CN112795623A - 一种病毒核酸提取裂解液、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠的病毒核酸提取方法及试剂盒，所述提取方法包括以下步骤：将生物样本和裂解液混匀后得到裂解反应体系；所述裂解反应体系进行反应，反应结束后通过磁珠吸附核酸，得到吸附有核酸的磁珠；将获得的吸附有核酸的磁珠洗涤后进行核酸洗脱，获得生物样本核酸；其中，所述裂解液中含有离液剂、金属螯合剂、钠离子、非离子型表面活性剂和聚乙二醇。本发明提供的基于磁珠法的病毒核酸提取方法，在释放核酸的过程中，不需要蛋白酶K、以及PolyA溶液，极大限度较少因为操作引起的污染。提取方法操作方便、简单，可大幅降低人工成本和时间成本，适合高通量提取。
Description
技术领域
本发明属于病毒核酸提取领域，更具体地，涉及一种组织样本病毒核酸提取裂解液、试剂盒及方法。
背景技术
随着分子生物学的发展，对疾病相关病毒进行检测和分型是分子检测的一个重要应用领域，而从生物材料中高效、简便的提取纯化目的核酸是分子检测的关键技术。
目前病毒核酸提取方法有酚-氯仿法、煮沸法、离心柱提取试剂盒、磁珠法提取试剂盒。
其中酚-氯仿法虽然对蛋白抽提较彻底，但是操作过程复杂，在反复的抽提震荡过程中对DNA链有一定的机械损伤，使其发生降解，其使用的酚为商品酚，易被氧化产生酚的氧化物如醌、二酸等，可破坏核酸的二脂键并引起DNA链的交联，进而影响PCR反应，且在DNA溶液中残留的酚类等有机物对DNA聚合酶有抑制作用，抑制PCR扩增反应，降低扩增效率；煮沸法提取产物蛋白等杂质残留过多、质量较差，而且高温可能使部分DNA链断裂成小片段。相比之下，试剂盒不仅有蛋白酶消化的步骤而且减少了酚-氯仿抽提过程中造成的机械损伤，较彻底地出去了蛋白质杂质，提取的DNA效果相对较好。
但是其需要新鲜添加蛋白酶K使膜蛋白、组蛋白降解，使核酸充分游离；另外还需要添加Poly A溶液，以上操作步骤易造成污染以及气溶胶的产生。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于磁珠的病毒核酸提取方法及试剂盒，由此解决现有技术中病毒核酸提取需要使用蛋白酶K以及Poly A溶液易造成污染以及气溶胶的产生的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种病毒核酸提取裂解液，其特征在于，含有3.5-6mol/L的异硫氰酸胍。
优选地，所述病毒核酸提取裂解液，其含有1％-20％PEG-8000。
优选地，所述病毒核酸提取裂解液，其含有5-100mmol/L金属螯合剂、100-500mmol/L钠离子、1-10wt％非离子型表面活性剂、1-20wt％聚乙二醇、5-100mmol/L Tris。
优选地，所述病毒核酸提取裂解液，其所述裂解液的pH值为7-8，优选地，所述裂解液的pH值为8。
按照本发明的另一个方面，提供了一种病毒核酸提取试剂盒，其包括本发明提供的裂解液，优选包括洗涤液、以及洗脱液。
优选地，所述病毒核酸提取试剂盒，其所述洗涤液pH值为7-8，其中含有60-80wt％酒精0.1-0.5mol/L NaCl。
优选地，所述病毒核酸提取试剂盒，其所述洗涤液为为分散有5-200mg/mL用于核酸提取磁珠的磁珠-洗涤混合液。
按照本发明的另一个方面，提供了一种基于磁珠的病毒核酸提取方法，其包括以下步骤：
将含有病毒的生物样本和本发明提供的裂解液混匀后得到裂解反应体系；
所述裂解反应体系进行反应，反应结束后通过磁珠吸附核酸，得到吸附有核酸的磁珠；
将获得的吸附有核酸的磁珠洗涤后进行核酸洗脱，获得病毒核酸。
优选地，所述基于磁珠的病毒核酸提取方法，其所述生物样本与所述裂解液以1:(1.75-2.25)的体积比混合。
优选地，所述基于磁珠的病毒核酸提取方法，其所述裂解反应体系常温反应5-15min。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列技术效果：
本发明提供的基于磁珠法的病毒核酸提取方法，在释放核酸的过程中，不需要蛋白酶K、以及Poly A溶液，极大限度较少因为操作引起的污染。
本发明提供的基于磁珠法的病毒核酸提取方法，操作方便、简单，可大幅降低人工成本和时间成本，尤其是适用于核酸自动提取仪，能全流程机械化操作，无需人工看顾，适合高通量提取。
本发明提供的试剂盒，无需加入蛋白酶K、以及Poly A溶液，极大限度较少因为操作引起的污染，无需使用有毒有机溶剂，此外提取过程无需加热，极大限度减少了气溶胶的产生，能够更为安全、有效的提取病毒核酸。
附图说明
图1是实施例1中样本1提取产物实时荧光定量PCR扩增曲线图。
图2是实施例1中样本2提取产物实时荧光定量PCR扩增曲线图。
图3为实施例2中提取核酸后，对核酸进行PCR后，新冠假病毒N基因扩增曲线图。
图4为实施例2中提取核酸后，对核酸进行PCR后，ORF1ab基因扩增曲线图。
图5为实施例2中提取核酸后，对核酸进行PCR后，内标基因扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的病毒核酸提取裂解液，含有3.5-6mol/L的异硫氰酸胍，优选4mol/L的异硫氰酸胍；优选含有1％-20％PEG-8000；所述裂解液的pH值为7-8，优选地，所述裂解液的pH值为8。
优选方案，所述病毒核酸提取裂解液，还含有5-100mmol/L金属螯合剂、100-500mmol/L钠离子、1-10wt％非离子型表面活性剂、5-100mmol/L Tris；优选含有50-100mmol/L金属螯合剂、100-200mmol/L钠离子、1-10wt％非离子型表面活性剂、50-100mmol/L Tris。所述金属螯合剂选自EDTA、EDTA-2Na中的任意一种或多种的组合；所述非离子型表面活性剂选自Triton、NP-40中的任意一种或多种的组合；
一般核酸提取的裂解液采用3M以下的成本相对较低的盐酸胍作为离液剂，使蛋白质变性。这是由于一般除了裂解液还会首先采用蛋白酶K对生物样本进行酶解，帮助细胞裂解、使DNA酶、RNA酶失活、并更好的释放DNA，采用盐酸胍作为离液剂就能较好的释放核酸，取得较好核酸提取效果。在不使用蛋白酶K的情况下，我们发现采用高浓度(3.5M以上)的异硫氰酸可以代替蛋白酶K破坏膜蛋白，并且迅速的抑制会导致目标核酸降解的RNA酶和DNA酶，释放核酸的同时避免核酸被降解，无需ploy A溶液帮助目标核酸稳定。
裂解液中含有1％-20％PEG-8000，本发明中使用聚乙二醇富集核酸，结合磁珠，申请人发现分子量为8000的聚乙二醇特别适合用于富集病毒的核酸，利用PEG高分子粘稠特性作为结合剂，同时能富集病毒核酸，实验显示8000分子量的聚乙二醇特别适合病毒基因组大小的核酸富集，能提高从血浆、拭子等组织样本中提取病毒核酸的成功率、降低检出限。
本发明提供的病毒核酸提取试剂盒，包括本发明提供的病毒核酸提取裂解液、优选洗涤液、以及洗脱液；
所述洗涤液pH值为7-8，其中含有60-80wt％酒精0.1-0.5mol/L NaCl；优选所述洗涤液为分散有5-200mg/mL用于核酸提取磁珠的磁珠-洗涤混合液；所述磁珠的粒径为50-200nm，优选100nm；
所述洗脱液中含有10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。
本发明由于采用了高浓度的异硫氰酸胍，同时起到裂解细胞膜、抑制RNA酶、DNA酶、组蛋白变性的作用，但同时带来了洗涤难度。为了配合高浓度异硫氰酸胍的清洗，采用以乙醇为主的洗涤液，通过至少一次洗脱，可以达到清洗高浓度异硫氰酸胍的目的。
优选方案，用洗涤液同时保存磁珠，一方面维持磁珠清洁，另一方面磁珠法核酸提取仪可以完全自动化的提取核酸，而无需手动加入固体磁珠，减轻人工工作量。
本发明提供的基于磁珠的病毒核酸提取方法，包括以下步骤：
将含有病毒的生物样本和本发明提供的裂解液混匀后得到裂解反应体系；优选所述生物样本与所述裂解液以1:(1.75-2.25)的体积比混合。
所述裂解反应体系进行反应，反应结束后通过磁珠吸附核酸，得到吸附有核酸的磁珠；所述裂解反应体系常温反应5-15min；所述磁珠的粒径为50-200nm，优选100nm；
将获得的吸附有核酸的磁珠洗涤后进行核酸洗脱，获得病毒核酸。
所述洗涤液pH值为7-8，其中含有60-80wt％酒精0.1-0.5mol/L NaCl；
所述洗脱液中含有10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。
蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，这样在检测阶段更安全；蛋白酶K能够酶解样本中的各类蛋白质，包括那些与核酸紧密结合的组蛋白，从而使得核酸能从样品中释放，游离到提取液中，便于下一步的抽提和纯化；另外，蛋白酶K还可以降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测，因此，在现有的病毒核酸提取中往往需要加入蛋白酶K。本发明申请人发现在释放核酸的过程中，不加入蛋白酶K、以及Poly A溶液，也可实现释放核酸，实现病毒核酸提取，相较于现有技术中需要加入蛋白酶K、以及Poly A溶液的提取方法，极大限度较少因为操作引起的污染。可以理解地，本领域技术人员可以在裂解病毒释放核酸过程中加入除蛋白酶K、以及Poly A溶液以外的其他进一步有助于裂解病毒释放核酸的试剂，这也包含在本发明的保护范围之中。
以下为实施例：
实施例1
以猪圆环2型病毒疫苗液和鸡新城疫病毒疫苗液为例,使用实施例1的磁珠法病毒核酸提取试剂盒与国内公司A和公司B的试剂盒进行提取对比，验证提取产物扩增效果。其中样本1为鸡新城疫病毒疫苗液样本，样本2为猪圆环2型病毒疫苗液样本。
一种适用于基于磁珠的病毒核酸提取方法的试剂盒，包括裂解液、磁珠-洗涤液混合液和洗脱液。
所述裂解液pH值为8，其中含有3.5mol/L异硫氰酸胍、20mmol/L EDTA、500mmol/LNaCl、4wt％Triton、5wt％聚乙二醇8000、90mmol/L Tris。
所述磁珠-洗涤液混合液pH值为7，其中含有75％酒精、5mg/mL磁珠，300mmol/LNaCl，所述磁珠的粒径为100nm。
所述洗脱液中含有10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，调节PH至7。
应用所述试剂盒，采用S-96核酸自动化提取仪，进行病毒核酸自动提取，具体方法如下：
1.将血浆、拭子、病毒培养液样本充分混匀，吸取200μL样本至一新深孔板对应孔位中。
2.每个样品孔中加入550μL裂解液，然后将深孔板置于S-96核酸自动化提取仪工位2上。
3.打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示，设置仪器参数。运行程序，待试验结束后其中工位6的液体即是所提取的核酸。
4.用8道或12道移液器将磁珠-洗涤液混合液(600μL/孔)、以及洗脱液(50μL/孔)分别分装至2个新的深孔板中，然后置于工位3和工位6上，开始运行程序。
具体参数设置如下表：
样本1的提取产物实时荧光定量PCR扩增曲线图如图1所示，样本2的提取产物实时荧光定量PCR扩增曲线图如图2所示，图1和图2中的“纳磁”代表本实施例。可见，本实施例中的试剂盒提取效果均优于市场上常用的其他两厂家的试剂盒。
实施例2
以新冠假病毒液混合口腔拭子样本为例，使用本实施例的病毒核酸提取试剂盒与国内某公司C的试剂盒做提取效果对比的测试。
一种适用于基于磁珠的病毒核酸提取方法的试剂盒，包括裂解液、磁珠-洗涤液混合液和洗脱液。
所述裂解液pH值为7.6，其中含有4mol/L异硫氰酸胍、10mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl、3wt％Triton、5wt％聚乙二醇8000、80mmol/L Tris。
所述磁珠-洗涤液混合液pH值为7，其中含有75％酒精、5mg/mL磁珠，100mmol/LNaCl，所述磁珠的粒径为100nm。
所述洗脱液中含有10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，调节PH至7。
应用所述试剂盒、进行病毒核酸自动提取，具体方法如下：
1.将磁珠-洗涤液混合液混匀后吸取600μL至①号1.5mL EP管中。
2.置于磁力架上静置2min后，将上清液吸出置于②号1.5mL EP管中，保存待用。
3.将裂解液混匀后取550μL加入①号1.5mL EP管中，加入200μL样本，震荡混匀7min。
4.将①号1.5mL EP管置于磁力架上静置2min。
5.丢弃①号EP管上清液，将②号EP管液体转移至①号EP管，震荡混匀3min。
6.置于磁力架上静置1min，丢弃上清液，尽量吸取干净，开盖室温晾干5min。
7.加入50μL洗脱液，震荡混匀3min，置于磁力架上静置1min后，将上清液转移至无RNA酶EP管内，4℃或-20℃保存。
提取之后，对提取产物进行PCR扩增，结果如图3、图4、图5所示，图3为新冠假病毒N基因扩增曲线图；图4为ORF1ab基因扩增曲线图；图5为内标基因扩增曲线图，图3-5中“纳磁生物”代表本实施例。可见，本实施例中的试剂盒提取效果更优。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种病毒核酸提取裂解液，其特征在于，含有3.5-6mol/L的异硫氰酸胍。
2.如权利要求1所述的病毒核酸提取裂解液，其特征在于，含有1％-20％PEG-8000。
3.如权利要求1或2所述的病毒核酸提取液裂解液，其特征在于，含有5-100mmol/L金属螯合剂、100-500mmol/L钠离子、1-10wt％非离子型表面活性剂、1-20wt％聚乙二醇、5-100mmol/L Tris。
4.如权利要求1或2所述的病毒核酸提取液裂解液，其特征在于，所述裂解液的pH值为7-8，优选地，所述裂解液的pH值为8。
5.一种病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任意一项所述的裂解液，优选包括洗涤液、以及洗脱液。
6.如权利要求5所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液pH值为7-8，其中含有60-80wt％酒精0.1-0.5mol/L NaCl。
7.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为为分散有5-200mg/mL用于核酸提取磁珠的磁珠-洗涤混合液。
8.一种基于磁珠的病毒核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有病毒的生物样本和权利要求1至4任意一项所述的裂解液混匀后得到裂解反应体系；
所述裂解反应体系进行反应，反应结束后通过磁珠吸附核酸，得到吸附有核酸的磁珠；
将获得的吸附有核酸的磁珠洗涤后进行核酸洗脱，获得病毒核酸。
9.如权利要求8所述的基于磁珠的病毒核酸提取方法，其特征在于，所述生物样本与所述裂解液以1:(1.75-2.25)的体积比混合。
10.如权利要求1所述的基于磁珠的病毒核酸提取方法，其特征在于，所述裂解反应体系常温反应5-15min。
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