CN109722431B - 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒，含有裂解液；磁珠溶液；蛋白酶K；polyA溶液；去蛋白液；洗涤液；缓冲液。本发明还提供了采用上述的试剂盒提取核酸的方法，先加入样本、裂解液和磁珠进行混匀，然后边裂解边捕获核酸分子，最后分别采用特有的无醇去蛋白液和洗涤液洗涤去除磁珠表面的蛋白质和盐离子等杂质。与常规的病毒核酸提取方法相比较，操作步骤简单，不需要单独加入结合液，实现了裂解和结合同时进行，DNA和RNA共提；整个操作过程中不加入乙醇或异丙醇，抑制物质残留少，实验步骤简便，整个流程下来仅需要40min左右；安全无污染，无氯仿苯酚等有毒试剂，既可以手工操作也可以用于自动化平台。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒。
背景技术
病毒的结构相对简单，由外面的衣壳蛋白和内部的核酸物质组成，根据核酸物质可以将病毒分为DNA病毒或RNA病毒。随着分子生物学的发展，对疾病相关病毒进行检测和分型是分子检测的一个重要应用领域，而从生物材料中高效、简便的提取和纯化目的核酸是分子检测的关键技术。目前病毒核酸纯化技术主要分为三种，分别为传统法、柱膜法和磁珠法。
传统的核酸纯化主要是利用变性剂和表面活性剂进行裂解，释放出核酸后用苯酚、氯仿进行抽提去除蛋白等杂质，然后用乙醇或异丙醇进行沉淀，去除上清后获得核酸沉淀，然后用TB或TE缓冲液进行溶解。该方法步骤繁琐，重复性差，耗时较长，并且使用了有剂试剂。煮沸法也是传统的病毒核酸提取方法之一，但是该方法提取的核酸纯度较低，对检测的灵敏度影响较大。柱膜法是用硅胶膜对核酸进行吸附和纯化，主要是用变性剂和表面活性剂裂解细胞，释放核酸分子，在低pH值、高盐以及醇的条件下结合核酸分子，然后用含有胍盐的乙醇溶液洗涤去除蛋白等杂质，用70％或80％的乙醇溶液去除盐离子，干燥去除残留乙醇后在高pH值、低盐的情况下洗脱核酸，该方法操作相对简便，提取的核酸纯度高，但是不利于自动化操作。磁珠法病毒核酸提取和柱膜法类似，主要是用磁性微球替代柱膜吸附核酸，该方法的优点是能够在仪器上进行操作，进行自动化操作，但是由于磁珠吸附核酸的同时也会吸附蛋白等杂质，所以对结合以及洗涤条件要求比较高，获得高纯度的核酸比较困难。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒，所述的这种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒要解决现有技术中提取核酸的方法复杂，提取要求较高、提纯困难的技术问题。
本发明提供了一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒，包括如下试剂：
裂解液，所述的裂解液中含有浓度为25-75mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0，浓度3-5M的GTC(异硫氰酸胍)，质量百分比浓度为5-15％的聚多卡醇，质量百分比浓度为5-15％的PEG6000；
磁珠溶液，所述的磁珠溶液的浓度为50-100mg/mL，所述的磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠；
蛋白酶K，所述的蛋白酶K的浓度为50-100mg/mL；
polyA溶液，所述的polyA的浓度为10-50mM 10mM；
去蛋白液，所述的去蛋白液中含有浓度为1-3M的GTC(异硫氰酸胍)，浓度为的10-20mM Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10％的PEG6000；
洗涤液，所述的洗涤液中含有浓度为10-50mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10％的PEG6000，浓度为200-300mM的Nacl；
缓冲液，所述的缓冲液为浓度为10-20mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为pH8.0-9.0。
本发明还提供了采用上述的试剂盒提取核酸的方法，包括如下步骤：
1)一个对血浆或血清中的病毒进行裂解的步骤：在2mL离心管中加入300-500μL的血清或血浆样本，加入500-1000μL的裂解液、10-30μL含有磁珠的溶液，20-50μL的蛋白酶K溶液、5-10μL的polyA溶液，涡旋振荡1-2min至样本充分混匀，然后颠倒混匀10-15min；
2)一个吸附核酸和去除杂蛋白的步骤：将步骤1)的离心管放置于磁力架上静置30秒，磁珠完全吸附后，吸去液体，将离心管从磁力架上取下，加入500-1000μL的去蛋白液，振荡混匀5min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
3)一个对盐离子进行洗涤的步骤：将步骤2)的离心管从磁力架上取下，加入700-1000μL的洗涤液，振荡混匀2min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
4)一个对DNA进行洗脱的步骤，将步骤3)的离心管从磁力架上取下，加入50-100μL缓冲液，振荡混匀，置于50-60℃，孵育5-10min，期间颠倒混匀3次，将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸的提取。
本发明的试剂盒先用异硫氰酸胍和聚多卡醇裂解血浆或血清中的病毒细胞，异硫氰酸胍是强的变性剂，而聚多卡醇和蛋白酶K有助于细胞的裂解，可以充分裂解样品中的病毒细胞，获得高丰度的病毒核酸；PEG6000作为结合液，可以很大程度上减少磁珠对蛋白质等杂质的吸附，提高了提取的稳定性，获得高质量的病毒核酸。然后分别用无醇的去蛋白液和洗涤液洗涤去除蛋白质和盐离子等杂质，最终获得高质量的病毒核酸。本发明的试剂盒操作简便，不需要使用有机试剂，安全无污染。本发明的试剂盒既可以进行手工操作也可以用于自动化操作平台，适合工业客户进行自动化操作，具有更加广阔的应用前景。
本发明采用了独特的无醇裂解液和洗涤液，首先充分裂解病毒粒子释放核酸的同时，用磁珠捕获和结合核酸，然后通过洗涤去除蛋白杂质和盐例子，最终获得高质量的核酸分子(DNA或RNA)，并且能够应用于自动化平台，具有更加广阔的应用前景。
本发明提供一种基于磁珠法无醇病毒核酸提取试剂盒，在使用过程中，先加入样本、裂解液和磁珠进行充分混匀，裂解和结合血清或血浆中病毒核酸、再利用特有的无醇去蛋白液和洗涤液去除蛋白质、盐离子等杂质，利用该试剂盒可以快速高效的获得高质量的病毒核酸。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明与常规的病毒核酸提取方法相比较，操作步骤简单，不需要单独加入结合液，实现了裂解和结合同时进行，DNA和RNA共提；整个操作过程中不加入乙醇或异丙醇，抑制物质残留少，实验步骤简便，整个流程下来仅需要40min左右；安全无污染，无氯仿苯酚等有毒试剂，既可以手工操作也可以用于自动化平台，适合于工业客户快速、有效、经济的提取病毒核酸。
附图说明
图1显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行QPCR后，为血浆中HBV基因扩增曲线图。
图2显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行QPCR后，为血浆中HCV基因扩增曲线图。
图3显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行QPCR后，为血清中HBV基因扩增曲线图。
图4显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行QPCR后，为血清中HCV基因扩增曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1血浆中HBV和HCV病毒的检测(与国内某厂家磁珠法试剂盒进行比较研究)
(1)病毒核酸的提取
1)在2ml离心管中加入血浆320ul(阴性血浆中加入终浓度为10IU的WHO HBV标准品和终浓度为30IU的WHO HCV标准品)，加入600μL裂解液、15μL含有磁珠的溶液、20μL蛋白酶K溶液和5μL polyA溶液，涡旋1min至样本充分混匀，然震荡混匀15min。
2)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
3)加入500μL缓冲液去蛋白液混匀，涡旋震荡1min。
4)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
5)加入700μL洗涤液，振荡混匀1min。
6)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
7)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃残留液体。
8)将离心管从磁力架上取下，加入70μL洗脱液缓冲液，振荡混匀，置于56℃，孵育5-10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。
9)将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。取30ul做模板进行Q-PCR检测(如图1,2)。
(2)病毒基因的检测
PCR体系：
反应程序为：
HBV引物和探针：
hbvfp：5'-agg aac ctc tat gtt tcc ctc ct-3'
hbvrp：5'-cct aaa gcc caa gat gat ggg a-3'
hbv-p：5'-cy5-cca aac cct cgg acg gaa act gca c-bhq3-3'
hcvfp：5'-gaaccggtgagtacaccggaa-3'
hcvrp：5'-ggcagtaccacaaggccttt-3'
hcv-p：5'-fam-atttgggcgtgcccccgcragactg-bhq1-3'
表1：血浆中HBV和HCV检测的平均Ct；
| 检测基因 | 无醇磁珠法(本发明) | 对照试剂盒 |
| HBV | 33.9 | 35.3 |
| HCV | 33.6 | 36.1 |
结论：与对照试剂盒相比，本发明(磁珠法无醇病毒核酸提取试剂盒)针对血浆中病毒核酸(HBV和HCV)的提取效率较高。
实施例2血清中HBV和HCV病毒的检测(与上海科华核酸提取试剂盒进行比对(lot：18076550)，操作步骤参照说明书)
(1)病毒核酸的提取
1)在2ml离心管中加入血浆320ul(阴性血浆中加入终浓度为10IU的WHO HBV标准品和终浓度为30IU的WHO HCV标准品)，加入600μL裂解液、15μL含有磁珠的溶液、20μL蛋白酶K溶液和5μL polyA溶液，涡旋1min至样本充分混匀，然震荡混匀15min。
2)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
3)加入500μL缓冲液去蛋白液混匀，涡旋震荡1min。
4)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
5)加入700μL洗涤液，振荡混匀1min。
6)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
7)瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸弃残留液体。
8)将离心管从磁力架上取下，加入70μL洗脱液缓冲液，振荡混匀，置于56℃，孵育5-10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。
9)将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。取30ul做模板进行Q-PCR检测(如图3,4)。
(2)病毒基因的检测
PCR体系，程序以及引物与实施例1中相同，检测HBV和HCV的平均Ct值见表2：
表2：血清中HBV和HCV检测的平均Ct；
结论：与对照试剂盒相比，本发明(磁珠法无醇病毒核酸提取试剂盒)针对血浆中病毒核酸(HBV和HCV)的提取效率较高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (1)
1.一种基于磁珠法无醇病毒核酸提取试剂盒，其特征在于包括如下试剂：
裂解液，所述的裂解液中含有浓度为25-75 mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0，浓度3-5 M的异硫氰酸胍，质量百分比浓度为5-15%的聚多卡醇，质量百分比浓度为5-15% 的PEG6000；
磁珠溶液，所述的磁珠溶液的浓度为50-100mg/mL，所述的磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠；
蛋白酶K，所述的蛋白酶K的浓度为50-100 mg/mL；
polyA溶液，所述的polyA的浓度为10-50 mM；
去蛋白液，所述的去蛋白液中含有浓度为1-3M 的异硫氰酸胍，浓度为10-20 mM 的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0- 9.0，质量百分比浓度为5-10%的PEG6000；
洗涤液，所述的洗涤液中含有浓度为10-50mM的 Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0- 9.0，质量百分比浓度为5-10%的PEG6000，浓度为200-300mM的Nacl；
缓冲液，所述的缓冲液为浓度为10-20 mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为pH8.0-9.0；
采用上述的试剂盒提取核酸的方法，包括如下步骤：
1）一个对血浆或血清中的病毒进行裂解的步骤：在2 mL离心管中加入300-500µL的血清或血浆样本，加入500-1000 µL的裂解液、10-30 µL 含有磁珠的溶液，20-50µL的 蛋白酶K溶液、5-10µL的polyA溶液，涡旋振荡1-2 min至样本充分混匀，然后颠倒混匀10-15min；
2）一个吸附核酸和去除杂蛋白的步骤：将步骤1）的离心管放置于磁力架上静置30 秒，磁珠完全吸附后，吸去液体，将离心管从磁力架上取下，加入500-1000 μL 的去蛋白液，振荡混匀5 min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
3）一个对盐离子进行洗涤的步骤：将步骤2）的离心管从磁力架上取下，加入700-1000μL的洗涤液，振荡混匀2 min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
4）一个对DNA进行洗脱的步骤，将步骤3）的离心管从磁力架上取下，加入50-100 μL 缓冲液，振荡混匀，置于50-60℃，孵育5-10 min，期间颠倒混匀3次，将离心管放置于磁力架上静置2 min，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸的提取。
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