CN117467657A - 一种裂解组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明中提供一种能快速裂解释放病毒等核酸的无泡裂解组合物，呈酸性，不含表面活性剂和胍盐成分，在一定残留量下对下游检测反应几乎无抑制作用，从而无需经多次清洗纯化即可直接进行洗脱而获取核酸。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种能够快速裂解细胞等以提取病毒核酸的无泡裂解组合物。
背景技术
在病毒核酸检测过程中，提取纯化病毒核酸首先需将病毒核酸释放出来，并与其他生物大分子分开。传统的离心柱法或磁珠法提取核酸一般需要裂解、结合、漂洗、洗脱等步骤。第一个关键步骤就是裂解，如果裂解不充分，可提取的目标核酸量便会较低，进而影响后续检测流程。
裂解的方式主要有机械作用、酶作用和化学作用。机械作用即通过机械力释放核酸，同时可能会引起核酸链断裂，因此不适于高分子量长链核酸的分离；酶作用主要是使用溶菌酶或蛋白酶；化学作用需要一定的pH和变性条件，变性条件一般为加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX2100、Tween 20、NP240、CTAB等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)。基因组核酸提取试剂盒主要用CTAB、SDS和异硫氰酸胍即裂解试剂进行裂解。
目前的裂解试剂中往往含有表面活性剂和强离子剂(胍盐)等成分，表面活性剂的存在极易产生气溶胶，从而造成样本的污染；而胍盐在实际操作中会降低溶液pH值，近中性或偏酸性时胍盐易产生沉淀，影响裂解效果，降低核酸提取得率。此外，这些成分通常对下游反应如聚合酶链式反应(PCR)技术具有较强的抑制作用，需经过多次清洗纯化步骤去除，不仅产生大量的废液和消耗大量的移液枪枪头，同时也大大增加了提取时间，降低了实验人员的工作效率。因此，亟需开发一种可快速裂解释放病毒核酸且不含表面活性剂和胍盐的无泡裂解组合物，在降低样本被污染的同时省去多次清洗纯化步骤，从而可以节省核酸提取的时间。
发明内容
本发明中提供一种能快速裂解释放病毒等核酸的无泡裂解组合物，呈酸性，不含表面活性剂和胍盐成分，在一定残留量下对下游检测反应几乎无抑制作用，从而无需经多次清洗纯化即可直接进行洗脱而获取核酸。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种裂解组合物，含有如下组分：
(1)精氨酸，浓度为0.5-1.5M；
(2)无机盐，浓度为0.2-1M；
(3)缓冲液；
(4)pH为2-6。
优选地，裂解组合物中还含有金属螯合剂，浓度为5-10mM。
优选地，无机盐选自柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾及其任意混合物。
优选地，缓冲液为Tris缓冲液或MES缓冲液。更优选地，缓冲液的浓度为10-30mM。
优选地，本发明的裂解组合物还含有pH调节剂。
优选地，金属螯合剂为EDTA和/或EDTA的盐(例如EDTA二钠、EDTA四钠、EDTA二钠钙等)。
优选地，pH调节剂为氢氧化钠水溶液和/或盐酸水溶液，更优选为1M氢氧化钠水溶液和/或1M盐酸水溶液。
优选地，将pH值调节至约4。
优选地，裂解组合物由以上组分组成。
本领域技术人员可以理解，可以通过本领域已知的方法制备本发明的上述裂解组合物。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，含有本发明的裂解组合物。优选地，裂解组合物的体积为1-10ml，更优选2-3ml。
本发明的裂解组合物和试剂盒可用于裂解释放微生物核酸，进而可用于检测微生物。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种裂解释放微生物核酸的方法，其中，使用本发明的裂解组合物处理样本。本领域技术人员可以理解，本发明的方法并非以疾病的诊断为目的。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种检测微生物的方法，其中，使用本发明的裂解组合物处理样本裂解释放微生物核酸。本领域技术人员可以理解，本发明的方法并非以疾病的诊断为目的。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及本发明的裂解组合物在制备用于裂解释放微生物核酸或检测微生物的试剂中的用途。
优选地，微生物为病毒、细菌、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体或螺旋体。
优选地，核酸为DNA和/或RNA。
优选地，所述微生物为病毒，进一步优选为冠状病毒或流感病毒，更优选为新型冠状病毒。
优选地，样本为血液、血清、血浆、淋巴液、唾液、脱落细胞或其上清(例如来自于咽拭子或鼻咽拭子等)等，也可以为物品或食品擦拭样本。
本发明的裂解组合物呈酸性，不含表面活性剂和胍盐成分，在核酸提取过程中大大降低了样本污染的风险；在一定残留量下对下游检测几乎无抑制，从而无需经多次清洗纯化即可直接进行洗脱而获取核酸；可在室温条件下使用，无需加热或蛋白酶处理等额外步骤，无任何有毒成分或有机溶剂，绿色环保，操作简便，且裂解提取效果可与市场上主流裂解试剂产品持平。
附图说明
图1为本发明实施例1的裂解组合物A-D与阳性对照、阴性对照裂解释放的病毒核酸经RT-qPCR扩增检测的对比图。
图2为本发明实施例3在洗脱液中添加不同量的本发明实施例1的裂解组合物A、D和阳性对照、阴性对照后进行RT-qPCR扩增检测的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1裂解组合物的制备
首先配制Tris缓冲液或MES缓冲液，然后加入其它组分，获得如下裂解组合物：
(1)裂解组合物A，含有：
0.6M精氨酸，0.3M柠檬酸钠，10mM Tris缓冲液，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH调节至约3.0。
(2)裂解组合物B，含有：
1M精氨酸，0.5M NaCl，20mM Tris缓冲液，5mM EDTA，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH调节至约6.0。
(3)裂解组合物C，含有：
1.3M精氨酸，0.5M KCl，25mM Tris缓冲液，10mM EDTA，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH调节至约3.0。
(4)裂解组合物D，含有：
1M精氨酸，1M NaCl，10mM MES缓冲液，10mM EDTA，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH值调节至约4.0。
(5)裂解组合物E，含有：
1.5M精氨酸，0.8M KCl，20mM MES缓冲液，6mM EDTA，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH值调节至约4.0。
(6)裂解组合物F，含有：
0.5M精氨酸，1M柠檬酸钠，25mM MES缓冲液，5mM EDTA，使用1M氢氧化钠或盐酸水溶液，将pH值调节至约2.0。
实施例2裂解释放PEDV病毒核酸
采用实施例1制备的A、B、C、D四种裂解组合物裂解释放PEDV病毒核酸，并采用市售磁珠法核酸提取试剂盒(友康生物科技(北京)股份有限公司，MK0102-100)提取病毒核酸，以市售裂解试剂(友康生物科技(北京)股份有限公司，灭活型采样管MT0501-7-3)作为阳性对照，其主要成分为：Tris-HCl缓冲液，异硫氰酸胍，尿素，酚红钠盐；另，以超纯水为裂解液作为阴性对照，通过RT-qPCR扩增检测评估裂解释放病毒核酸的效果。
具体步骤如下：
1.取900μL实施例1制备的四种裂解组合物、阳性对照及超纯水分别置于1.5mL离心管中，加入100μL等浓度的实验室培养的PEDV病毒液混合均匀，置于摇床37℃，150rmp条件下20min。
2.取300μL上述混合液，加入300μL异丙醇和20μL磁珠，混合均匀并静置后进行磁分离。
3.加入800μL纯化液进行清洗，而后进行磁分离，将残留液滴吸取干净并晾干。
4.加入100μLdepc水洗脱，室温静置5min，进行磁分离，洗脱液即为提取的核酸，用于RT-qPCR扩增检测。
在RT-qPCR中，裂解释放的目标核酸越多，起始拷贝数越高，会越快观察到荧光信号显著增加，则对应的Ct值越小。RT-qPCR扩增检测结果见图1。根据图1，本发明的裂解组合物A、B、C、D的Ct值与阳性对照相比裂解效果相当，而阴性对照并未出Ct值。
实施例3
裂解试剂的残留量对RT-qPCR扩增的影响。
使用实施例2的核酸提取试剂盒进行核酸提取，获取十二管洗脱液，每管100μL，分别加入4μL、6μL、8μL和10μL实施例1的裂解组合物A、D、实施例2的市售裂解试剂(阳性对照)和Depc水(阴性对照)，而后用于RT-qPCR扩增检测。
如图2所示，随着添加量的增大，裂解组合物A和D对后续检测几乎无抑制作用，同等添加量下，市售裂解试剂由于含有表面活性剂和高浓度的胍盐，对后续检测的抑制作用要远大于裂解组合物A和D。
实施例4 H1N1病毒感染的MDCK细胞的裂解和病毒核酸提取
具体步骤如下：
1、MDCK细胞复苏和传代，采用含有10％FBS的高糖DMEM培养基对MDCK细胞进行复苏和传代，连续培养3代。
2、第三代细胞消化后离心，并进行细胞铺板，将细胞接种至6孔板中，细胞的接种密度控制为30％融合度。
3、24小时后，采用H1N1病毒感染MDCK细胞。
4、病毒孵育完成后，采用PBS清洗细胞5遍，然后更换为含有2％FBS的高糖DMEM培养基维持细胞生长状态。
5、感染24小时后，细胞尚未发生病变效应。消化细胞，并收集后进行离心，800rpm离心5min，弃去上清，得到细胞沉淀，加1mL实施例1中的裂解组合物C重悬细胞。
6、取300μL细胞悬液，使用实施例2的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取的核酸用于RT-qPCR扩增检测。
如下表1所示，本发明的裂解组合物C裂解H1N1病毒感染的MDCK细胞提取病毒核酸，测试后所得Ct值与实施例2市售裂解试剂相持平。
表1H1N1病毒感染的MDCK细胞的裂解和核酸提取
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种裂解组合物，其特征在于，含有如下组分：
(1)精氨酸，浓度为0.5-1.5M；
(2)无机盐，浓度为0.2-1M；
(3)缓冲液；
(4)pH为2-6。
优选地，无机盐选自柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾及其任意混合物。
优选地，缓冲液为Tris缓冲液或MES缓冲液。
优选地，缓冲液的浓度为10-30mM。
2.如权利要求1所述的裂解组合物，其特征在于，还含有金属螯合剂，浓度为5-10mM。
优选地，金属螯合剂为EDTA和/或EDTA的盐(例如EDTA二钠、EDTA四钠、EDTA二钠钙等)。
3.如权利要求1所述的裂解组合物，其特征在于，还含有pH调节剂。
优选地，pH调节剂为氢氧化钠水溶液和/或盐酸水溶液。
4.如权利要求1-3中任一项所述的裂解组合物，其特征在于，所述裂解组合物由所述组分组成。
5.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1-4中任一项所述的裂解组合物。
优选地，裂解组合物的体积为1-10ml，更优选2-3ml。
6.一种裂解释放微生物核酸的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4中任一项所述的裂解组合物处理样本。
7.一种检测微生物的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4中任一项所述的裂解组合物处理样本裂解释放微生物核酸。
8.如权利要求1-4中任一项所述的裂解组合物在制备用于裂解释放微生物核酸或检测微生物的试剂中的用途。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法或用途，其特征在于，所述微生物为病毒、细菌、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体或螺旋体。
优选地，所述微生物为病毒，进一步优选为冠状病毒或流感病毒，更优选为新型冠状病毒。
优选地，所述核酸为DNA和/或RNA。
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