CN114317519A - 一种血液基因组dna提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA提取领域，公开了一种血液基因组DNA提取试剂盒及其使用方法，包括包括细胞裂解液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。细胞裂解液组分包括：浓度2～8M的盐酸胍或异硫氰酸胍中的一种、浓度20mM或50mMpH8.4的Tris‑HCl、浓度25mM的EDTA和浓度1％～20％的表面活化剂；洗涤缓冲液组分包括：浓度20mMpH8.4的的Tris‑HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；洗脱缓冲液组分包括：浓度10mMpH7.0的Tirs‑HCl或10mMpH8.0的TE缓冲液中的一种。本发明提供的血液基因组DNA提取试剂盒在室温条件下储存和操作，其采用的磁珠法提取，操作简单，对全血样本可直接处理无需分离细胞，整个提取过程30min即可完成，提取效率高，获得的DNA浓度和纯度较好，方便下游进行基因检测操作。

Description

一种血液基因组DNA提取试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及DNA提取领域，具体而言，涉及一种血液基因组DNA提取试剂盒及其使用方法。

背景技术

基因组DNA提取是PCR扩增、文库构建和测序工作的基础，临床工作中常用的离体标本包括血液、器官组织和脱落细胞，其中血液样本使用最为广泛。目前，临床用于血液基因组DNA提取方法包括吸附柱法和磁珠法，吸附柱法由于操作过程中需要离心等步骤，受限于离心机通量，遇到样本量大的情况时，需要耗费非常长的时间。

与柱提法相比，磁珠具有良好的表面效应和体积效应，磁珠表面积激增，微球官能团密度和选择性吸附能力大大增加，导致其吸附平衡时间缩短。此外磁珠的物理和化学性质稳定，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物降解，具有一定的生物相容性，不会对生物体造成明显的伤害。磁珠法提取DNA目前在临床上已得到广泛的应用，然而，不同厂家的磁珠法核酸提取法其效率差别很大，存在DNA提取试剂存储条件要求高，操作方法复杂，提取用时长，获得的DNA浓度和纯度不够高的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血液基因组DNA提取试剂盒及其使用方法，旨在解决现有技术中，DNA提取试剂存储条件要求高，DNA提取操作方法复杂、用时长，获得的DNA浓度和纯度不够高的问题。

本发明是这样实现的，一种血液基因组DNA提取试剂盒，包括细胞裂解液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，

所述细胞裂解液包括如下组分：浓度2～8M的盐酸胍或异硫氰酸胍中的一种、浓度20mM或50mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA和浓度1％～20％的表面活化剂；

所述洗涤缓冲液包括如下组分：浓度20mM pH 8.4的的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

所述洗脱缓冲液包括如下组分：浓度10mM pH 7.0的Tirs-HCl或10mM pH8.0的TE缓冲液中的一种。

进一步的，所述表面活化剂为5％SDS和1％Triton X-100的组合。

进一步的，所述表面活化剂为tween 20、NP-40、CTAB中1-3种的组合。

进一步的，所述盐酸胍或异硫氰酸胍中的一种的浓度为6M。

进一步的，所述细胞裂解液还包括0.5MNH4⁺。

一种血液基因组DNA提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将200μL全血与所述细胞裂解液等体积混匀，室温条件下振荡混匀10min；

(2)加入20μL磁珠颗粒，每2min将液体中的磁珠混匀悬浮一次，10min后加磁场将磁珠分离出来，此时DNA仍吸附在磁珠表面；

(3)将磁珠转移至500μL所述洗涤缓冲液中，混匀洗涤2min，加入磁场弃洗涤后的所述洗涤缓冲液，此时DNA吸附在磁珠表面；

(4)将磁珠转移至600μL80％的乙醇溶液中，混匀洗涤1min，加入磁场弃洗涤后的乙醇溶液，此时DNA仍吸附在磁珠表面；

(5)将磁珠转移至100μL所述洗脱缓冲液中，混匀2min，此时DNA从磁珠表面游离出来，加入磁场即得到纯化好的DNA。

与现有技术相比，本发明提供的血液基因组DNA提取试剂盒在室温条件下储存和操作，无需特殊条件，其使用方法简单，裂解不需要额外的加热或蛋白酶处理，对全血样本可直接处理无需分离细胞，整个提取过程30min即可完成。本发明的血液基因组DNA提取试剂不使用苯酚氯仿等有毒的有机溶剂，对操作人员无毒害作用。本发明提取效率高，获得的DNA浓度和纯度较好，方便下游进行基因检测操作。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的血液基因组DNA提取试剂盒，包括细胞裂解液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。细胞裂解液中含有高离盐和表面活性剂，能破坏细胞表面的跨膜蛋白，使细胞膜破裂，释放出来的核酸在高离环境中与磁珠吸附结合，洗涤缓冲液含有低浓度的盐离子，可以去除磁珠表面的杂质，最后经过洗脱缓冲液洗脱即可获得纯化的DNA。

本发明的细胞裂解液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的实施例组分如下：

具体实施例1：

细胞裂解包括组分：浓度6M的盐酸胍、浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、浓度25mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、浓度5％SDS(十二烷基硫酸钠)、浓度1％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA(乙二胺四乙酸)和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 7.0的Tirs-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)。

具体实施例2：

细胞裂解包括组分：浓度6M的盐酸胍、浓度50mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA、浓度5％SDS和浓度1％Triton X-100；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 7.0的Tirs-HCl。

具体实施例3：

细胞裂解包括组分：浓度2M的异硫氰酸胍、浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA、浓度6％tween 20(吐温-20或山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯(20)醚)和浓度2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 8.0的TE缓冲液。

具体实施例4：

细胞裂解包括组分：浓度5M的异硫氰酸胍、浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA、浓度8％tween 20、浓度2％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)和浓度2％CTAB；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 8.0的TE缓冲液。

具体实施例5：

细胞裂解包括组分：浓度8M的异硫氰酸胍、浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA、浓度8％tween 20、2％NP-40和2％CTAB；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 8.0的TE缓冲液。

具体实施例6：

细胞裂解包括组分：浓度6M的盐酸胍、浓度50mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA、浓度5％SDS、浓度1％Triton X-100和浓度0.5M NH4⁺；

洗涤缓冲液包括组分：浓度20mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

洗脱缓冲液包括组分：浓度10mM pH 7.0的Tirs-HCl。

血液基因组DNA提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将200μL全血与细胞裂解液等体积混匀，室温条件下振荡混匀10min；

(2)加入20μL磁珠颗粒(优选超顺氧化硅纳米磁珠)，每2min将液体中的磁珠混匀悬浮一次，10min后加磁场将磁珠分离出来，此时DNA吸附在磁珠表面；

(3)将磁珠转移至500μL洗涤缓冲液中，混匀洗涤2min，加入磁场弃洗涤后的洗涤缓冲液，此时DNA吸附在磁珠表面；

(4)将磁珠转移至600μL80％的乙醇溶液中，混匀洗涤1min，加入磁场弃洗涤后的乙醇溶液，此时DNA吸附在磁珠表面；

(5)将磁珠转移至100μL洗脱缓冲液中，混匀2min，此时DNA从磁珠表面游离出来，加入磁场即得到纯化好的DNA。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种血液基因组DNA提取试剂盒，包括细胞裂解液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，其特征在于：

所述细胞裂解液包括如下组分：浓度2～8M的盐酸胍或异硫氰酸胍中的一种、浓度20mM或50mM pH 8.4的Tris-HCl、浓度25mM的EDTA和浓度1％～20％的表面活化剂；

所述洗涤缓冲液包括如下组分：浓度20mM pH 8.4的的Tris-HCl、浓度0.5M的NaCl、浓度1mM的EDTA和80％无水乙醇；

所述洗脱缓冲液包括如下组分：浓度10mM pH 7.0的Tirs-HCl或10mM pH8.0的TE缓冲液中的一种。

2.如权利要求1所述的血液基因组DNA提取试剂盒，所述表面活化剂为5％SDS和1％Triton X-100的组合。

3.如权利要求1所述的血液基因组DNA提取试剂盒，所述表面活化剂为tween 20、NP-40、CTAB中1-3种的组合。

4.如权利要求1所述的血液基因组DNA提取试剂盒，所述盐酸胍或异硫氰酸胍中的一种的浓度为6M。

5.如权利要求1-2所述的血液基因组DNA提取试剂盒，所述细胞裂解液还包括0.5MNH4⁺。

6.如权利要求1-5所述的血液基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将200μL全血与所述细胞裂解液等体积混匀，室温条件下振荡混匀10min；

(2)加入20μL磁珠颗粒，每2min将液体中的磁珠混匀悬浮一次，10min后加磁场将磁珠分离出来，此时DNA仍吸附在磁珠表面；

(3)将磁珠转移至500μL所述洗涤缓冲液中，混匀洗涤2min，加入磁场弃洗涤后的所述洗涤缓冲液，此时DNA吸附在磁珠表面；

(4)将磁珠转移至600μL80％的乙醇溶液中，混匀洗涤1min，加入磁场弃洗涤后的乙醇溶液，此时DNA仍吸附在磁珠表面；

(5)将磁珠转移至100μL所述洗脱缓冲液中，混匀2min，此时DNA从磁珠表面游离出来，加入磁场即得到纯化好的DNA。