JP2022069447A - 核酸保存組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸は、細胞性および/または無細胞核酸を含む生物学的試料から抽出することができる。抽出された核酸を、系図分析を含む様々な分析目的に使用することができる。唾液の試料採取は、比較的非侵襲的であるので、唾液からの核酸の抽出は特に有用であり得る。
前述の範囲および内容ならびに以下記載の説明および特許請求の範囲の理解を助けるために、選択されたいくつかの用語を以下に定義する。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下の実施形態の説明は、本開示の1つ以上の実施形態に関連する開示を含む。したがって、いくつかの実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、以下の実施例に開示される特徴を含み得る。言い換えれば、以下の実施例に開示される特徴は、本明細書に開示される任意の1つ以上の実施形態に含まれ得る、かつ/または組み込まれ得る。
本開示のいくつかの実施形態は組成物を含む。組成物は、精製および分析のために実行可能な核酸源として痰または唾液を提供することができる。組成物は、核酸の化学的安定化ならびにデオキシリボヌクレアーゼを含むヌクレアーゼおよび微生物増殖の阻害の有利な特性を提供する。唾液試料中の核酸の化学的安定化は、緩衝剤、酸、キレート剤、粘液溶解剤、カオトロピック剤、界面活性剤、およびアルコールを使用することによって達成され得る。
少なくとも一実施形態では、組成物は担体を含み得る。好ましくは、担体は、液体担体または溶媒、より好ましくは水性担体または溶媒、さらにより好ましくは水であり得る。最も好ましくは、担体は、精製され、ろ過(例えば、0.2ミクロンろ過)され、蒸留され、かつ/または脱イオンされた水であり得るか、またはそれを含み得る。したがって、組成物は担体を含み得る。担体は、ろ過水、精製水、蒸留水、または脱イオン水などの水であり得るか、またはそれを含み得る。
組成物は1つ以上のカオトロピック剤を含み得る。1つ以上の実施形態では、カオトロピック剤(複数可)はタンパク質変性剤であり得る。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、塩化グアニジニウムおよび/またはチオシアン酸グアニジニウムからなる群から選択され得る。したがって、少なくとも一実施形態では、組成物はカオトロピック剤を含み得る。好ましくは、カオトロピック剤は、グアニジン(もしくはグアニジニウム)またはその適切な塩であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、カオトロピック剤は、チオシアン酸グアニジンであり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、カオトロピック剤は、チオシアネートであり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、カオトロピック剤は、グアニジンイソチオシアネート、塩化グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化グアニジニウムなどであり得るか、またはそれを含み得る。
組成物は、1つ以上の緩衝剤(または緩衝液、pH緩衝液など)を含み得る。緩衝剤の例としては、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Trisとしても知られる;Tris塩基、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール、THAM、トロメタモール)またはその適切な配合物(例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩またはTris-HCl)、Trizma(登録商標)塩基(例えば、水中Tris40%(w/w)のストック溶液)、HEPES、BES、MOPS、HEPES、TAE、TBE、リン緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、カコジル酸ナトリウム緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、緩衝剤は、Tris-HClであり得るか、またはそれを含み得る。最も好ましくは、緩衝剤は、Trizma(登録商標)塩基であり得るか、またはそれを含み得る。
少なくとも一実施形態では、組成物はキレート剤(またはキレート化剤)を含み得る。好ましくは、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその適切な塩および/もしくは水和物であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、キレート剤は、EDTA二ナトリウム塩であり得るか、もしくはそれを含み得るか、またはそれとして提供され得る。さらにより好ましくは、キレート剤は、EDTA二ナトリウム(塩)二水和物であり得るか、もしくはそれを含み得るか、またはそれとして提供され得る。少なくとも一実施形態では、キレート剤は、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸(EGTA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン(または1,2-ジアミノエタン)などであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、キレート剤は、対イオン(例えば、ナトリウム)を含むか、含有するか、またはそれと共に提供される。少なくとも一実施形態では、キレート剤は、水和物(例えば、二水和物)を含むか、含有するか、またはそれとして提供される。
少なくとも一実施形態では、組成物は界面活性剤または洗浄剤を含み得る。好ましくは、界面活性剤は、ラウロイルサルコシネートであり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、界面活性剤は、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(SLS)であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリソルベート(Tween(商標))、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレン、ソルビタン、オクトキシノール(Triton X100(商標))、N、N-ジメチルドデシルアミン-N-オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(HTAB)、ポリオキシル10ラウリルエーテル、胆汁酸塩(デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム)、ポリオキシルヒマシ油(Cremophor(商標))、ノニルフェノールエトキシレート(Tergitol(商標))、シクロデキストリン、レシチン、塩化メチルベンゼトニウム(Hyamine(商標))などからなる群から選択される1つ以上の構成要素であり得るか、またはそれを含み得る。組成物は、尿素、過塩素酸塩、ドデシル硫酸(ナトリウム)(SDS)、および/またはラウロイルサルコシン酸(ナトリウム)(SLS)、好ましくはラウロイルサルコシン酸ナトリウム(SLS)などの界面活性剤または洗浄剤を含み得る。いくつかの実施形態では、SLSは、SDSまたは他の(溶解性が低い)界面活性剤よりも好ましい可能性がある。
少なくとも一実施形態では、組成物はアルコールを含み得る。好ましくは、アルコールは、エタノールであり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、アルコールは、エタノールと1つ以上の追加の化学物質または構成要素との混合物であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、1つ以上の追加の化学物質または構成要素は、イソプロパノールであり得るか、またはそれを含み得る。さらにより好ましくは、アルコールは、エタノールとイソプロパノールとの混合物であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、1つ以上の追加の化学物質または構成要素は、メタノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノールなどであり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、アルコールは、特別変性アルコール(SDA)であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、アルコールは、約95%(v/v)のエタノールと約5%(v/v)イソプロパノールとの混合物を含むことが当業者に知られているSDA 3Cであり得るか、またはそれを含み得る。組成物は、エタノール、メタノール、プロパノール、および/またはイソプロパノールなどのアルコール、好ましくは特別変性アルコール(SDA)またはエタノールと、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、トリフルオロエタノール、フェノール、または2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールなどの別のアルコールとの混合物、より好ましくはエタノールとイソプロパノールとの混合物、さらにより好ましくはエタノールとイソプロパノールなどの1つ以上の追加の化学物質または構成要素との混合物を含み得る。
少なくとも一実施形態では、組成物は酸を含み得る。好ましくは、酸は、塩酸(HCl)であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、酸は、臭化水素酸(HBr)、過塩素酸(HClO4)、硝酸(HNO3)、または硫酸(H2SO4)であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、酸は、炭酸(H2CO3)または酢酸(CH3COOH)であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、酸は、リン酸(H3PO4)、ホウ酸(H3BO3)、またはエメラルドセーフ酸(ESA)などであり得るか、またはそれを含み得る。
少なくとも一実施形態では、組成物は粘液溶解剤を含み得る。1つ以上の実施態様では、粘液溶解剤は、還元剤であり得るか、またはそれを含み得る。好ましくは、粘液溶解剤は、アセチルシステイン(すなわち、N-アセチル-L-システイン、N-アセチル-D-システイン、およびラセミ体N-アセチルシステインを含むN-アセチルシステイン(NAC)またはN-アセチル-L-システインおよびN-アセチル-D-システインの(ラセミ)混合物)であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、粘液溶解剤は、N-アセチル-L-システインであり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも一実施形態では、粘液溶解剤は、N-アセチルシステイン(N-アセチル-L-システイン)、アスコルビン酸、ジチオナイト、エリソルベート、システイン、グルタチオン、ジチオトレイトール、2-メルカプトエタノール、ジエリスリトール、樹脂担持チオール、樹脂担持ホスフィン、ビタミンE、および/またはトロロックス、またはそれらの塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、カリウムヨウ化物、塩化アンモニウム、グアイフェネシン(guaiphenesin)(またはグアイフェネシン(guaifenesin))、トルバルサム、バサカ、アンブロキソール、カルボシステイン、エルドステイン、メシステイン、ドルナーゼアルファなどであり得るか、またはそれを含み得る。組成物は、1つ以上の粘液溶解剤を含み得る。好ましくは、粘液溶解剤は、アスコルビン酸、エリソルベート、N-アセチルシステイン、ジチオトレイトール、または2-メルカプトエタノールであり、最も好ましくは、粘液溶解剤は、N-アセチルシステインである。
少なくとも一実施形態は視覚的指示薬を含み得る。好ましくは、視覚的指示薬は着色剤であり得るか、またはそれを含み得る。より好ましくは、視覚的指示薬は、染料または着色染料であり得るか、またはそれを含み得る。さらにより好ましくは、視覚的指示薬は、青色染料であり得るか、またはそれを含み得る。最も好ましくは、視覚的指示薬は、FD&C Blue No.1であり得るか、またはそれを含み得る。組成物は、視覚的指示薬、好ましくは着色剤、より好ましくは着色染料、さらにより好ましくは青色染料、さらにより好ましくはFD&C Blue No.1を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物は抗菌剤を含み得る。いくつかの実施形態では、前述の構成要素の1つ以上は、抗菌活性を示し得る。例えば、いくつかの実施形態では、アルコール、カオトロピック剤、界面活性剤、および/または粘液溶解剤は、抗菌性であり得るか、または抗菌活性を示し得る。したがって、特定の実施形態は、別個の抗菌剤(例えば殺菌剤および/または静菌剤)を含む必要はない。1つ以上の実施態様では、アルコール(例えば、SDA 3C)の抗菌特性は、アルコールが本開示の該実施形態(複数可)において提供されるより低い濃度(例えば、約17.73%(w/w)、または5~25%(w/w)、10~22%(w/w)、10~20%(w/w)、15~19%(w/w)、16~18.5%(w/w)、17~18.25%(w/w)、または17.5~18%(w/w)(またはその間の任意の値もしくは値の範囲))でさえ持続する。
いくつかの実施形態は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、オリゴ(ビニルスルホン酸)、ポリ(ビニルスルホン酸)、オリゴ(ビニルホスホン酸)、およびポリ(ビニルスルホン酸)、またはそれらの塩などのリボヌクレアーゼ阻害剤、またはリボヌクレアーゼの阻害剤を含む。特定の(例えば、好ましい)実施形態では、組成物は、リボヌクレアーゼ阻害剤またはリボヌクレアーゼの阻害剤を含まないか、または(例えば、内因性RNAse阻害活性を有し得る、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤以外に)1つ以上(例えば、任意)のリボヌクレアーゼ阻害剤またはリボヌクレアーゼの阻害剤を(実質的に)含まない。したがって、少なくとも一実施形態は、1つ以上の(任意の)リボヌクレアーゼ阻害剤、またはリボヌクレアーゼの阻害剤を(実質的に)含まない。1つ以上の実施形態は、(例えば、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤以外に)リボヌクレアーゼ阻害剤、またはリボヌクレアーゼの阻害剤を(実質的に)含まない。
いくつかの実施形態はプロテアーゼを含む。特定の(例えば、好ましい)実施形態では、組成物は、プロテアーゼを含まないか、または1つ以上の(例えば、任意の)プロテアーゼを(実質的に)含まない。したがって、少なくとも一実施形態は、1つ以上の(任意の)プロテアーゼを(実質的に)含まない。いかなる理論にも縛られることなく、プロテアーゼ(またはタンパク質分解酵素、ペプチダーゼまたはプロテイナーゼ)は、加水分解によって1つ以上のペプチド結合を切断し、それによってタンパク質をより小さいタンパク質断片(もしくはペプチド)または個々のタンパク質サブユニット(もしくはアミノ酸)に変換する酵素の一種である。
いくつかの実施形態は、1つ以上のタンパク質変性剤を含む。例えば、少なくとも一実施形態では、(i)カオトロピック剤は、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。少なくとも一実施形態では、(ii)界面活性剤/洗浄剤は、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。少なくとも一実施形態では、(iii)アルコールは、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。少なくとも一実施形態では、(iv)粘液溶解剤は、タンパク質(複数可)が接近可能なジスルフィド結合または架橋を含有する場合などに、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。いくつかの実施形態では、(i)カオトロピック剤、(ii)界面活性剤/洗浄剤、(iii)アルコール、および(iv)粘液溶解剤の2つ以上が、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。いくつかの実施形態では、(i)カオトロピック剤、(ii)界面活性剤/洗浄剤、(iii)アルコール、および(iv)粘液溶解剤のそれぞれまたは全てが、タンパク質変性剤であり得るか、それを含み得るか、またはそれとして機能し得る(またはタンパク質を変性させるか、もしくはタンパク質変性活性を有するかもしくは示す)。
本開示は実施形態は、水性担体、カオトロピック剤、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、アルコール、酸、および粘液溶解剤を含む、核酸保存組成物(または配合物)を含む。一実施形態は、任意選択の視覚的指示薬をさらに含む。実施形態は、20~50%(w/w)のカオトロピック剤、1~5%(w/w)の緩衝剤、0.05~2.5%(w/w)のキレート剤、0.05~2.5%(w/w)の界面活性剤、5~25%(w/w)のアルコール、0.005~0.25%(w/w)の粘液溶解剤、pH6.5~9.5まで適量の酸、および100%まで適量の担体を含み得る。実施形態は、0.005~2.5%(w/w)の視覚的指示薬をさらに含み得る。
いくつかの実施形態は、生物学的試料保存キットなどのキットを含む。具体的には、1つ以上の実施形態では、本発明の組成物は、キットに組み込まれ得る。キットは、例えば、本明細書に開示および/または記載される組成物、ならびに試料採取装置を含み得る。少なくとも一実施形態では、組成物は、試料採取装置の一部に配置され得る。例示的な試料採取装置は、試料採取部分を有する容器またはバイアル(例えば、管)を含み得る。例えば、容器は、内部区画を少なくとも部分的に囲む外壁を含み得る。内部区画は、生物学的試料を添加され得る組成物を含有し得る。あるいは、試料が区画に添加され得、組成物が採取後の試料に添加され得る。例えば、装置は、試料採取前または試料採取後に、区画に組成物を添加するための組成物ディスペンサーを含み得る。少なくとも一実施形態では、ディスペンサーは、装置の開口部を閉鎖または密閉するためのキャップを含み得る。開口部は、区画に通じているか、または区画と流体連通していてもよい。キャップは、組成物が容器の区画に添加されるまで組成物を保持するための区画を有し得る。
いくつかの実施形態は、本開示の組成物を製造する方法を含む。実施形態は、本明細書に記載の担体を提供または得ることを含み得る。実施形態は、適切な量の本明細書に記載の1つ以上の構成要素または成分(例えば、本明細書に記載の最終濃度になるように)を担体に添加することを含み得る。実施形態は、本明細書に記載の1つ以上の構成要素または成分の記載量のストック溶液を担体に添加することを含み得る。
いくつかの実施形態は、核酸を保存および/または安定化する方法を含む。方法は、核酸を含有する生物学的試料を得ることと、本開示の組成物を生物学的試料と組み合わせることと、を含み得る。少なくとも一実施形態では、生物学的試料は、ムチン含有体液または組織、例えば痰または唾液であり得る。方法は、(例えば、粘液溶解剤または還元剤を用いてムチンに固有のジスルフィド結合を還元することによって)ムチン含有体液または組織の粘度を低下させることを含み得る。
本開示のいくつかの実施形態は、(例えば、ヒト対象などの対象から)生物学的試料を取得、得る、かつ/または採取することを含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、(ヒト)唾液であり得るか、またはそれを含み得る。(ヒト)試料は、((微生物)汚染を避けるために)無菌的に採取され得る。1つ以上の実施形態では、試料は、試料採取装置またはその試料容器に採取され得る。いくつかの実施形態では、試料採取装置または容器は、キットの一部であり得、かつ/または本開示の組成物を含み得る。実施形態は、試料を本開示の組成物と接触させることを含み得る。
本開示のいくつかの実施形態は、生物学的試料から核酸を抽出することを含む。以下は、本開示の組成物と共に使用するのに適している可能性がある様々な様式の抽出または抽出手順の非網羅的列挙または説明である。
有機フェノールクロロホルム抽出は、研究室と臨床室の両方で依然として採用されているメカニズムであり、組織源に関しては試料の種類に依存する。高分子量ゲノムDNAを抽出するために、手動のフェノール/クロロホルム抽出とそれに続く有機溶媒汚染の除去を補助するためのクロロホルム逆抽出を行う。
本開示の組成物を含有する唾液採取キットから以前に抽出された10個のDNA試料、および既存の唾液採取キットからの最大6個の試料を試験に使用した。本発明の唾液採取キットを使用して、さらに23個の試料を新たに採取した。23個の試料のそれぞれを、二連の700μlアリコートで抽出した。DNAの品質を評価するために標準QCを実施した。
いくつかの実施形態は、抽出された核酸を分析することを含む。抽出された核酸を分析するために、いくつかの方法が利用可能である。以下は、本開示の組成物と共に使用するのに適している可能性がある抽出された核酸を分析するための様々な方法の非網羅的列挙または説明である。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析は、DNAテンプレートの忠実度と清浄度を評価するための迅速かつ費用対効果の高い方法である。一連のPCR反応(様々なサイズのアンプリコン)が、全てのDNAテンプレートから生成され、正しいサイズの増幅産物について電気泳動で分離される。PCRアンプリコンサイズの範囲は、全てのDNA抽出産物の忠実度に関する情報を提供する。
定量的PCR(qPCR)は、PCRアンプリコンの定量のために二重標識蛍光プローブを使用する。Taqman化学を利用する対立遺伝子識別は、全ての抽出アプローチにわたって採取および抽出された全てのDNAについての特定の遺伝子型を決定するために使用されるであろう。各対象の遺伝子型は、分析されている全ての変数にわたる一致について測定されるであろう。全ての定量的測定は、三重に行われるであろう。
デジタルPCR(dPCR)は、限られた量および/または限られた品質で試料中の遺伝子型を高感度で検出するために採用されている新しい技術である。抽出された全てのDNA試料の絶対感度を決定するために、同じTaqmanアッセイが使用される。dPCRの感度を考えると、分析されている各変異体の最終的な感度を決定することができる。
単一のDNA試料の発見と臨床的分類の両方になると、数十万または数百万のSNPの測定は同時に大きな意味を持つ。感度および特異性の要件は、QPCRに基づく分析とは全く異なり、SNP検出のためのアプローチもまた、この分析アプローチがDNA変異体を同定するためのハイブリダイゼーションに基づくメカニズムを使用するので異なる。異なるDNA抽出化学で処理されたドナー間のコールレートおよびSNPの一致は、重要な分析上の評価項目となる。
この研究では、変異分析のためのゴールドスタンダードが全ての試料にわたって採用される。分析のための標的領域は、他の全ての分析方法にわたって遺伝子型を交差検定するために、QPCR、dPCRおよびマイクロアレイの同じアンプリコンをカバーする。高品質のサンガーベースコール(したがって変異体)を作る能力は、核酸の品質に大きく依存している。このアプローチは臨床分析に定期的に使用される。
本明細書で使用される場合、ハイスループットシーケンスとしても知られる「次世代シーケンス」(NGS)は、非サンガーベースのハイスループットDNAシーケンス技術を指す。NGSを通じて、数百万、さらには数十億のDNA鎖を並行して配列決定することができ、実質的により高いスループットをもたらし、ゲノムのサンガーシーケンスにおいてしばしば使用されるフラグメントクローニング法の必要性を最小にする。NGSは、例えば、パイロシーケンス、合成によるシーケンス、ライゲーションによるシーケンス、イオン半導体シーケンス、および当技術分野で公知の他のものを含む、いくつかの現代のシーケンス技術またはプラットフォームを説明するために使用される包括的な用語である。
一塩基多型のジェノタイピングは、TaqMan(登録商標)OpenArray(登録商標)ジェノタイピングアッセイを使用して行った。TaqMan(登録商標)アッセイは、PCR増幅およびSNPを標的とする一対の蛍光色素検出器を使用した対立遺伝子識別アッセイである。1つの蛍光色素が、第一の対立遺伝子(例えば「A」ヌクレオチド)に完全に一致する検出器に結合され、異なる蛍光色素が第二の対立遺伝子(例えば「C」ヌクレオチド)に完全に一致する検出器に結合される。PCRの間、ポリメラーゼはLife Technologies、Inc.のエンドポイント分析を使用して検出される溶液中に蛍光プローブを放出する。具体的には、OpenArray(登録商標)技術は、少量の液相反応用のナノリットルの流体工学プラットフォームである。OpenArray(登録商標)技術は、3,072個の貫通孔を有する顕微鏡スライドサイズのプレートを使用する。各貫通孔は直径300μm、深さ300μmであり、親水性および疎水性のコーティングで処理される。シングルアッセイ用のTaqMan(登録商標)化学は、各貫通孔にプリロードされ、乾燥される。OpenArrays(登録商標)はLife Technologiesの設計および製造を通じて入手した。Life TechnologiesのTaqman Genotyper v1.0.1ソフトウェアを使用して遺伝子型を決定した。
TaqMan(登録商標)コピー数アッセイ(CYP2D6-Hs00010001_cn)を使用して、薬理遺伝学において評価された十分に特徴付けられたCNVであるCYP2D6遺伝子のコピー数を検出した。TaqMan(登録商標)コピー数アッセイは、TaqMan(登録商標)MGBプローブ化学を使用して、ゲノムDNAターゲットのコピー数を評価する。このアッセイでは、AppliedBiosystems(登録商標)7900 HTリアルタイムPCR機器およびコピー発信者ソフトウェアを使用して、コピー数を決定した。各試料を3回増幅し、コピー数を決定するために標準曲線に対してプロットした。
Ion AmpliSeq(商標)Exome Kitを使用してエキソームライブラリーを調製した。このライブラリーキットを、12のプライマープールにわたって約294,000のプライマーペアを含有する、Ampliseq Exome Panel Primerプールと組み合わせている。次いで、得られた標的アンプリコンを試薬で処理してプライマーを部分的に消化し、アンプリコンをリン酸化する。次いで、アンプリコンをバーコードを用いてイオンアダプターに連結し、精製する。エキソームライブラリー調製の完了時に、精製された、エキソーム富化ライブラリーはリアルタイムPCRにより定量される。次いで、定量化したライブラリーを100pMに希釈し、シーケンス用のテンプレート化されたIon PI(商標)Ion Sphere(商標)Particles(ISP)を調製するために使用する。次いで、試料をIon PI(商標)Chip v3を使用してIon Proton Systemでシーケンスした。Ion Hi-Q Sequencing 200 V2化学を使用して、200塩基対までの平均インサートライブラリーをシーケンスした。
製造者のプロトコルに従ってAffymetrix CytoScan HDアッセイを使用してCMA分析を行った。試料をGenome Analyzer 3000でスキャンした。染色体マイクロアレイを使用して、核型分析よりも高い分解能で染色体異常を検出した。このアッセイは、DNA調製とそれに続くゲノム全体で約270万のCNVを含むCytoScan HDチップへのハイブリダイゼーションからなる。試料をAffymetrix ChASソフトウェアを使用して評価した。
試料中の細菌DNA含有量は、文献に記載されている修正されたプロトコルを使用して決定された。手短に言えば、生成したリアルタイムPCRデータと比較するために、標準曲線を大腸菌の段階希釈を使用して作成した。PCRプライマーは、多種多様な微生物にわたって保存されていることが知られており、真核生物DNAには見られない16S rRNA遺伝子の領域から選択された。コピー発信者ソフトウェアを使用してThermoFisher 7900HT機器でリアルタイムqPCRを使用して、16S rRNA遺伝子の存在についてDNAを試験した。
全ての複製における全ての試料からDNAを首尾よく抽出した。一般に、抽出されたDNAのサイズ(および収率)は高かった。劣化の証拠はわずかしかなかった。試料からの複製物は、収率に関して非常に類似していた。さらに、同じ個人であると仮定されているもの全体の収量も同様に機能した。SNPについての遺伝子型決定は、高品質の結果を生み出し、期待される収率を満たした。1人の個人からの試料、4つの別々に採取された試料は、CNV(n=3)またはNGS(n=1)のQC測定基準を満たしていなかった。総DNAに対する割合としての細菌DNA含有量は、本発明の唾液キットDNA抽出物において比較的低かった。
特定の実施形態(例えば、組成物、キット、方法など)は、本明細書に開示および/または記載された他の実施形態に記載された特徴(例えば、特性、構成要素、成分、要素、部材、部分、工程など)を含む、組み込む、または含み得ることが理解されるであろう。一実施形態の様々な特徴は、本開示の他の実施形態と互換性があり、組み合わせられ、含まれ、および/または組み込まれ得る。したがって、本開示の一実施形態に関連する特定の特徴の開示は、該特徴の特定の実施形態への適用または包含を制限するものとして解釈されるべきではない。むしろ、本開示の範囲から必ずしも逸脱することなく、他の実施形態もまた該特徴を含み得ることが理解されるであろう。さらに、特色がそれと組み合わせて別の特徴を必要とするものとして記載されていない限り、本明細書に記載の任意の特徴は、本明細書に開示の同じかまたは異なる実施形態の任意の他の特色と組み合わせられ得る。
Claims (13)
- 核酸保存組成物であって、
担体と、
20~50%(w/w)のカオトロピック剤と、
1~5%(w/w)の緩衝剤と、
0.05~2.5%(w/w)のキレート剤と、
0.05~2.5%(w/w)の洗浄剤又は界面活性剤と、
5~25%(w/w)のアルコールと、
0.005~0.25%(w/w)の粘液溶解剤又は還元剤と、を含む、組成物。 - 5~19.50%(w/w)の前記アルコールを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記アルコールは、約95%(v/v)のエタノールと約5%(v/v)のイソプロパノールとの混合物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- pH7~9を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- pH7.2~8.8を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カオトロピック剤;前記洗浄剤又は界面活性剤;および前記アルコール以外の、抗菌剤(複数可)、殺菌剤(複数可)、および/又は静菌剤(複数可)を実質的に含まないか、又は欠いている、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カオトロピック剤;前記洗浄剤又は界面活性剤;および前記アルコール以外の、リボヌクレアーゼ阻害剤(複数可)を実質的に含まないか、又は欠いている、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- プロテアーゼ(複数可)を実質的に含まないか、又は欠いている、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カオトロピック剤は、グアニジンイソシアネートである、
前記緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)である、
前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)又はEDTA二ナトリウム(塩)二水和物である、
前記洗浄剤又は界面活性剤は、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(SLS)である、
前記アルコールは、エタノールと、任意付加的にイソプロパノールとである、
前記粘液溶解剤又は還元剤は、N-アセチル-L-システイン(NAC)である、及び
前記担体は、ろ過され、精製され、蒸留され、かつ/又は脱イオンされた水である、のうちの、1又は2以上である、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。 - 39.53%~48.31%(w/w)の前記カオトロピック剤と、
2.39%~2.92%(w/w)の前記緩衝剤と、
0.73%~0.89%(w/w)の前記キレート剤と、
0.251%~0.307%(w/w)の前記洗浄剤又は界面活性剤と、
15.96%~19.50%(w/w)の前記アルコールと、
0.084%~0.102%(w/w)の前記粘液溶解剤又は還元剤と、を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。 - 43.48%~44.36%(w/w)の前記カオトロピック剤と、
2.62%~2.68%(w/w)の前記緩衝剤と、
0.80%~0.82%(w/w)の前記キレート剤と、
0.276%~0.282%(w/w)の前記洗浄剤又は界面活性剤と、
17.55%~17.91%(w/w)の前記アルコールと、
0.092%~0.094%(w/w)の前記粘液溶解剤又は還元剤と、を含む、請求項1又は2に記載の組成物。 - 溶液区画を含む試料採取装置;および、
請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸保存キット。 - 核酸を安定化させる方法であって、
前記核酸を含有する生物学的試料を、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
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