JP2014526255A - 獣医学的全血試料から核酸を単離するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、獣医学的全血試料から核酸を単離するための方法に関する。特に、それは、獣医学的全血試料から病原体核酸を単離するための方法を提供する。
種々の試料から核酸を単離するための多数の方法が、先行技術において知られている。しかしながら、それぞれの方法は、全ての試料について同等にうまくは働かない。例えば、核酸は、1つの方法を用いて、組織、血漿、血清、または尿などの特定の試料から効率的に単離することができる。しかしながら、前記方法は、全血試料などの他の試料から核酸を効率的に単離することができない場合がある。特に、ウマまたはウシなどの大きな家畜から得られた獣医学的全血試料などの、多い細胞数、タンパク質および/または脂質含有量を含む生物学的試料は、特に難題をもたらす。先行技術において知られた方法は、それぞれの困難な試料から核酸を効率的に単離することにおいて満足できない場合が多い。例えば、現行のスピンカラムに基づいた核酸単離方法は、獣医学的全血試料、特に、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびブタなどの大きな家畜から得られる血液試料を処理することに対する適合性が極めて限定されている。それぞれの動物全血試料から核酸を単離するための確立された核酸単離方法を用いる場合の主要な問題は、スピンカラムが、これらの試料の特別な組成により容易に詰まることである。特に、多い細胞数、大量のタンパク質および/または脂質は、この目詰まり効果の原因であり得る。このカラムは、血液由来物質で妨げられ、低い精製効率を生じる。結果として、より少数の核酸が単離され、またはさらには全く核酸が単離されない。さらに、単離された核酸は、不純物/阻害性物質で汚染されている場合が多く、それらの物質は、単離された核酸の下流でのパフォーマンスを、特に、RT−PCRなどの増幅反応において、損なう。これは、単離された核酸における特定の標的核酸の検出を困難にする。さらに、観察される目詰まり効果は、1つの試料調製において少量の試料しか処理することができないという結果をもたらす。通常、試料のインプット体積は、目詰まりを低減するために(例えば、200μlの代わりに、例えば、25μl〜50μlへ)制限されなければならない。
本発明は、特定の非イオン性界面活性剤が、結合混合物に加えられた場合には、カラムの目詰まりを防止することができるという発見に基づいている。本発明者らは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルの添加が、それぞれの界面活性剤を組み入れない先行技術の単離方法に関して観察される目詰まりを防止することを見出した。したがって、本発明は、先行技術において知られていた問題の解決を提供する。特定の非イオン性界面活性剤を結合混合物に加えた場合、カラムの目詰まりを防止することができることは非常に予想外であり、結合混合物が、例えば、一般的に用いられるTriton X−100またはTween 20などの他の非イオン性界面活性剤を含む場合、観察される目詰まり効果が起こるからである。したがって、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤のグループ内の界面活性剤の選択が、膜の目詰まりおよび核酸単離の効率へそのような強い影響を生じるだろうことは、大いに驚きであった。実施例によって示されているように、本発明による方法は、高効率、高純度、および高い信頼性を以て、獣医学的全血試料に含まれる核酸を単離することを可能にする。特に、前記方法は、獣医学的全血試料からの病原体核酸の効率的単離を可能にする。これは、血漿、尿、または組織などの他の獣医学的試料から核酸を効率的に単離することを可能にするにしても、獣医学的全血試料から核酸、特に病原体核酸を効率的に単離することができない先行技術方法を凌ぐ、かなりの改善である。
a)以下を含む結合混合物を調製するステップ:
−溶解した該試料
−少なくとも1つのカオトロピック剤
−少なくとも1つのアルコール
−少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル;
b)核酸結合性固相を含むカラムに該結合混合物を通過させ、それにより、核酸を該核酸結合性固相に結合させるステップ;
c)必要に応じて、核酸を、該固相に結合した状態で、洗浄するステップ;
d)必要に応じて、核酸を該固相から溶出するステップ。
第1の態様によれば、本発明は、少なくとも以下のステップを含む、獣医学的全血試料から核酸を単離するための方法を提供する:
a)以下を含む結合混合物を調製するステップ:
−溶解した該試料
−少なくとも1つのカオトロピック剤
−少なくとも1つのアルコール
−少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル;
b)核酸結合性固相を含むカラムに該結合混合物を通過させ、それにより、核酸を該核酸結合性固相に結合させるステップ;
c)必要に応じて、核酸を、該固相に結合した状態で、洗浄するステップ;
d)必要に応じて、核酸を該固相から溶出するステップ。
i)獣医学的全血試料を溶解するステップ;および
ii)1つまたは複数の添加剤を、好ましくは結合溶液の形で、溶解した該試料に加え、それにより以下を含む結合混合物を調製するステップ:
−溶解した該試料
−少なくとも1つのカオトロピック剤
−少なくとも1つのアルコール
−少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル。
種々の獣医学的試料(および陽性対照として、PBS緩衝液)に、BVDVウイルス粒子をスパイクし、種々の結合条件を用いる種々のプロトコールで、核酸を単離した。全てのプロトコールにおいて、プロテイナーゼK(20μl)を溶解のために加えた。
様々な種由来の200μlの全血試料(および陽性対照として、0.9%塩化ナトリウム溶液)に、BVDV粒子をスパイクした。前記試料を、塩酸グアニジン(GuHCL)およびTween 20を含有する結合混合物を用いる標準方法か、または結合混合物中に種々の濃度のチオシアン酸グアニジン(GTC)およびポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを用いる本発明の教示の種々の変形のいずれかで処理した。溶解を、プロテイナーゼKの添加によって支援した:
方法A:結合混合物中、1.81M GuHCl、32.2%EtOH、6.5%Tween 20
方法B:結合混合物中、1.9M GTC、24%イソプロパノール、8.5%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル
方法C:結合混合物中、1.5M GTC、17%イソプロパノール、7.6%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、0.3%SDS
方法D:結合混合物中、1.5M GTC、19%イソプロパノール、6.8%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、0.3%SDS。
ウシおよびヒツジの血液に、BHV1ウイルス粒子をスパイクし、本発明による方法の種々の変形を用いて処理した。プロテイナーゼK、ならびに非イオン性界面活性剤(Tween 20およびTriton X−100)の混合物およびカオトロピック塩(GuHCL)を含む溶解溶液を用いて、試料を溶解した。結合について、カオトロピック塩(GTC)、イソプロパノール、およびポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを含む、種々の体積の結合溶液を加えた。それにより、種々の濃度のカオトロピック塩(2.14M〜2.36M)、アルコール(12.8%〜23.4%)、およびポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(3.8%〜7%)を有する種々の結合混合物が得られた。種々の濃度のポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを用いて、目詰まりは、効率的に防止することができた。本発明による方法の全ての種々の変形は、図6として提示された結果により示されているように、試験された全血試料から核酸を単離することができた。PCR反応の阻害がないことは、2.5μlと10μlのテンプレート体積の間での約2のct差によって示されている。したがって、本発明による方法は、種々の濃度のカオトロピック塩、アルコール、およびポリオキシエチレン(20)セチルエーテルで働く。
図5および6はさらに、本発明による方法が、種々の動物全血試料から細胞核酸、ここではゲノムDNAを単離するのに適していることを実証している。図5および6は、実施例1のプロトコール2を用いて処理された6つの異なる動物血液試料の光度測定値およびエチジウムブロマイド(ethitiumbromide)染色アガロースを示す。ゲルは、自動の常磁性シリカ粒子に基づいたDNA単離手順(QIAsymphony DNA血液)との比較を示す。各試料について3つの反復物が示されている。
核酸単離プロトコールが確実に働き、かつそれゆえに、異なるユーザーによって等しく効果的に用いられ得ることも重要である。前記ユーザー間一致性を試験するために、種々の試料にS.entericaをスパイクした。細菌DNAを、実施例1のプロトコール2を用いて、抽出した。同じ試料が、異なるユーザーにより並行して処理された。結果は図7に示されている。高いユーザー間一致性が、本発明による方法に関して達成され、そのことは、医学/診断分野にとって非常に重要である。
本発明によるこのプロトコールに従って、20μlのプロテイナーゼKを2ml微量遠心管へピペッティングで加える。200μlの全血試料を該プロテイナーゼKに加える。その後、5Mより上の濃度での塩酸グアニジンおよび約15%の濃度での非イオン性界面活性剤(Tween 20およびTriton X−100)の混合物を含む溶解緩衝液を加える。効率的な溶解を確実にするために、試料を溶解緩衝液と混合して、均一な溶液を生じさせる。それにより、約2M GuHCL、約5%非イオン性界面活性剤(Tween 20およびTriton X−100)を含む溶解混合物が得られる。グラム陽性細菌由来の標的核酸の単離が意図される場合には、プロテイナーゼK処理の前に、陰イオン性界面活性剤、好ましくはSDS(例えば、緩衝液ATL(QIAGEN)を用いることができる)を含む溶解緩衝液で試料を前処理することが推奨される。
Claims (15)
- 少なくとも以下のステップを含む、獣医学的全血試料から核酸を単離するための方法:
a)以下を含む結合混合物を調製するステップ:
−溶解した該試料
−少なくとも1つのカオトロピック剤
−少なくとも1つのアルコール
−少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル;
b)核酸結合性固相を含むカラムに該結合混合物を通過させ、それにより、核酸を該核酸結合性固相に結合させるステップ;
c)必要に応じて、該核酸を、該固相に結合した状態で、洗浄するステップ;
d)必要に応じて、該核酸を該固相から溶出するステップ。 - i)前記ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、およびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群から選択され;
ii)該ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン(2)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(10)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(2)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、および/もしくはポリオキシエチレン(100)ステアリルエーテルを含む群から選択され;
ii)該ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、ポリオキシエチレンセチルエーテルであり;ならびに/または
iii)該ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテルである、
請求項1に記載の方法。 - 前記ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、前記結合混合物中に、約0.5%〜約20%、約2%〜約15%、約3%〜約12%、好ましくは4%〜約10%から選択される範囲にある濃度で含まれる、請求項1〜2の一項または複数の項に記載の方法。
- 前記カオトロピック剤が以下の特性の1つまたは複数を有する、請求項1〜3の一項またはそれより多くの項に記載の方法:
i)それはカオトロピック塩である;
ii)それは、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群から選択されるカオトロピック塩である;ならびに/または
iii)それは、前記結合混合物中、約0.1M〜最高7M、約0.2M〜6M、約0.5M〜4M、および約0.5M〜3Mから選択される範囲にある濃度で含まれる。 - 前記結合混合物中に含まれる少なくとも1つの前記アルコールが、以下の特性の1つまたは複数を有する、請求項1〜4の一項またはそれより多くの項に記載の方法:
i)それは、1〜5個の炭素原子を有する短鎖の分岐型または非分岐型アルコールである;
ii)それは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールから選択される;ならびに
iii)該アルコールは、該結合混合物中に、少なくとも10%、少なくとも15%、および少なくとも20%から選択される濃度で含まれる。 - 単離された前記核酸が病原体核酸を含む、請求項1〜5の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
- ステップa)における前記結合混合物の調製が以下のステップを含む、請求項1〜6の一項またはそれより多くの項に記載の方法:
i)前記獣医学的全血試料を溶解するステップ;ならびに
ii)1つ以上の添加剤を、好ましくは結合溶液の形で、溶解した該試料に加え、それにより以下を含む結合混合物を調製するステップ:
−溶解した該試料
−少なくとも1つのカオトロピック剤
−少なくとも1つのアルコール、および
−少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル。 - 前記全血試料が、好ましくは抗凝固剤の使用によって、安定化される、請求項1〜7の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
- 前記試料の溶解が以下の1つ以上を含む、請求項1〜8の一項またはそれより多くの項に記載の方法:
i)少なくとも1つのタンパク質分解酵素の添加;
ii)少なくとも1つのカオトロピック剤の添加;
iii)少なくとも1つの界面活性剤の添加;
iv)少なくとも1つのキレート化剤の添加;
v)加熱、および/または
vi)振盪。 - 前記試料の溶解が、少なくとも1つのカオトロピック剤および少なくとも1つの界面活性剤を含む溶解溶液の添加、ならびに少なくとも1つのタンパク質分解酵素の添加を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記獣医学的全血試料が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマ、およびブタから選択される大きな家畜から得られる、請求項1〜10の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
- 前記キレート化剤が、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジニトリロ四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA)、およびN,N−ビス(カルボキシメチル)グリシン(NTA)から選択される、請求項9〜11の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
- 前記結合混合物における条件が、結合溶液を、溶解した前記試料に加えることにより確立され、該結合溶液が、以下の特性の1つまたは複数、好ましくは少なくとも2つを有する、請求項1〜12の一項またはそれより多くの項に記載の方法:
i)それは、約0.1M〜最高7M、約0.2M〜6M、約0.5M〜4M、および約0.5M〜3Mから選択される濃度で少なくとも1つのカオトロピック塩を含む;
ii)それは、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、および/もしくはポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを、約0.5%〜約20%、約2%〜約15%、約3%〜約12%、好ましくは4%〜約8%から選択される範囲にある濃度で含む;
iii)それは少なくとも1つの緩衝剤を含む;ならびに/または
iv)それは、1〜5個の炭素原子を有する短鎖の分岐型または非分岐型アルコールを含む。 - 請求項1〜13の一項またはそれより多くの項に記載の方法を実施する工程を含む、獣医学的全血試料から病原体核酸を単離するための方法。
- 単離された前記核酸が病原体核酸を含み、該病原体核酸が、ウイルス、細菌、および寄生生物からなる群から選択される病原体から得られる、請求項1〜14の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
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