持，将大大推动科学研究的深入发展。该试剂盒不仅具备高度的实用性，更进一步优化了实验流程，实现了对不同实验需求的精确满足，确保了科研工作的顺利进行，为生物学、医学和相关领域的科学研究提供了一项关键性的科学工具，有助于推动这些领域的持续进步与发展。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种血液样本DNA提取试剂盒，包括：核酸处理液、核酸漂洗液和洗脱缓冲液；其中，所述核酸处理液包括裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，其特征在于：
所述裂解液包括：胍类化合物、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙氧硬化醇、葡聚糖-70、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮和水。
2.如权利要求1所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液为：3-4M/L的胍类化合物、10-20mM/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、10-15wt％的乙氧硬化醇、0.1-0.3wt％的葡聚糖-70、1-3M/L的氯化钠、5-10wt％的聚乙烯吡咯烷酮和水。
3.如权利要求2所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述胍类化合物为异硫氰酸胍、盐酸胍、氨基磺酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
4.如权利要求1-3任一项所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶液为：10-30mM/mL的Tris、0.005-0.02wt％的氯化钙、10-30mg/mL的蛋白酶K、40-60wt％的甘油和水。
5.如权利要求1-3任一项所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液为：1-2wt％羟基磁珠悬浮液。
6.如权利要求1-3任一项所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述核酸漂洗液包括300-600体积单位第一漂洗液和700-1400体积单位第二漂洗液；
所述第一漂洗液为：30-70mM/L的Tris、500-1000mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8；
所述第二漂洗液为：30-70mM/L的Tris、50-150mM/L的氯化钠、50-70wt％乙醇和水，pH为7-8。
7.如权利要求1-3任一项所述的血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液为：5-15mM/L的Tris、0.5-1.5mM/L的EDTA和水，PH为7.5-8.5。
8.一种血液DNA提取方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的血液样本DNA提取试剂盒，包括下述步骤：
S1，向血液样本中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀；
S2，吸磁，弃废液；
S3，加入第一漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S4，加入第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S5，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，吸磁，弃废液；
S6，静置，晾干；加入洗脱缓冲液，吸磁，吸取上清液。
9.如权利要求8所述的血液DNA提取方法，其特征在于，所述血液样本为150-250体积单位。
10.如权利要求8或9所述的血液DNA提取方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1，向含有150-250体积单位血液样本的离心管中加入裂解液、蛋白酶K溶液和磁珠悬浮液，振荡混匀，50-70℃加热5-15min；
S2，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S3，将离心管从磁力架上取下，加入第一漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S4，将离心管从磁力架上取下，加入40-60wt％的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S5，将离心管从磁力架上取下，加入余下的第二漂洗液，振荡混匀，将离心管放置于磁力架上吸磁，弃废液；
S6，将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置，晾干；加入洗脱缓冲液，70-90℃加热2-8min，将离心管置于磁力架上吸磁，吸取上清液至新的离心管中，-15至-25℃保存。
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